劉 菁，吳 燕

（天津市藥品檢驗研究院，天津 300070）

目前，高效液相色譜法（HPLC）已成為制藥研發(fā)、環(huán)境檢測、化工化學、食品分析等多個領域應用最普遍的分析技術。檢測器作為高效液相色譜的重要組成部分，其類型和性能決定被測化合物的響應值和干擾情況，是色譜方法建立初期應考慮的關鍵問題。近年來，電噴霧檢測器（CAD）作為一種新型通用型檢測器在多個檢測分析領域的應用越來越廣泛，應用CAD檢測器進行藥物分析檢測的液相色譜法已被國外藥典收載。例如《英國藥典》2021年版（BP 2021）［1］和《美國藥典》2021年版（USP 2021）［2］均采用CAD檢測器對造影劑釓布醇的有關物質進行考查，同時USP43/NF38［3］中脫氧膽酸的含量測定也采用CAD檢測器進行。現行的《中國藥典》2020年版［4］首次在通則高效液相色譜法中提及CAD檢測器并進行了簡要介紹。本文在介紹CAD檢測器原理、特點、優(yōu)勢的基礎上，結合近年來國內外發(fā)表的相關文獻，對CAD檢測器在藥物分析領域的應用成果作以總結，為無紫外吸收或弱紫外吸收物質的檢驗檢測提供參考。

1 CAD檢測器工作原理及特點優(yōu)勢

1.1 工作原理 當CAD檢測器與HPLC聯用時，HPLC洗脫液經與CAD檢測器的霧化器中氮氣碰撞而霧化，含有分析物的較小液滴在室溫下干燥形成溶質顆粒，與帶電氮氣碰撞，使得分析物顆粒表面帶上正電荷，經過帶有低負電壓的離子阱裝置去除遷移率大的多余帶電氮氣，遷移率小的帶電分析物顆粒把其電荷轉移給一個顆粒收集器，最后通過一個高靈敏度的靜電檢測計測量分析物的電荷量并形成電信號，該信號強度與溶質質量成正比［5］。CAD檢測器原理圖見圖1［6］。

圖1 CAD檢測器原理圖

1.2 特點及優(yōu)勢 CAD檢測器作為一種通用型檢測器，適用范圍廣、靈敏度高、穩(wěn)定性強、操作簡便。相對于紫外及二極管陣列檢測器（UV&DAD），CAD檢測器的響應值不依賴于被測物質的化學結構，只與被測物質的進樣質量有關，具有較高的響應一致性；雖然質譜檢測器（MS）的應用也十分廣泛，但應用MS作為檢測器的前提是被測物質可以被電離，且其造價和維護維修費用都很昂貴；另一種通用型檢測器示差折光檢測器（RID）由于不能兼容梯度洗脫，且抗干擾能力較差，應用范圍也很有限；相對同為通用型檢測器的蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD），CAD檢測器的線性范圍通常可達3~4個數量級，檢測靈敏度高，且CAD檢測器的測定參數基本已在出廠時設定好，每次分析的條件相對固定，因此重現性良好［7］。CAD檢測器雖具有明顯優(yōu)勢，但在使用時還存在一定的局限，表現在由于被測物質隨流動相進入檢測器后需要先霧化再干燥形成溶質顆粒，所以流動相中不可使用不揮發(fā)的緩沖鹽。

