竇新雨 馬云龍 劉曉光*

1. 北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科,北京 100191

2. 骨與關(guān)節(jié)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)工程研究中心,北京 100191

3. 脊柱疾病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100191

4. 北京大學(xué)第三醫(yī)院疼痛醫(yī)學(xué)中心，北京 100191

1 椎間盤退變及炎癥對(duì)椎間盤退變的影響

1.1 椎間盤退變簡(jiǎn)介

IVD是維系脊柱正常生理活動(dòng)的重要組織結(jié)構(gòu)，主要包括纖維環(huán)(annulus fibrosus，AF)、髓核(nucleus pulposus，NP)和軟骨終板(cartilage endplate，CEP)等重要結(jié)構(gòu)。組織學(xué)上，IVD細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)代謝平衡共同維持著IVD微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，遺傳、衰老、持續(xù)性壓力負(fù)荷等因素會(huì)破壞這種平衡并誘發(fā)IDD[1]，后者也是引起下腰痛(low back pain，LBP)的重要影響因素。組織學(xué)上，IDD特征表現(xiàn)包括固有細(xì)胞數(shù)目減少、ECM降解、炎癥因子浸潤(rùn)、血管與神經(jīng)長(zhǎng)入等。根據(jù)退變情況可將IDD分為早期和晚期，早期IDD無(wú)明顯臨床癥狀，但I(xiàn)VD內(nèi)蛋白多糖(proteoglycan，PG)、糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)及II型膠原蛋白等ECM合成基質(zhì)減少，I型膠原蛋白及IVD降解相關(guān)蛋白酶明顯增加，這些分子的變化常與IDD的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[2]。隨著病程進(jìn)展與加重，IDD晚期表現(xiàn)為ECM退化嚴(yán)重、NP儲(chǔ)水能力丟失及IVD抗應(yīng)力與拉伸強(qiáng)度降低，隨之引發(fā)AF破裂和NP疝出，并壓迫神經(jīng)產(chǎn)生癥狀。

1.2 IDD的病理生理過(guò)程

IVD內(nèi)ECM的過(guò)度破壞，尤其是其中II型膠原蛋白、蛋白聚糖的丟失，導(dǎo)致了IDD的發(fā)生發(fā)展，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin，ADAMTS)為參與ECM降解和IDD的主要的蛋白水解酶，在退行性IVD組織和細(xì)胞中高表達(dá)(如MMP-1、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5、ADAMTS-7等)。

炎癥介質(zhì)過(guò)度產(chǎn)生及炎癥相關(guān)信號(hào)通路活化是IDD發(fā)生與進(jìn)展重要特征之一。IDD組織中?？捎^察到大量衰老、凋亡的細(xì)胞以及多種趨化因子和細(xì)胞因子如干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素(interleukin，IL)如IL-1、2、4、6、8、17等過(guò)度產(chǎn)生，使得更多的免疫細(xì)胞被募集在IVD內(nèi)并增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而觸發(fā)組織退化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)并逐漸加劇IDD[3]。退化IVD因結(jié)構(gòu)完整性喪失為神經(jīng)支配和血管形成創(chuàng)造了有利條件，而炎癥又是加速神經(jīng)及血管向IVD內(nèi)生長(zhǎng)的促進(jìn)因素，并可引起LBP[4]。

