賀峻琳，龔騰芳，謝馨銳，李文超，陳叔玉，李 芬，劉 偉

（湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南 長沙 410128）

裂頭蚴病（Sparganosis）是由迭宮屬絳蟲裂頭蚴引起的人畜共患絳蟲蚴病，迄今為止已報道2 000 多例病例[1]，主要集中在東亞和東南亞[2]。迭宮屬絳蟲在人體內(nèi)一般以原尾蚴或裂頭蚴的形式存在，可導致皮下裂頭蚴病、內(nèi)臟裂頭蚴病、眼裂頭蚴病、腦裂頭蚴病等[1-3]。但在某些情況下，幼蟲可能會在人體腸道內(nèi)發(fā)育成熟，而被誤認為是闊節(jié)裂頭絳蟲病[1]。

猬迭宮絳蟲（Spirometra erinaceieuropaei）的分類學地位一直有較大爭議，目前迭宮屬絳蟲有64 個名義種，但只有4 個種有效[4]。雖然傳統(tǒng)形態(tài)學是鑒定寄生蟲的主要方法，但由于環(huán)境變化和宿主差異，傳統(tǒng)形態(tài)學方法鑒定寄生蟲尤其是形態(tài)相似的蟲株存在一定缺陷。線粒體DNA 具有結(jié)構(gòu)簡單、母系遺傳、進化速度快等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛應用于寄生蟲的鑒定和分類[5-7]。目前國內(nèi)外學者將線粒體全基因組或其cox1、cox3、nad1、nad4、nad5、cytb、rrnS 以及核糖體28S rDNA、18S rDNA、ITS 等基因用于迭宮屬絳蟲種類鑒定和種內(nèi)遺傳變異研究[5,8,9-11]，但國內(nèi)關(guān)于不同宿主猬迭宮絳蟲線粒體基因遺傳變異的研究較少。鑒于此，本研究對采自7種宿主體內(nèi)的猬迭宮絳蟲或中絳期裂頭蚴線粒體pcox1、pcox3和prrnS基因經(jīng)PCR 擴增，通過分析不同宿主來源的pcox1、pcox3 和prrnS 基因序列的同源性、多樣性及不同宿主的猬迭宮絳蟲與其他絳蟲的遺傳進化關(guān)系，為猬迭宮絳蟲分類學和種群遺傳關(guān)系研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來源本實驗的7 株猬迭宮絳蟲或中絳期裂頭蚴樣品中，3 株猬迭宮絳蟲裂頭蚴樣品分別采自湖南省不同地區(qū)的黑眉錦蛇（Elaphe taeniura）、王錦蛇（Elaphe carinata）、烏梢蛇（Ptyas dhumnades）；4 株猬迭宮絳蟲樣品分別采自湖南省長沙市生態(tài)動物園的西伯利亞虎（Panthera tigrisssp.altaica）、白化孟加拉虎（Panthera tigrisssp.tigris）、豹貓（Prionailurus bengalensis）和湖南省長沙市寵物醫(yī)院的家貓小腸內(nèi)，蟲體洗滌后置于70%乙醇于-20 ℃保存。

1.2 主要試劑組織DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；蛋白酶K 購自Merck 公司；TaqDNA 聚合酶及相關(guān)試劑購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 蟲體DNA 的提取將7 株蟲體分別剪成2 cm～3 cm，并用雙蒸水洗滌5 min，重復6次。將洗滌后的蟲體置于1.5 mL 離心管中，加入20 μL 蛋白酶K 混勻，56 ℃恒溫消化1 h～3 h后提取蟲株基因組DNA備用。

1.4 線粒體pcox1、pcox3 和prrnS 基因的PCR 擴增及測序按照參考文獻并由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成3對引物用于pcox1[6]、pcox3[12]和prrnS[7]基因的擴增。以1.3 中提取的7 株猬迭宮絳蟲或裂頭蚴DNA 為模板，采用上述引物經(jīng)PCR 分別擴增pcox1、pcox3 和prrnS 基因。以超純水作為陰性對照。PCR 擴 增 條 件 為：94 ℃5 min； 94 ℃30 s、50 ℃30 s、72 ℃30 s，35 個循環(huán)； 72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物回收純化后由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司雙向測序。