2 CAD檢測器在藥物分析中的應用

2.1 在中藥分析中的應用 在中藥飲片、中成藥及天然產物的分析研究及質量控制中，被測物質常常不具備發(fā)色基團，紫外吸收極弱，甚至沒有紫外吸收，如皂苷類、內酯類、糖類等化合物。胡瀚文等［8］建立了HPLC-CAD測定大葉三七葉中人參皂苷Rb1含量的方法，并與以DAD作為檢測器的測定結果進行了對比，結果表明CAD檢測器具有更穩(wěn)定的基線和更高的靈敏度。劉可等［9］采用HPLC-CAD建立了一種準確、快速、高效的測定遠志藥材中細葉遠志皂苷含量的方法，并對方法學參數進行了考查。南易等［10］建立了HPLC-CAD同時對知母中芒果苷和知母皂苷BⅡ進行含量測定的方法，此前由于芒果苷和知母皂苷BⅡ的結構差異，知母中這兩種成分要分別采用DAD和ELSD檢測器進行測定。同時，在實驗中發(fā)現CAD檢測器的靈敏度明顯高于ELSD檢測器。沈建偉等［11］從溶劑補償流速、柱溫箱溫度、霧化溫度三個角度，對柱后補償電噴霧檢測器測定黃芪甲苷含量的方法進行了探索，最終確定最佳色譜條件為采用0.4 ml/min流速的乙腈進行補償，同時將柱溫箱溫度設為30℃，霧化溫度設為30℃。劉麗娜等［12］采用HPLC-CAD技術建立了同時測定銀杏葉提取物中白果內酯、銀杏內酯C、銀杏內酯A和銀杏內酯B含量的方法，所建方法各項方法學參數良好，與ELSD檢測器、RID檢測器的測定結果相比，CAD檢測器的靈敏度最高。白鋼鋼等［13］采用HPLC-CAD法對銀杏葉片、銀杏葉分散片、銀杏葉膠囊和銀杏葉滴丸等18批銀杏葉制劑中4種萜類內酯類成分的含量進行測定，該方法操作簡便，靈敏度高，準確度、重復性均良好，各項方法學參數符合要求。王瑩等［14］分別采用ELSD檢測器、CAD檢測器建立了注射用益氣復脈（凍干）中果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的含量測定方法，并對測定結果進行了分析。同時研究中發(fā)現，CAD檢測器的功能參數（PF）是能否對糖類進行準確測定的關鍵參數。Hu等［15］建立了超高效液相色譜與CAD檢測器聯用方法（UPLC-CAD）用于同時測定太子參中7種低聚糖和蔗糖，該方法各項方法學參數良好。試驗中還采用液質聯用（UPLC-QTOF）技術對不同產地來源的太子參樣品中所含低聚糖的種類進行了鑒定。Sebastian等［16］利用HPLC-CAD技術建立了測定歐洲龍牙草中14種多酚類物質的方法，并在試驗中觀察到CAD檢測器在定量多酚類化合物的過程中存在一定的局限性，需要予以重視。方靈芝等［17］利用HPLC-CAD技術同時對兒童用中成藥小兒解感片中7種黃酮類成分的含量進行測定，所建方法準確度高，重復性好，線性關系、回收率、精密度均符合測定要求。

CAD檢測器具有寬動態(tài)檢測范圍、高靈敏度和穩(wěn)定性等優(yōu)點，可用于同時測定中性、酸性、堿性及兩性物質［18］，因此常用于同一藥材或成藥中多種不同性質物質的同時測定。任霞等［19］采用HPLC-CAD建立了甘草中芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷及甘草酸4種成分的含量測定方法，4種成分的回收率均在97%以上，所建方法準確高效。羅昌明等［20］應用CAD檢測器測定了中成藥風濕定片中8種指標成分的含量，方法學實驗表明所建方法準確性、重復性好，可操作性強，得到了滿意的測定結果。

中藥指紋圖譜從“全成分”的角度出發(fā)進行中藥的質量控制，是中藥道地藥材研究的重要手段，具有系統(tǒng)性、特征性等特點，而能否檢出盡可能多的色譜峰是中藥指紋圖譜是否具有代表性的關鍵影響因素。由于CAD檢測器具有響應一致性且靈敏度高，現已成為中藥指紋圖譜研究不可或缺的重要技術手段。Cao等［21］將UPLC-CAD技術應用于中成藥滋腎育胎丸的指紋圖譜及多成分分析研究，試驗中選擇了52個色譜峰作為特征峰用以評價16批滋腎育胎丸的相似性。該團隊還利用超高分辨率質譜儀鑒定了滋腎養(yǎng)胎丸中的281種化合物的結構。張春泥等［22］利用HPLCCAD技術對20批不同來源、產地的川楝子飲片進行成分分析，確定了28個共有峰，并采用UPLC-QTOF質譜技術對其中6個色譜峰進行了指認和鑒定。通過與HPLC-UV及HPLC-ELSD獲得的指紋圖譜對比，發(fā)現CAD檢測器的靈敏度更高，且所建方法的分離度及各項方法學參數良好。研究中采用聚類分析、主成分分析等統(tǒng)計學方法對獲得的指紋圖譜進行相似度評價，最終將20批樣品分成三類。陳學松［23］利用HPLC-CAD技術建立了馬鞭草指紋圖譜的測定方法，確定了17個共有峰，并對其中的熊果酸峰、齊墩果酸峰進行了確認。試驗中通過優(yōu)化色譜條件使難分離的同分異構體熊果酸、齊墩果酸達到基線分離。2.2 在生化、化學、抗生素藥物分析中的應用

