滿姍姍，劉海朝，王 麗，邊育紅*

（1.天津市第二人民醫(yī)院藥劑科/天津市肝病研究所，天津 300192；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津301617）

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們生活、工作方式和飲食結(jié)構(gòu)也發(fā)生了巨大的改變。腸易激綜合征（IBS）是功能性胃腸道疾病中最常見的一種類型，其發(fā)生發(fā)展由多種因素共同引起。越來越多的證據(jù)表明，慢性精神應(yīng)激是引起IBS發(fā)病的主要原因之一。在研究報(bào)告中顯示，IBS患者常伴有焦慮、抑郁、精神障礙等不同程度的心理異常。慢性反復(fù)發(fā)作的IBS患者受內(nèi)外環(huán)境刺激所產(chǎn)生的內(nèi)臟感覺也能通過腸神經(jīng)系統(tǒng)上行傳導(dǎo)至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感知、情緒和行為，主要表現(xiàn)為焦慮、抑郁。抑郁癥是一種慢性反復(fù)發(fā)作的精神障礙性疾病，情緒的變化導(dǎo)致患者相關(guān)胃腸道神經(jīng)調(diào)節(jié)功能發(fā)生異常，而這些胃腸癥狀又會(huì)加重患者的焦慮抑郁情緒。IBS和抑郁癥共病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及工作效率［1-4］。

痛瀉要方出自《丹溪心法》，由陳皮、白術(shù)、白芍、防風(fēng)4味中藥組成，具有調(diào)和肝脾、補(bǔ)脾柔肝、祛濕止瀉的功效?，F(xiàn)代研究表明，痛瀉要方加味能夠顯著改善抑郁癥患者服用SSRI引起的腹瀉癥狀［5-6］，這從理論上解釋了可以用異病同治的方法在臨床上用痛瀉要方治療IBS和抑郁癥。但痛瀉要方治療IBS和抑郁癥異病同治的作用機(jī)制并不明確，而中藥復(fù)方又具有多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，故本研究采用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)痛瀉要方治療IBS和抑郁癥異病同治的作用機(jī)制進(jìn)行探討，為其深入研究及擴(kuò)大臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 方法

1.1 痛瀉要方4味中藥化學(xué)成分與靶點(diǎn)的獲取 首先應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析數(shù)據(jù)庫（TCMSP）、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索痛瀉要方的4味中藥：白術(shù)、防風(fēng)、陳皮、白芍的所有化學(xué)成分，并通過文獻(xiàn)挖掘進(jìn)行查漏補(bǔ)缺。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫中藥物動(dòng)力學(xué)（ADME）參數(shù)，設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%，同時(shí)滿足類藥性指數(shù)（DL）≥0.18等閾值獲取所需活性化合物［7-9］。然后將數(shù)據(jù)庫中所篩選化合物的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行保存，并將所有靶點(diǎn)全稱導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫，物種設(shè)置為“human”，獲取蛋白靶點(diǎn)的縮略名詞，最后將中藥、化合物及靶點(diǎn)縮略名詞信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，從而可獲得“中藥-化合物-靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)信息圖，以直觀了解痛瀉要方4味中藥及其化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)信息。

1.2 痛瀉要方異病同治IBS和抑郁癥的共有靶點(diǎn)獲取 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫及CTD數(shù)據(jù)庫，分別搜集IBS和抑郁癥的相關(guān)疾病靶點(diǎn)，并將痛瀉要方作用靶點(diǎn)、IBS相關(guān)靶點(diǎn)及抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行取交集處理，所得交集靶點(diǎn)即痛瀉要方異病同治IBS和抑郁癥的共有靶點(diǎn)，最后將痛瀉要方、共有靶點(diǎn)及疾病信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，從而可獲得“痛瀉要方-共有靶點(diǎn)-疾?。↖BS、抑郁癥）”交聯(lián)信息圖，以直觀了解痛瀉要方異病同治IBS和抑郁癥的靶點(diǎn)信息。

1.3 痛瀉要方異病同治IBS和抑郁癥的關(guān)鍵共有靶點(diǎn)篩選及分析 將痛瀉要方、IBS和抑郁癥的共有靶點(diǎn)信息導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫，設(shè)置combined score＞0.4，以獲取共有靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)間相互作用關(guān)系［10］。將蛋白互作信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，并利用Network Analyzer工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，選取度值大于中位數(shù)的靶點(diǎn)作為痛瀉要方異病同治IBS和抑郁癥的關(guān)鍵共有靶點(diǎn)。

