張巖 董萬濤 安文博 張碧峰

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨組織微結(jié)構(gòu)破壞、骨量丟失、骨強(qiáng)度下降為主要特征的全身代謝性骨病，后期極易并發(fā)重要部位骨折[1]。隨著人口結(jié)構(gòu)的改變，OP的患病率逐年上升，截至2020年全球OP的患病人數(shù)已突破10億[2]，OP及脆性骨折是導(dǎo)致老年人群軀體功能障礙和死亡的常見原因，高額的醫(yī)療投入與沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是世界各國在OP防治領(lǐng)域所面臨的重要難題[3]。OP的病理機(jī)制復(fù)雜，主要的發(fā)病機(jī)制是破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞之間的動態(tài)平衡被破壞，骨代謝紊亂，骨吸收作用大于骨形成[4]。目前針對OP的臨床治療方案，主要以促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收，維持骨代謝的正向平衡為主，中藥制劑仙靈骨葆膠囊在OP的防治中療效顯著[6]。p38 MAPK信號通路在維持骨組織的穩(wěn)態(tài)方面具有重要調(diào)控作用，馬茜等[7]研究發(fā)現(xiàn)葛根素能促進(jìn)MC3T3-E1的分化和增殖，并且證實(shí)這與激活p38 MAPK信號通路有關(guān)。本研究通過體外培養(yǎng)MC3T3-E1并用仙靈骨葆膠囊含藥血清干預(yù)，檢測p38 MAPK信號通路相關(guān)蛋白及mRNA 的表達(dá)水平，探討仙靈骨葆膠囊通過p38 MAPK信號通路對MC3T3-E1增殖分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物與細(xì)胞：40只SPF級Wistar大鼠，雌雄各半，體重(180±20) g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號：SCXK(甘)2011-0001；MC3T3-E1細(xì)胞株由武漢普諾賽生命科技有限公司提供(貨號：CL-0387)。

1.1.2藥物與試劑：仙靈骨葆膠囊(貴州同濟(jì)堂制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20025337，規(guī)格0.5 g/粒)；CCK-8試劑盒，日本同仁化工；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、0.25 %胰蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；Runx2、BMP-2，Servicebio；p38、p-p38抗體，Abcam；p38 MAPK通路抑制劑SB203580、ALP試劑盒，天津正濟(jì)科技有限公司。

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱，日本SANYO公司，MCO-18AIC[UV]；低溫高速離心機(jī)、連續(xù)波長酶標(biāo)儀、熒光定量PCR儀，美國Kendro公司，型號分別為041BR109973、Benchmark Plus、C1000；光學(xué)顯微鏡OlymPus公司，IX51。

1.2 方法

1.2.1MC3T3-E1細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：復(fù)蘇原代的 MC3T3-E1，轉(zhuǎn)移至含有10 %胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)為條件37 ℃、5 % CO2、100 %飽和濕度。待細(xì)胞貼壁生長，鋪滿瓶壁80 %～90 %后用0.25 %胰蛋白酶消化，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2大鼠含藥血清制備：將Wistar大鼠分為空白血清組和含藥血清組，每組20只。含藥血清組給予仙靈骨葆膠囊溶液灌胃，具體給藥劑量為1.26 g/kg，每日兩次，連續(xù)1周；空白血清組給予等量生理鹽水灌胃。末次灌胃2 h后，2 %戊巴比妥鈉腹腔注射，麻醉后心臟采血，靜置1 h后以2 800 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，吸取上清液，56 ℃水浴滅活，0.22 μm微孔濾膜除菌后-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3CCK8檢測細(xì)胞增殖活性：取生長狀態(tài)良好的第三代MC3T3-E1，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×104/mL，分為空白對照組、5 %、10 %、15 %、20 %含藥血清組，按每孔200 μL的量接種于96孔板，設(shè)置3個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，吸棄原有培養(yǎng)基，空白對照組加入200 μL完全培養(yǎng)基，其余各組加入200 μL含有相應(yīng)濃度仙靈骨葆膠囊含藥血清的培養(yǎng)基，分別在0、12、24、36、48 h時間節(jié)點(diǎn)加入10 μL的CCK8試劑，測量各組細(xì)胞OD值，設(shè)置波長為450 nm。