IL-1β和TNF-α被認(rèn)為是誘發(fā)IDD過(guò)程中最重要的炎癥因子。研究[5]表明，IL-1β在IDD中表達(dá)顯著增加，并與IDD嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。IL-1β不僅能直接抑制ECM合成，還可刺激其他炎癥介質(zhì)的釋放和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的合成，導(dǎo)致ECM分解代謝增強(qiáng)。TNF-α可誘導(dǎo)IVD產(chǎn)生多種促炎因子，放大IVD中的炎癥反應(yīng)，如通過(guò)使P物質(zhì)水平增加，進(jìn)而誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、IL-8的表達(dá)，或刺激AF細(xì)胞產(chǎn)生IL-17[6]。此外，當(dāng)機(jī)械負(fù)荷增加時(shí)，IVD中TNF-α表達(dá)增加，在動(dòng)態(tài)負(fù)荷下可穿透健康椎間盤，刺激其它促炎因子的產(chǎn)生，加速IVD的退變[7]。核因子kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)是炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵信號(hào)通路，作為Rel蛋白家族的重要成員和一種快速誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，在IDD炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。炎癥因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α等)刺激時(shí)，NF-κB迅速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中并調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。研究[8]發(fā)現(xiàn)，靶向敲除NF-κB可顯著降低脂多糖誘導(dǎo)的NP細(xì)胞凋亡和促炎因子IL-1β與TNF-α的表達(dá)；此外，去乙?；窼IRT1能夠通過(guò)抑制NF-κB通路降低IL-1β誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并減少IVD細(xì)胞凋亡和抑制ECM降解[9]。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是IDD中的另一病生理過(guò)程，隨著退變程度的增加，髓核組織中的活性氧(ROS)增加，部分線粒體功能發(fā)生障礙。Bai等[10]研究發(fā)現(xiàn)ROS可通過(guò)焦亡相關(guān)蛋白NLRP3/ PYCARD途徑誘導(dǎo)NPCs的焦亡，同時(shí)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子核因子(transcription factor nuclear factor, erythroid 2 like 2, Nrf2)和NP細(xì)胞的自噬來(lái)減弱細(xì)胞的焦亡，建立負(fù)調(diào)控。Tang等[11]也證實(shí)過(guò)度氧化應(yīng)激可導(dǎo)致自噬上調(diào)，自噬可視為由自噬相關(guān)蛋白(autophagy-related proteins，ATG)與Keap1-Nrf2-p62反饋環(huán)路激活的抗氧化反應(yīng)。

而在IDD的過(guò)程中，NP細(xì)胞內(nèi)Nrf2的表達(dá)進(jìn)行性下降，在自噬缺陷細(xì)胞中，氧化應(yīng)激反應(yīng)的有害影響增加[11]。越來(lái)越多的研究表明，修復(fù)受損的自噬流可以緩解氧化應(yīng)激的損傷，從而維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，如Kang等[12]通過(guò)使用自噬激活劑姜黃素來(lái)恢復(fù)自噬通量增強(qiáng)自噬，抑制了過(guò)量ROS的產(chǎn)生，修復(fù)了線粒體功能障礙，從而減少了NP細(xì)胞的凋亡、衰老和ECM的降解。Kang團(tuán)隊(duì)[13]利用一種靶向線粒體的抗氧化劑Mitoquinone (MitoQ)，通過(guò)PINK1/ Parkin通路來(lái)調(diào)節(jié)NP細(xì)胞中線粒體動(dòng)力學(xué)、線粒體自噬通量和Nrf2信號(hào)，緩解了線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激，抑制了NP細(xì)胞的凋亡，改善IDD。此外，該團(tuán)隊(duì)還研究了IDD中的CEP細(xì)胞，證明通過(guò)上調(diào)Parkin和Nrf2可以增強(qiáng)CEP細(xì)胞抵御線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和凋亡的能力，保護(hù)退變的IVD[14]。

此外，IVD發(fā)生血管長(zhǎng)入也是IDD的特點(diǎn)之一，隨著IDD的進(jìn)展，IVD內(nèi)血管化程度加重，CEP和AF內(nèi)層的血管長(zhǎng)入通常與組織受損或破壞有關(guān)[15]。