2.2.1 在生化藥物分析中的應用 Satoshi等［24］采用HPLC-CAD方法在低濃度范圍內對未進行衍生化的19種氨基酸和?；撬徇M行了分離及含量測定。試驗結果表明，在0.1～1.6 nmol范圍內各組分線性關系良好，且方法重復性好、精密度高。羥甲司坦是一種用于治療慢性阻塞性肺疾病及支氣管哮喘的輔助用藥，其結構可以看作是氨基酸的衍生物，因此羥甲司坦及其結構類似物在紫外檢測器上響應強度很低。Oliver等［25］采用反相、陽離子交換混合模式與CAD檢測器聯用對羥甲司坦中的雜質進行了研究，所建方法在0.05%～0.25%和0.10%～0.60%范圍內線性關系良好，檢出限可達到0.03%以下。Daniel等［26］利用HPLCCAD技術對多聚唾液酸的鏈長進行了表征，并建立了多聚唾液酸的定量測定方法。該方法與傳統(tǒng)的經衍生化處理熒光檢測測定法比較，具有簡便、快速的特點，且在0.025～15 mg/ml濃度范圍內線性關系良好。Helen等［27］利用HPLC-UV-CAD聯用技術對兩種靜脈注射脂質乳液型腸外營養(yǎng)液（PN）的化學穩(wěn)定性情況進行了研究。試驗中通過測定樣品中甘油三酯和過氧化產物4-羥基壬烯醛的量來監(jiān)測PN中脂質的降解情況，該方法的檢出限、定量限、線性、日內及日間精密度等各項方法學參數均能滿足測定要求。

2.2.2 在化學藥物分析中的應用 有些化學藥物結構中沒有紫外吸收基團或在紫外檢測器上僅有末端吸收，CAD檢測器是對這類化學藥物進行分析的重要手段。龍珍等［28］采用親水色譜及CAD檢測器建立了同時測定5種抗病毒藥物的方法，并通過比較被測物質的峰型、分離選擇性及信號響應，考查不同的色譜模式、檢測方式對色譜系統(tǒng)的影響，所建方法實現了紫外吸收差異大、極性分布范圍廣的5種抗病毒藥物的同時分析，且方法學參數良好。趙慧［29］建立了HPLC-CAD法測定阿卡波糖膠囊含量，克服了《中國藥典》［30］中該品種的含量測定方法靈敏度低、基線不穩(wěn)、氨基柱使用壽命短、柱效下降快、色譜峰峰形差等缺陷，并在試驗中考查了采樣頻率和過濾常數、霧化溫度、冪率等CAD檢測器參數的改變對測定結果的影響。周潔等［31］建立了HPLC-UV-CAD聯用同時測定卡前列素氨丁三醇注射液中主要成分含量的方法，試驗中采用反相C18和陽離子交換混合模式的色譜柱，紫外檢測器用于檢測注射液中的苯甲醇，CAD檢測器用于檢測注射液中紫外吸收很弱或沒有紫外吸收的組分卡前列素和氨丁三醇，方法靈敏準確、操作簡便、專屬性強。