1.4 基因功能與基因通路富集分析 將上述實(shí)驗(yàn)獲得的關(guān)鍵共有靶點(diǎn)上傳至DAVID，參數(shù)設(shè)置為Homo sapiens，進(jìn)行GO功能富集分析以及KEGG信號(hào)通路富集分析，并對(duì)KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 痛瀉要方化學(xué)成分及靶點(diǎn)的獲取 將方中4味中藥：白術(shù)、防風(fēng)、陳皮、白芍上傳至TCMSP和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫，按照OB≥30%且DL≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)篩選，共得到陳皮5個(gè)、白術(shù)7個(gè)、白芍13個(gè)、防風(fēng)18個(gè)活性化合物，刪除重復(fù)項(xiàng)后共獲得40個(gè)活性化合物，結(jié)果見表1。

表1 痛瀉要方中40個(gè)活性成分表

2.2 單味藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cytoscape 3.7.2軟件，導(dǎo)入痛瀉要方4個(gè)單味藥、40個(gè)成分和139個(gè)靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)信息，得到單味藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。如圖1所示，共涉及173個(gè)節(jié)點(diǎn)，454條邊。節(jié)點(diǎn)表示單味藥、成分或者靶點(diǎn)，邊表示單味藥、成分、靶點(diǎn)彼此之間的關(guān)聯(lián)。其中，圓形節(jié)點(diǎn)表示單味藥；六邊形節(jié)點(diǎn)表示化學(xué)成分（A1為白芍和防風(fēng)共有化學(xué)成分，A2為白芍、防風(fēng)和陳皮共有化學(xué)成分）；菱形節(jié)點(diǎn)表示痛瀉要方4味藥對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)（139個(gè)）。

圖1 痛瀉要方治療腸易激綜合征和抑郁癥單味藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 痛瀉要方治療IBS和抑郁癥的共有靶點(diǎn)獲取 通過Gene Cards、OMIM、TTD及CTD等數(shù)據(jù)庫搜集IBS、抑郁癥相關(guān)疾病靶點(diǎn)，去重后獲得IBS疾病靶點(diǎn)共3 554個(gè)，抑郁癥12 610個(gè)，將以上2組疾病靶點(diǎn)與痛瀉要方139個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行取交集，通過Venny2.1進(jìn)行在線Venn圖可視化，結(jié)果見圖2?？梢娙吖灿邪悬c(diǎn)有104個(gè)，具體如下：XDH、SOD2、MAOA、CDK1、CYP1A1、CHRM1、GSTP1、ADRA1A、LDLR、CCNA2、GSR、CREB1、PGR、CHRM3、SLC6A2、PON1、CHEK1、SELE、MAPK14、PLA2G4A、ACHE、CASP3、NOS3、UGT1A1、FN1、CHRNA2、NR1I3、TNF、PTGS2、ESR1、STAT1、GABRA1、MAPK1、IKBKB、MAPK8、DPEP1、CASP9、CAT、ABCC1、EPHB2、DRD1、SLC6A4、KCNH2、APOB、PPARG、CXCL8、SLPI、ADRB2、ICAM1、MAPK3、CA2、OPRM1、PRKCA、SCN5A、ADIPOQ、NOS2、BCL2、F7、AHR、CYP19A1、GSK3B、MMP1、CDK2、CDKN1A、CHRNA7、PRKCD、MCL1、IL6、CD163、CYP1A2、PIK3CG、RELA、INSR、AKT1、JUN、AR、CYP3A4、PRSS1、CCND1、TGFB1、TIMP1、CD14、HMGCR、NR3C2、HMOX1、GSTM1、TP53、HTR2A、ESR2、CYP1B1、ALOX5、FASN、DPP4、LBP、CASP8、ADRA1B、BAD、CCL2、KDR、PPARA、VCAM1、PTGS1、BAX、MMP9，導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫，以combined score＞0.4為篩查標(biāo)準(zhǔn)［9-11］，得出共有靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)間相互作用關(guān)系，將篩選后的信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2繪制蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，根?jù)度值大于中位數(shù)（中位數(shù)=21）篩選出關(guān)鍵共有靶點(diǎn)50個(gè)，并將關(guān)鍵蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，結(jié)果見圖3。

圖2 痛瀉要方、腸易激綜合征、抑郁癥靶點(diǎn)交集Venn圖

2.4 GO功能富集和KEGG通路富集分析 將上述獲得的關(guān)鍵共有靶點(diǎn)上傳至DAVID，參數(shù)設(shè)置為Homo sapiens，進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集，共獲得生物過程（BP）350個(gè)，主要涉及對(duì)藥物的反應(yīng)（response to drug）、老化（aging）、缺氧反應(yīng)（response to hypoxia）、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路（lipopolysaccharide-mediated signaling pathway）、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、DNA模板（positive regulation of transcription，DNA-templated）、細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)化合物的反應(yīng)（cellular response to organic compounds）等；細(xì)胞組成（cellular component，CC）39個(gè)，主要涉及小窩（caveola）、細(xì)胞質(zhì)（cytosol）、細(xì)胞外間隙（extracellular space）、核質(zhì)（nucleoplasm）、細(xì)胞核（nucleus）、線粒體（mitocho ndrion）等；分子功能（molecular function，MF）77個(gè)，主要涉及酶結(jié)合（enzyme binding）、相同蛋白質(zhì)結(jié)合（i dentical protein binding）、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding）、血紅素結(jié)合（heme binding）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合（transcription regulatory region DNA binding）等，根據(jù)P值大小排名前10的結(jié)果見圖4。