1.2.4細(xì)胞ALP活性檢測：將MC3T3-E1接種于6孔板中，根據(jù)上述分組加入相應(yīng)的含藥血清成骨誘導(dǎo)分化后，棄去培養(yǎng)基，刮下細(xì)胞后加入完全培養(yǎng)液，將混懸液移至離心管，2 000 r/min離心5 min，收集底部白色沉淀物。PBS液洗滌待測樣本，超聲破碎后進(jìn)行ALP活性檢測，酶標(biāo)儀波長設(shè)置為520 nm。

1.2.5熒光定量PCR檢測p38、Runx2、BMP-2 mRNA水平：根據(jù)CCK8檢測結(jié)果，將MC3T3-E1分為A、B、C、D 4組。A組：10 %含藥血清組，B組：10 %空白血清組，C組：SB203580+10 %含藥血清組，D組：SB203580+10 %空白血清組，各組細(xì)胞加入相應(yīng)的血清以及SB203580(10 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，按照Trizol法提取總量RNA，-80 ℃保存待用。對RNA的濃度及純度進(jìn)行檢測，按后照反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)cDNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

1.2.6Western blot檢測p38、p-p38、Runx2及BMP-2 蛋白表達(dá)：將以上4組細(xì)胞培養(yǎng)36 h后棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌后加入裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白總濃度，具體步驟均按說明書進(jìn)行。蛋白變性后進(jìn)行電泳分離，先后加入一抗、二抗，滴加ECL工作液于PVDF膜上，待熒光帶明顯后顯影、定影，沖洗膠片，運(yùn)行Image Lab軟件分析蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計方法

對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理使用SPSS 24.0軟件，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用多因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 仙靈骨葆膠囊含藥血清對MC3T3-E1增殖活性的影響

CCK8結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時間的順延，各組細(xì)胞的OD值呈上升趨勢，36 h節(jié)點(diǎn)出現(xiàn)峰值。12 h時，與空白對照組相比，10%濃度含藥血清組的OD值明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，36、48 h時，與空白對照組相比，各含藥血清組OD值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在12、24、36、48 h時間節(jié)點(diǎn)，10 %含藥血清組的OD值明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 不同濃度仙靈骨葆膠囊含藥血清對MC3T3-E1增殖活性的影響Table 1 Effects of conditioned serum of Xianling Gubao capsule at different concentrations on the proliferation activity of MC3T3-E1

2.2 細(xì)胞ALP活性檢測結(jié)果

與空白對照組相比，各含藥血清組ALP活性明顯升高(P<0.05)；其中10%含藥血清組MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性明顯高于其他組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度仙靈骨葆膠囊含藥血清對細(xì)胞ALP活性的影響Table 2 Effects of conditioned serum of Xianling Gubao capsule at different concentrations on ALP activity of

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

顯微鏡下觀察MC3T3-E1形態(tài)可見，細(xì)胞多呈梭形或錐形貼壁生長，A、B組的細(xì)胞密度大于C、D組，但細(xì)胞形態(tài)基本相似，無明顯差異。見圖2。

2.4 各組細(xì)胞p38、Runx2、BMP-2 mRNA比較

如表3所示，A組與其他各組比較，p38、Runx2、BMP-2 mRNA的表達(dá)呈高水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；加入阻斷劑后C組與D組上述基因的表達(dá)水平較A、B組明顯降低(P<0.05)，與C組相比，D組的下降趨勢更為顯著(P<0.05)。

表3 不同組別仙靈骨葆膠囊含藥血清對p38、Runx2、BMP-2 mRNA表達(dá)的影響Table 3 Effects of conditioned serum of Xianling Gubao capsule on the expression of p38, Runx2 and BMP-2 mRNA in different

2.5 各組細(xì)胞p38、p-p38、Runx2、BMP-2蛋白的表達(dá)情況

A組細(xì)胞p38 MAPK信號通路相關(guān)蛋白及Runx2、BMP-2的表達(dá)量明顯高于其他三組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；B組與D組相比，p38、p-p38、Runx2、BMP-2明顯降低(P<0.05)；與C組相比，D組上述指標(biāo)的表達(dá)更低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表4。

表4 各組細(xì)胞p38、p-p38、Runx2、BMP-2 蛋白的表達(dá)量Table 4 Expression of p38, p-p38, Runx2 and BMP-2 proteins in cells of each