某些化學藥物的有關物質及降解產物不具備紫外吸收基團，僅采用常規(guī)的紫外檢測器無法全面掌握藥物的穩(wěn)定性情況，CAD檢測器的使用為此類問題提供了解決方案。Pramod等［32］建立了HPLC-CAD測定加巴噴丁及其有關物質的方法，經方法學驗證各項方法學參數結果良好，且所建方法與HPLC-MS/MS可以良好兼容。該作者還利用HPLC-MS/MS對加巴噴丁的酸、堿、氧化、加熱、光照等條件下的主要降解產物結構進行研究及確證。吳川彥等［33］通過對比DAD檢測器與CAD檢測器專屬性試驗結果，最終建立了HPLC-CAD測定伐地那非的含量及有關物質的方法，各項方法學參數良好。Oliver的科研團隊［34］采用高效液相色譜與CAD檢測器聯用對伊班膦酸鈉的雜質情況進行了研究，方法中應用了疏水C18與強陰離子交換的混合分離機制。所建方法各項方法學參數良好，多批次樣品測定結果顯示伊班膦酸鈉中的主要雜質為合成的副產物。Xu等［35］采用親水作用色譜柱及CAD檢測器測定酒石酸美托洛爾注射液、酒石酸美托洛爾片和琥珀酸美托洛爾緩釋片中美托洛爾降解產物3-異丙基胺基-1，2-丙二醇的量，經方法學驗證，該方法具有良好的特異性、準確度和精密度。

CAD檢測器的應用讓使用更加綠色環(huán)保的有機溶劑如丙酮、乙醇作為流動相成為可能，Nevena等［36］以丙酮、乙醇為流動相建立了測定利司培酮及其有關物質的HPLC-CAD方法，試驗中利用Derringer函數統(tǒng)計方法對試驗條件進行篩選和優(yōu)化，方法學驗證試驗表明所建方法符合測定要求。

2.2.3 在抗生素類藥物分析中的應用 氨基糖苷類和大環(huán)內酯類藥物均為常用的抗生素類藥物，其結構中都不具備紫外吸收基團，難以使用常規(guī)的紫外檢測器進行分析。在此類藥物的定量測定、降解雜質及有關物質研究中，CAD檢測器有著廣泛的應用。劉照振等［37］建立了HPLC-CAD測定鹽酸依替米星注射液中有關物質的方法，并將該方法與ELSD、脈沖安培電化學檢測器（PAD）的測定結果進行了對比。結果表明采用CAD檢測器，各色譜峰的分離度及檢測靈敏度較ELSD高，各有關物質測定結果的準確性較PAD好。Arianne等［38］建立了阿米卡星的HPLC-CAD測定方法并進行了方法學驗證，該方法簡便快速，避免了常規(guī)方法中需進行柱后衍生的繁瑣操作，可以達到每天測定近200個樣品的通量。氨甲基膦酸是合成萬古霉素衍生物特拉萬星的一種關鍵中間體，但氨甲基膦酸紫外吸收較弱，無法采用常規(guī)的DAD檢測器對其進行測定。顧海芳等［39］采用CAD檢測器建立了氨甲基膦酸含量測定方法，并對所建方法的方法學參數進行了考查。

Liu等［40］利用HPLC-CAD技術建立了測定約沙霉素和麥迪霉素中多種組分的通用可靠的測定方法，試驗中對高效液相色譜條件和CAD檢測器參數均進行了優(yōu)化，使各被測組分得到良好的分離和較高的檢測靈敏度。所建方法各項方法學參數良好，且對于十六元大環(huán)內酯類抗生素的分析測定具有一定的通用性。Wang等［41］還建立了HPLC-CAD測定十六元大環(huán)內酯類抗生素白霉素、麥白霉素中降解雜質的方法，并分析了降解雜質產生的影響因素。利用CAD檢測器的性能特點解決了不同降解產物因紫外吸收強度差異大而無法同時測定的問題，試驗結果顯示，被分析物在2～100μg/ml范圍內線性關系良好，低、中、高三水平回收率在98.7%～102.5%，檢出限、定量限分別為5 ng和15 ng，文中還考查了流動相中鹽的濃度、pH值以及柱溫對CAD檢測器的信號的影響。