圖4 GO功能富集分析

通過DAVID進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析獲得92條信號(hào)通路，根據(jù)P值排序靠前的通路主要涉及TNF、Toll-like receptor、NOD-like receptor、Prolactin、FoxO和PI3K-Akt等信號(hào)通路，主要與氧化應(yīng)激、免疫調(diào)控、炎癥、凋亡以及內(nèi)分泌代謝相關(guān)，采用Omicshare對(duì)前20條KEGG信號(hào)通路進(jìn)行富集分析結(jié)果的可視化，結(jié)果見圖5。

圖5 KEGG信號(hào)通路富集分析（前20）

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，IBS發(fā)病與脾胃運(yùn)化失常、肝郁氣滯、濕熱內(nèi)蘊(yùn)密切相關(guān)；抑郁癥更多的被納入“郁證”，其發(fā)病主要與情志不遂、肝氣郁結(jié)相關(guān)。肝氣不通則痛，肝失疏泄，必使脾運(yùn)失健，腸道分清泌濁功能紊亂。所以說肝郁脾虛、肝脾不和為共同病機(jī)［12-14］。痛瀉要方中的白術(shù)苦甘而溫，補(bǔ)脾燥濕以治土虛，是為君藥；白芍酸寒，醒脾和胃，為臣藥；配伍少量防風(fēng)，具升散之性，與術(shù)、芍相伍，辛能散肝郁，香能舒脾氣，且有勝濕以助止瀉之功，又為脾經(jīng)引經(jīng)之藥，故兼具佐使之用。四藥相合，可以補(bǔ)脾勝濕而止瀉，柔肝理氣而止痛，使脾健肝和，痛瀉自止［15］。盧璐等［16］的研究表明，IBS-D患者普遍存在焦慮、抑郁的心理問題，加味痛瀉要方既能明顯改善患者的腹痛、腹瀉癥狀，又能有效改善患者的心理狀態(tài)。賴金枚等［17］的研究表明，加味痛瀉要方通過干預(yù)腦-腸軸改善IBS-D伴焦慮狀態(tài)患者的臨床癥狀。因此，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)痛瀉要方異病同治IBS和抑郁癥的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

3.1 痛瀉要方各組成中藥的活性成分 本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討痛瀉要方對(duì)IBS和抑郁癥異病同治的作用機(jī)制，共篩選出40個(gè)活性化合物，主要包括柚皮素、芍藥苷、白術(shù)三醇、蒼術(shù)內(nèi)脂、黃芩素、前胡素、歐前胡素、防風(fēng)色原酮、谷甾醇、5-O-甲基維斯阿米醇等，涉及黃酮類、內(nèi)酯類、苷類等幾大類。實(shí)驗(yàn)證明，一方面，芍藥苷可通過升高Caco-2細(xì)胞中核因子抑制蛋白-κBα（IκBα）的表達(dá)，發(fā)揮緩解IBS癥狀的作用；另一方面，芍藥苷還能通過抑制CASP-11/GSDMD通路實(shí)現(xiàn)抗抑郁的作用［18-19］。歐前胡素可明顯改善PS♂子代抑郁樣行為，具有抗抑郁作用，其機(jī)制可能與升高5-HT濃度及5-HT1AR mRNA的表達(dá)，降低5-HTT mRNA的表達(dá)有關(guān)［20］。