2 褪黑素簡(jiǎn)介

褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色氨酸)是色氨酸代謝產(chǎn)生的一類吲哚類激素，具有親脂和親水性，可穿越血腦屏障，其廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。人類褪黑素主要由松果體產(chǎn)生并分泌入體液(血液為主、唾液等)，其他含線粒體的細(xì)胞如胃腸道細(xì)胞、生殖細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞等)也可合成。血液中90 %的褪黑素通過(guò)肝臟代謝，也可在視網(wǎng)膜、胃腸道、皮膚等的外周器官中快速代謝[16-17]，主要代謝產(chǎn)物為6-羥基褪黑素硫酸鹽(6-hMS)，其經(jīng)尿液排泄，完全清除需1～2 h。生理?xiàng)l件下，褪黑素分泌受光照及晝夜節(jié)律的影響，460～480 nm波長(zhǎng)的藍(lán)光能夠顯著抑制其分泌，而分泌高峰在凌晨2～4時(shí)[18]。此外，褪黑素的分泌還受藥物的影響，非甾體類抗炎藥物(布洛芬、吲哚美辛)、抗抑郁藥物(氟伏沙明)及高劑量苯二氮卓類鎮(zhèn)靜藥等長(zhǎng)期使用均可抑制褪黑素分泌。褪黑素功能廣泛，具有顯著抗炎及抗氧化作用，在睡眠與晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)、神經(jīng)心血管與免疫系統(tǒng)保護(hù)、組織缺血再灌注損傷與細(xì)胞衰老以及抗腫瘤等生理和病理學(xué)方面的作用均有報(bào)道[19]。

3 褪黑素的抗炎和抗氧化作用

褪黑素被認(rèn)為是免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)劑，其抗炎特性及在免疫感受性細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)生已被廣泛報(bào)道，這表明褪黑素可以改善炎癥相關(guān)性疾病的臨床病程。褪黑素的抗炎和抗氧化作用對(duì)于多種退行性疾病具有潛在治療價(jià)值。褪黑素能夠誘導(dǎo)Th2淋巴細(xì)胞活化并產(chǎn)生IL-4和IL-10等抗炎因子，后者又可抑制Th1淋巴細(xì)胞的促炎功能，糾正炎癥狀態(tài)下Th1/Th2的失衡狀態(tài)從而降低促炎因子水平[20]。褪黑素能夠通過(guò)上調(diào)SIRT-1表達(dá)，結(jié)合并抑制NF-kB信號(hào)通路，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，阻止其向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，抑制細(xì)胞因子、環(huán)氧化酶、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和粘附分子的合成[21]。褪黑素的自分泌作用能夠使巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變以抗炎功能為主的M2樣表型。

褪黑素是一種天然有效的抗氧化劑，富含電子的芳香系統(tǒng)及由氧甲基和氮乙?；鶜埢a(chǎn)生的化合物兩親性被認(rèn)為是其抗氧化功能的分子基礎(chǔ)[22]。褪黑素可通過(guò)激活多種抗氧化酶活性(如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶)和直接中和活性氧自由基來(lái)降低氧化應(yīng)激，抑制具有過(guò)氧化作用的多不飽和脂肪酸并穩(wěn)定生物膜。研究[23]發(fā)現(xiàn)，褪黑素還能刺激其他抗氧化劑合成的能力，褪黑素能夠誘導(dǎo)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表達(dá)，后者是谷胱甘肽合成的限速酶。褪黑素還可以提高線粒體電子傳遞效率，減少自由基的產(chǎn)生；在嚴(yán)重氧化應(yīng)激下，其通過(guò)酶降解或自由基相互作用，產(chǎn)生許多具有抗氧化作用的代謝物并觸發(fā)自由基清除級(jí)聯(lián)反應(yīng)，因此，其在小劑量下也非常有效[22]。