2.3 在藥用輔料分析中的應用 藥用輔料在藥物制劑產生恰當的治療作用過程中扮演著重要的角色，其質量控制也受到越來越多的重視。一般來講，藥用輔料尤其是小分子藥用輔料的分子結構比較簡單，常常不具備紫外吸收基團，使得應用如紫外檢測器等常規(guī)檢測方式對其進行分析十分困難。CAD檢測器的應用為解決此類問題提供了一種思路。蔗糖、乳糖均為常用藥物輔料，在制劑中作為賦形劑、矯味劑等。孫亞靈等［42］建立了蔗糖及其有關物質的HPLC-CAD測定方法，試驗中考查了CAD檢測器關鍵參數霧化溫度、采集頻率、過濾常數以及冪率對信號響應的影響。孫亞飛等［43］建立了HPLC-CAD測定乳糖含量及其有關物質的方法，方法學試驗表明在1.0～100.4μg/ml范圍內線性關系良好，檢出限、定量限約為8 ng和20.08 ng。試驗中還觀察到所建方法較原方法色譜柱的耐用性有了很大提高。尿素作為藥用輔料在制劑中主要作為透皮吸收劑及助溶劑。趙恂等［44］采用親水作用色譜柱、CAD檢測器建立了尿素含量及有關物質的測定方法，研究中利用所建方法對6批尿素樣品進行了含量測定，并與凱氏定氮法的測定結果進行了比較。經方法學驗證，所建方法各項方法學參數良好，操作簡便，結果準確可靠。

磷脂及其衍生物由于其獨特的特性，是脂質體藥物傳遞系統(tǒng)的重要組成部分。Florian等［45］建立了超高效液相色譜DAD檢測器、CAD檢測器聯用同時檢測大豆來源的氫化L-α-磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿等22種天然及合成脂質、帶電磷脂、親脂熒光標記物及其降解產物的方法。所建方法各項方法學參數良好，研究者用該方法檢測布比卡因脂質體的光降解情況。

表面活性劑是制藥工業(yè)中常用的輔料種類，其中的非離子型表面活性劑常常為聚合物。由于聚合物往往不具備單一分子量，成分組成具有多分散性，要對此類物質進行量化，就需要具有響應一致性的通用型檢測器，CAD檢測器成為了很好的選擇。Christiane等［46］利用HPLC-CAD方法對凝膠基質類乳化劑進行了研究，所建方法可以同時分離、分析13種凝膠基質類乳化劑及其前體化合物，如聚乙二醇、聚山梨酯、硬脂酸酯、聚氧乙烯醚。該方法重現性好、專屬性高，同時與液質聯用儀有很好的兼容性。Steffen等［47］在測定聚山梨酯20（PS20）、聚山梨酯80（PS80）及其降解產物含量時，研究比較了熒光膠束法、高效液相電噴霧檢測法和高效液相蒸發(fā)光散射檢測法等三種定量分析方法定量行為的差異。試驗中發(fā)現由于三種測定方法的原理各不相同，對PS20、PS80及其降解產物的定量結果存在較大差異，同時由于PS80結構中疏水基團比例更高，使其定量準確度更加依賴于測定方法的選擇。Alizee等［48］首先利用親水色譜柱半制備色譜儀分離制備了11種非離子型表面活性劑聚氧乙烯脂肪醇醚的同系物，并利用CAD檢測器測定其在100～500 mg/kg的濃度范圍內標準曲線的斜率，用以研究CAD檢測器在同系物檢測中的響應一致性。試驗結果顯示在檢測此類物質時，CAD檢測器的響應一致性出現了偏差，研究者分析可能是受被測物質電離程度的影響，具體原因還需進一步研究。

CAD作為一種新型檢測器在各類藥物的分析研究領域發(fā)揮越來越多的作用，也逐漸被越來越多的研究人員熟悉，應用前景十分廣闊。有研究［49］利用HPLC-CAD技術進行葡萄糖胺的人體藥代動力學研究，CAD檢測器靈敏度高的特性可以滿足人體藥代動力學研究的要求。在食品研究領域［50］，采用UPLCCAD技術通過測定橄欖油中三酰甘油的分布情況，結合統(tǒng)計分析方法來辨別特級初榨橄欖油中是否摻假，該方法相對于傳統(tǒng)的脂肪酸和甾醇分析法既方便快捷又節(jié)約成本。雖然也有使用局限性的相關報道［48］，但CAD檢測器仍是對多組分樣品進行全面分析的重要補充手段，在藥物分析領域也將發(fā)揮更大的作用。