3 討論

根據(jù)OP的臨床表現(xiàn)與病變特點(diǎn)，歸屬于中醫(yī)學(xué)“骨痿”“骨枯”“骨極”等范疇[8]。正如《素問·痿論》所言：“腎主一身之骨髓……骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”，又有《千金要方·骨極》曰“骨極者，主腎也……若腎病則骨極，牙齒苦痛……身痹腦髓酸……故曰骨極”[9]。可見，腎中精氣充盛是保證骨骼正常生長、發(fā)育的關(guān)鍵因素，若腎虛精虧，則髓空骨枯，導(dǎo)致OP的發(fā)生[10]。中醫(yī)藥立足于整體觀念與辨證施治體系，在OP的防治中彰顯出“簡、便、驗(yàn)、廉”的獨(dú)特優(yōu)勢[11]。仙靈骨葆膠囊是目前臨床治療OP常用的補(bǔ)腎壯骨類中成藥制劑，療效確切、安全性高，由淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補(bǔ)骨脂、地黃六味藥組成，全方共奏補(bǔ)腎壯骨、通絡(luò)強(qiáng)筋之效。前期藥理學(xué)研究證實(shí)，仙靈骨葆膠囊能夠調(diào)節(jié)骨代謝的正向平衡，促進(jìn)骨的形成與重塑，這一過程涉及多條信號通路以及蛋白分子的調(diào)控[12]。

MAPK是信號刺激從外界傳至細(xì)胞核的關(guān)鍵激酶[13]，p38家族是一組在進(jìn)化上高度保守的MAPK，也屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶。p38 MAPK信號通路在細(xì)胞的生長、分化、凋亡中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，越來越多的證據(jù)表明，與骨代謝相關(guān)的大部分調(diào)節(jié)因子主要通過p38 MAPK途徑起作用[14]，從而維持骨骼的健康，p38 MAPK通路的激活能有效防治OP以及增齡性的骨量流失、骨強(qiáng)度下降。Lu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，低幅度高頻振動在骨組織的合成代謝中具有正向的調(diào)控效應(yīng)，其作用機(jī)制與促進(jìn)體外間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化密切相關(guān)，而p38 MAPK信號通路在低幅度高頻振動誘導(dǎo)的成骨中顯示出重要功能。Liu等[16]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，細(xì)胞松弛素D是一種潛在改善MC3T3細(xì)胞成骨分化的藥物，其主要通過p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)促進(jìn)MC3T3細(xì)胞的增殖分化。陳澤群等[17]也研究發(fā)現(xiàn)，艾塞那肽能夠通過p38 MAPK信號通路抑制棕櫚酸鈉誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的凋亡，并提高細(xì)胞的活力。

本研究結(jié)果表明，不同濃度的仙靈骨葆膠囊含藥血清均能促進(jìn)MC3T3-E1的增殖活性，作用效果呈現(xiàn)濃度和時間的依賴性。其中，10%的含藥血清干預(yù)36 h后最為明顯，能顯著提高ALP的活性。為了驗(yàn)證仙靈骨葆膠囊促進(jìn)MC3T3-E1成骨分化的分子學(xué)機(jī)制，進(jìn)一步檢測了p38 MAPK信號通路相關(guān)的蛋白基因。與空白血清相比，仙靈骨葆膠囊含藥血清能夠明顯上調(diào)p38、Runx2、BMP-2蛋白及mRNA的表達(dá)水平。加入信號通路阻斷劑SB203580后，含藥血清組p38、p-p38、Runx2、BMP-2蛋白及p38、Runx2、BMP-2 mRNA的表達(dá)仍高于空白血清組，說明仙靈骨葆膠囊具有促進(jìn)MC3T3-E1成骨分化的作用，其分子機(jī)制可能與激活p38 MAPK信號通路、上調(diào)成骨相關(guān)因子Runx2、BMP-2的表達(dá)有關(guān)。但仙靈骨葆膠囊在OP的防治中具有多途徑、多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)的作用特點(diǎn)，通過p38 MAPK信號通路調(diào)控骨代謝的正向平衡是治療OP的一個方面，在今后的研究中要借助生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行更加深入、全面的探索，以期揭示其具體的作用機(jī)理。