4 褪黑素的抗骨質(zhì)疏松作用

OP是由多種原因?qū)е碌墓敲芏?bone mineral density, BMD)和骨質(zhì)量下降，骨微結(jié)構(gòu)破壞，造成骨脆性增加，易發(fā)生骨折的全身性骨病。Lou等[24]通過(guò)對(duì)比絕經(jīng)與IDD的關(guān)系，表明絕經(jīng)后女性因體內(nèi)雌激素水平大幅下降，從而導(dǎo)致BMD 迅速下降，同時(shí)比同齡男性患有更為嚴(yán)重的IDD。徐浩偉等[25]對(duì)OP與LDD相關(guān)性的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，指出BMD與LDD的關(guān)系尚不明確，研究其相關(guān)性時(shí)可能受到許多潛在因素的影響，猜想BMD與LDD在特殊人群中存在相互關(guān)系，在臨床治療DDD時(shí)，不應(yīng)忽視OP與IDD可能存在的相互作用。褪黑素可以影響骨代謝，對(duì)治療OP有一定的效果，已有多項(xiàng)研究表明，褪黑素具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化增殖、抑制破骨細(xì)胞產(chǎn)生活化的作用，如褪黑素通過(guò)增加骨鈣素( osteocalcin，OCN) 的表達(dá)來(lái)促進(jìn)骨生成[26]，通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路從而抑制破骨細(xì)胞生成[27]。前文提到的IDD中重要的炎癥因子TNF-α通過(guò)促進(jìn)骨質(zhì)吸收、抑制新骨形成而加速OP進(jìn)程，因此，褪黑素的抗炎作用也有利于治療OP。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[27]表明，用添加褪黑素飲用水喂養(yǎng)雌性小鼠一年后，小鼠血清中的pErk1 /2、pErk5、Runx2和OPG以及RANKL水平增加，提示褪黑素能發(fā)揮骨增強(qiáng)作用。王旭東等[28]總結(jié)了褪黑素防治OP的研究現(xiàn)狀，表明褪黑素在細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面，具有防治OP的應(yīng)用潛能。由此可以猜想，褪黑素也可能通過(guò)對(duì)OP的治療作用來(lái)改善IDD。

5 褪黑素對(duì)IVD的保護(hù)作用

有關(guān)褪黑素在IDD中的調(diào)節(jié)作用最初由Turgut等[29]于2003年報(bào)道，發(fā)現(xiàn)褪黑素在體內(nèi)能夠影響退變IVD軟骨終板的骨生長(zhǎng)和血管分布。該團(tuán)隊(duì)后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)3天齡Hybro Broiler雞行手術(shù)切除松果體建立褪黑素缺乏模型，養(yǎng)殖至8周齡評(píng)估IVD退變情況，結(jié)果顯示IVD在核磁上呈現(xiàn)典型的退變表現(xiàn)，而且組織學(xué)上與IVD退變密切相關(guān)的羥基脯氨酸(hydroxyproline，HP)含量也出現(xiàn)明顯升高[30]。臨床上發(fā)現(xiàn)[31]，不同年齡段椎間盤突出患者血清中褪黑素水平與IDD密切相關(guān)，IDD發(fā)生率呈年齡依賴性增加，而且年齡與褪黑素水平呈負(fù)相關(guān)、與HP含量呈正相關(guān)。該團(tuán)隊(duì)[32]進(jìn)一步在IDD動(dòng)物模型中觀察到外源性褪黑素應(yīng)用能夠引起原本退變間盤相鄰椎體骨小梁寬度減小及多核軟骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1表達(dá)增高的情況發(fā)生逆轉(zhuǎn)，且用藥后IVD大體形態(tài)也趨于正常。Li等[33]首次報(bào)道人類IVD組織和NP細(xì)胞中存在褪黑素膜受體MT1和MT2的表達(dá)，從2例腰椎間盤突出患者采集的IVD組織及NP細(xì)胞中檢測(cè)到MT1和MT2表達(dá)的存在；體外觀察發(fā)現(xiàn)，褪黑素治療能夠呈劑量依賴性地增強(qiáng)退變IVD中NP細(xì)胞的增殖能力，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1、增殖細(xì)胞核抗原、MMP-3和MMP-9的表達(dá)，上調(diào)II型膠原α1鏈和蛋白聚糖水平，且這些作用能被非特異性褪黑素受體拮抗劑Luzindole逆轉(zhuǎn)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素的前述作用是通過(guò)與細(xì)胞膜受體MT1和MT2結(jié)合，降低磷脂酰肌醇3激酶p85調(diào)節(jié)亞基、磷脂酰肌醇依賴性激酶1和蘇氨酸激酶(Akt)的磷酸化實(shí)現(xiàn)。