1.5 pcox1、pcox3 和prrnS 基因序列及遺傳進化分析利用DNAStar 5.0 軟件對上述PCR 產(chǎn)物測序并經(jīng)拼接后獲得pcox1、pcox3 和prrnS 基因。將獲得的猬迭宮絳蟲上述3 種基因序列與GenBank 中其他絳蟲相應基因序列利用DNAStar 5.0 軟件進行種內(nèi)及種間比較，分析基因序列的堿基組成和序列同源性。利用DnaSP V6.12 軟件計算各基因序列單倍型數(shù)（H）、核苷酸多樣性（Pi）、單倍型多樣性（Hd）和平均核苷酸差異（K）。利用Mega 7.0 軟件采用Kimura-2-parameter模型，利用鄰接法法（Neighbor-Joining，NJ 法）繪制基于上述3 種基因的猬迭宮絳蟲的遺傳進化樹，自舉檢驗1 000 次。

2 結(jié)果與討論

2.1 pcox1、pcox3 和prrnS 基因的PCR 擴增結(jié)果

以7 株猬迭宮絳蟲或裂頭蚴DNA 為模板PCR 擴增獲得的pcox1、pcox3 和prrnS 基因序列分別約400 bp、350 bp 和300 bp，均與預期片段長度相符，且無非特異性擴增條帶（圖1），表明從不同宿主來源的7株猬迭宮絳蟲或裂頭蚴中均擴增到了各目的基因片段。

圖1 猬迭宮絳蟲pcox1（A）、pcox3（B）和prrnS（C）基因的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR products of S.erinaceieuropaei based on pcox1(A),pcox3(B)and prrnS(C)gene

2.2 pcox1、pcox3 和prrnS 基因測序和序列分析7 株猬迭宮絳蟲或裂頭蚴的pcox1、pcox3 和prrnS 基因測序結(jié)果經(jīng)拼接、比對、校正后，擴增的長度分別為396 bp、362 bp 和280 bp，平均A+T 堿基含量分別為62.10%、66.70%和63.60%。測序獲得的pcox1、pcox3 和prrnS 基因序列已上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫，獲得的基因登錄號分別為MZ774075～MZ774081、MZ783069～MZ783075、MZ783076～MZ783082。

核苷酸序列同源性分析結(jié)果顯示，7 株猬迭宮絳蟲或裂頭蚴的線粒體pcox1、pcox3 和prrnS 基因序列之間的堿基差異率分別為0～2.27%、0～1.10%和0～1.79%，其差異是堿基互換；與不同宿主猬迭宮絳蟲線粒體pcox1、pcox3 和prrnS 基因序列比較后的同源性分別為97.20%～100.00%、98.90%～100.00%和97.90%～100.00%；與其他絳蟲線粒體pcox1、pcox3和prrnS 基因序列同源性分別為66.70%～84.10%、51.70%～72.10%和63.80%～87.10%。上述結(jié)果表明，猬迭宮絳蟲pcox1、pcox3和prrnS基因種間變異大于種內(nèi)變異，因此pcox1、pcox3和prrnS基因均可以作為研究不同宿主來源猬迭宮絳蟲遺傳變異的分子標記。

利用DnaSP軟件分析基因序列的多樣性，結(jié)果顯示7株猬迭宮絳蟲或裂頭蚴pcox1基因的H為4，Hd和Pi分別為0.714±0.181 和0.012 51±0.002 92，K 為4.952；pcox3 基因的H 為2，Hd 和Pi 分別為0.476±0.171 和0.005 26±0.001 89，K 為1.905；prrnS 基因的H為5，Hd 和Pi 分別為0.857±0.137 和0.010 20±0.001 69，K 為2.857。Hd 和Pi 作為兩個重要指標可以衡量一個種群的遺傳變異關(guān)系，其中Pi 具有在生物進化中更為保守的優(yōu)點，是研究生物進化的更優(yōu)指標。在大多數(shù)動物中Pi大于0.01就認為變異較大[13]。本研究中pcox1和prrnS 基因Pi 均大于0.01，變異較大，其中pcox1 基因的Pi 大于prrnS 基因；且堿基差異率也是pcox1＞prrnS＞pcox3。由此推斷，pcox1基因可能更適用于猬迭宮絳蟲的種內(nèi)遺傳多態(tài)性分析，pcox3可能更適合作為猬迭宮絳蟲定種的分子標記。