3.2 痛瀉要方異病同治關(guān)鍵共有靶點(diǎn)的作用分析 本研究通過網(wǎng)絡(luò)分析獲得共有靶點(diǎn)104個(gè)，其中關(guān)鍵共有靶點(diǎn)50個(gè)，主要有IL6、AKT1、PTGS2、JUN、TNF、TP53、CASP3、MAPK3、MAPK1、MMP9等。IL6作為關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，是一種促炎細(xì)胞因子，由單核巨噬細(xì)胞、Th2細(xì)胞產(chǎn)生，在炎癥和B細(xì)胞成熟過程中可分泌入血清，介導(dǎo)IL6受體α誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，參與到免疫、炎癥的調(diào)節(jié)。研究證明，IBS患者的白介素水平在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用，其IL6的水平明顯高于對(duì)照組；而通常被認(rèn)為是“致抑郁”的IL6依據(jù)其濃度和與其他炎癥細(xì)胞因子的組合情況，可以發(fā)揮促進(jìn)和抗炎（潛在的抗抑郁）特性［21-22］。腫瘤壞死因子（TNF）中的TNF-α是與免疫相關(guān)的重要炎癥因子，不僅在炎癥免疫方面發(fā)揮著重要作用，同時(shí)還可調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性傳遞、介導(dǎo)神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性過程［23-24］。IL6與TNF二者可以發(fā)揮協(xié)同作用［25］。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白酶，參與細(xì)胞生長、有絲分裂、發(fā)育、分化和凋亡等相關(guān)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、應(yīng)激適應(yīng)等多種重要的生理病理過程［26-27］。AKT是屬于AGC家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶，AKT1是三種同工酶（AKT1、AKT2、AKT3）之一，這些同工酶具有高度的序列同一性和部分重疊的底物特異性。在功能上，AKT通過磷脂酰肌醇-3激活一系列下游底物的絲氨酸和/或蘇氨酸磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、DNA修復(fù)和合成代謝過程［28-31］。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）又被稱為環(huán)氧合酶2，是生物體內(nèi)PG合成的關(guān)鍵酶，在炎癥條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生，參與內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抗凋亡過程。實(shí)驗(yàn)證明，IBS-D患者的結(jié)腸活檢顯示PGE2水平升高，其作用機(jī)制可能與結(jié)腸肥大細(xì)胞異常合成PGE2可能誘發(fā)IBS-D患者的內(nèi)臟超敏反應(yīng)有關(guān)；而COX-2/PGE2活性的增強(qiáng)，有效地誘導(dǎo)了抑郁癥的核心癥狀［32-33］。胱天蛋白酶3（CASP3）是半胱氨酸蛋白酶家的主要亞科之一，在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用［34］。

3.3 痛瀉要方異病同治關(guān)鍵靶點(diǎn)的功能富集和通路分析 通過DAVID對(duì)關(guān)鍵共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)痛瀉要方治療IBS和抑郁癥中的生物過程主要涉及TNF、Toll-like receptor、NOD-like receptor、Prolactin、FoxO和PI3K-AKT等信號(hào)通路。TNF信號(hào)通路對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長、分化、凋亡及誘發(fā)炎癥均發(fā)揮了較強(qiáng)的效應(yīng)，在炎性腸病中，TNF可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的發(fā)生［35-36］。TLR/NLR通路與機(jī)體中先天性免疫和炎癥密切相關(guān)，其中TLR可同時(shí)識(shí)別細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)刺激，NLR可識(shí)別胞漿內(nèi)刺激。TLRs是介導(dǎo)天然免疫防御體系中重要識(shí)別受體之一，在介導(dǎo)機(jī)體的炎癥反應(yīng)及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)中扮演著關(guān)鍵的作用。在TLRs家族中TLR2/4因?yàn)榕c消化系統(tǒng)疾病發(fā)生和防御有著密切的關(guān)系而被廣泛研究，并且有研究表明TLR2/4之間的相互協(xié)同作用是介導(dǎo)炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答效應(yīng)的基礎(chǔ)；大鼠的抑郁樣行為可以通過抑制下游炎性因子釋放從而降低模型大鼠海馬中TLR/NLR通路相關(guān)蛋白表達(dá)量改善［37-38］。FoxO轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)各種下游靶基因，包括參與細(xì)胞分化、生長、存活，細(xì)胞周期，葡萄糖和脂質(zhì)代謝，應(yīng)激以及活性氧（ROS）解毒的基因。磷脂酰肌醇3-激酶（P13K）和絲氨酸蘇氨酸激酶AKT/PKB（AKT）通路通過磷酸化調(diào)節(jié)FoxO。AKT介導(dǎo)的FoxO磷酸化通過促進(jìn)其與14-3-3蛋白及其核出口的相互作用以及通過誘導(dǎo)其通過蛋白酶體降解來抑制FoxO的活性［39-41］。

4 結(jié)語

通過上述中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測發(fā)現(xiàn)，痛瀉要方治療IBS和抑郁癥的可能共有信號(hào)通路與氧化應(yīng)激、免疫調(diào)控、炎癥、凋亡以及內(nèi)分泌代謝相關(guān)，這與目前研究的IBS、抑郁癥的作用機(jī)制具有一致性，這表明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果具有一定的可靠性和準(zhǔn)確性，但是需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；該研究為痛瀉要方作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供參考，也為臨床上的合理用藥提供依據(jù)。