既往研究顯示，氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡與自噬等病生理過(guò)程在IDD發(fā)展中具有重要作用。He等[34]報(bào)道，氧化應(yīng)激狀態(tài)下褪黑素能夠在體外增強(qiáng)NP細(xì)胞的細(xì)胞活力，降低氧化分子活性氧自由基和丙二醛的水平，并增強(qiáng)還原分子還原型谷胱甘肽和超氧化物歧化酶活性，這表明褪黑素可能通過(guò)改善IDD中的氧化應(yīng)激狀態(tài)來(lái)恢復(fù)內(nèi)環(huán)境平衡，從而發(fā)揮IVD修復(fù)作用。筆者前期研究[35]發(fā)現(xiàn)，體外應(yīng)用褪黑素能夠誘導(dǎo)AF細(xì)胞的自噬過(guò)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡；其潛在分子機(jī)制是通過(guò)抑制miR-106a-5p的表達(dá)，降低其與ATG7的3’UTR結(jié)合，解除miR-106a-5p對(duì)ATG7的抑制，從而增強(qiáng)ATG7的翻譯和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。Zhang等[36]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以提高II型膠原蛋白及PG的表達(dá)水平，同時(shí)下調(diào)MMP-3水平來(lái)抑制由IL-1β誘導(dǎo)的NP細(xì)胞及ECM重塑；對(duì)IDD動(dòng)物模型進(jìn)行腹腔注射褪黑素后還可觀察到IVD結(jié)構(gòu)完整性得以保護(hù)、組織內(nèi)炎癥程度明顯減輕。Shen等[37]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素能夠誘導(dǎo)NP細(xì)胞中ECM相關(guān)分子表達(dá)并抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的管形成和細(xì)胞遷移，可能通過(guò)抑制IDD發(fā)生過(guò)程中的血管長(zhǎng)入過(guò)程。Zhang等[38]探索了褪黑素對(duì)軟骨終板細(xì)胞凋亡和鈣化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)褪黑素以劑量依賴方式降低了細(xì)胞凋亡并抑制軟骨終板細(xì)胞鈣化，這可能通過(guò)上調(diào)SIRT1表達(dá)和活性，促進(jìn)細(xì)胞自噬有關(guān)。Chen等[39]研究也證實(shí)褪黑素一方面能夠降低由叔丁基過(guò)氧化氫所致NP細(xì)胞凋亡的總凋亡率，以劑量依賴性和時(shí)間依賴性的激活線粒體自噬及其上游調(diào)節(jié)因子Parkin的表達(dá)，且該過(guò)程能被線粒體自噬抑制劑環(huán)孢素A部分消除，提示褪黑素對(duì)退變IVD細(xì)胞保護(hù)作用為線粒體自噬依賴性；另一方面，褪黑素還可上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)中基質(zhì)合成分子II型膠原、PG和Sox-9的表達(dá)，并抑制基質(zhì)降解分子MMP-13和ADAMTS-5的表達(dá)。Tian等[40]進(jìn)行的病例對(duì)照研究表明，IDD患者血漿褪黑素濃度明顯降低，較低的血漿褪黑激素水平與較長(zhǎng)的疾病持續(xù)時(shí)間、較高的疾病嚴(yán)重程度和較高的炎癥細(xì)胞因子水平相關(guān)，血漿褪黑素可作為IDD的診斷標(biāo)志物。

6 總結(jié)與展望

綜上所述，IDD是IVD的持續(xù)、復(fù)雜的退變過(guò)程，炎癥因子及相關(guān)信號(hào)通路在該過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，骨質(zhì)疏松也可能加速此過(guò)程。褪黑素具有明確的抗炎及抗氧化作用，可改善炎癥病程，清除自由基、降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，應(yīng)用于多種疾病的治療。多項(xiàng)研究表明褪黑素對(duì)IVD具有保護(hù)作用，對(duì)抗骨質(zhì)疏松也有一定作用。筆者認(rèn)為，褪黑素在椎間盤退變修復(fù)領(lǐng)域的研究空間仍較大，針對(duì)褪黑素最佳劑量選擇、安全性驗(yàn)證及其參與介導(dǎo)的炎癥相關(guān)分子機(jī)制等方面仍需展開(kāi)進(jìn)一步的探索，這可能為IDD的早期藥物干預(yù)與修復(fù)治療提供新的思路。