2.3 pcox1、pcox3 和prrnS 基因的遺傳進化分析以日本血吸蟲（Schistosoma japonicum，NC_002544）為外群，分別基于pcox1（圖2A）、pcox3（圖2B）和prrnS（圖2C）基因構(gòu)建猬迭宮絳蟲的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。3 個進化樹結(jié)果均顯示，7 株不同宿主來源的猬迭宮絳蟲均可與其他猬迭宮絳蟲聚類在同一大分支上，但內(nèi)部存在兩個較小的分支，推測其可能分別對應猬迭宮絳蟲的2 個基因型（但至今并未有基因型系統(tǒng)的分類依據(jù)）。且本研究的7株蟲株均能與其他屬的絳蟲如長膜殼絳蟲（Hymenolepis diminuta，NC_002767）、細粒棘球絳蟲（Echinococcus equinus，AF346403）、牛帶絳蟲（Taenia saginata，NC_009938）和多頭帶絳蟲（Taenia multiceps，F(xiàn)J495086）等明顯的區(qū)分開來（圖2A～圖2C）。表明，pcox1、pcox3 和prrnS 基因均可用于不同宿主來源猬迭宮絳蟲蟲種的鑒定。

圖2 基于pcox1（A）、pcox3（B）和prrnS基因（C）猬迭宮絳蟲的系統(tǒng)發(fā)生樹分析Fig.2 Phylogenetic relationship of S.erinaceieuropaei based on pcox1,pcox3 and prrnS genes,respectively

在猬迭宮絳蟲的分支里，相同宿主的猬迭宮絳蟲或者處于同一發(fā)育階段的猬迭宮絳蟲并未聚為同一分支，而不同宿主或不同發(fā)育階段的猬迭宮絳蟲則聚為同一分支（圖2A～圖2C）。Zhu 等基于cox1 基因進行序列多態(tài)性分析時，發(fā)現(xiàn)在澳大利亞的猬迭宮絳蟲至少存在兩種基因型，兩種基因型分別來自非兩棲宿主（犬、狐貍、貓、虎和蛇）和兩棲宿主（蛙）[14]；Okamoto 等研究發(fā)現(xiàn)從不同國家分離的猬迭宮絳蟲存在不同基因型，且這些基因型不具有地理或宿主特異性[15]；Zhang 等基于cytb、cox1、rrnS、28S rDNA 基因?qū)ξ覈髂? 個區(qū)域蛙源裂頭蚴進行序列多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，中國的兩棲宿主蛙體內(nèi)的猬迭宮絳蟲存在兩種基因型，且在上世紀中期開始分化，并推測這兩種基因型可能是猬迭宮絳蟲和不同氣候環(huán)境下的中間宿主共同進化所導致[8]。本研究系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示猬迭宮絳蟲存在不同基因型，且進一步推測，在不同宿主和不同地區(qū)的猬迭宮絳蟲種內(nèi)存在多種基因型。且相同宿主或相同發(fā)育階段的猬迭宮絳蟲并未聚類在同一分支，在同一分支里也存在不同宿主或不同發(fā)育階段的猬迭宮絳蟲，本研究結(jié)果也提示猬迭宮絳蟲的遺傳進化與其宿主和發(fā)育階段無明顯關(guān)聯(lián)，這與Okamoto 等提出的猬迭宮絳蟲的遺傳進化與其宿主無明顯關(guān)聯(lián)的結(jié)論相符，但Okamoto 并未提及猬迭宮絳蟲的不同基因型是否與蟲株不同的發(fā)育階段有關(guān)聯(lián)，該研究者認為不同宿主的猬迭宮絳蟲屬于同一基因型是由于人類遷移或者經(jīng)濟活動所引起的[15]。推測可能是由于貓、犬等寵物以及西伯利亞虎、孟加拉虎等珍惜動物宿主被人為的遷徙到不同地區(qū)，猬迭宮絳蟲為了適應環(huán)境變化和不同宿主，致使不同基因型的猬迭宮絳蟲可以感染同一宿主，或同一基因型的猬迭宮絳蟲也可以感染不同宿主。

綜上所述，本研究推測在猬迭宮絳蟲中存在至少兩種基因型，且各基因型與猬迭宮絳蟲的宿主及其發(fā)育階段無明顯關(guān)聯(lián)。因此，未來需要更多樣本進一步證明猬迭宮絳蟲的遺傳多樣性。本研究通過對猬迭宮絳蟲的分子流行病學研究，豐富了其宿主譜，并為其群體遺傳研究提供了數(shù)據(jù)支持。