王 爍，季海蕊，那瑞瑩，曹慧瑩，趙 丹, *

(黑龍江大學 a.生命科學學院微生物省高校重點實驗室，哈爾濱 150080；b.農(nóng)業(yè)微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150500)

0 引 言

β-甘露聚糖酶(β-mannanase，EC 3.2.1.78，以下簡稱甘露聚糖酶)，是能夠水解葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖和均一甘露聚糖的內(nèi)切水解酶，屬于半纖維素酶類。甘露聚糖酶的作用位點是β-1,4-D-吡喃糖苷鍵，水解產(chǎn)物甘露低聚糖能夠降膽固醇、降血糖，可用作食品添加劑[1]。甘露聚糖酶本身也可作為紙張漂白劑、飼料添加劑、植物油提取劑，還具有降低咖啡提取物黏度，提高果汁產(chǎn)量和果汁澄清度的作用，實現(xiàn)在造紙、飼料和食品等領域的廣泛應用[2-3]。

甘露聚糖酶普遍存在于動植物和微生物中，由于來源廣泛、周期短和易于大規(guī)模生產(chǎn)等特點，微生物來源的甘露聚糖酶得到國內(nèi)外的重點關注。產(chǎn)甘露聚糖酶的菌株主要包括曲霉屬(Aspergillus)[4]、青霉菌屬(Penicillium)[5]、芽孢桿菌屬(Bacillus)[6]和假單胞菌屬(Pseudomonas)[7]等。但由于生物安全性的限制和影響，上述菌株來源的甘露聚糖酶需經(jīng)過純化，否則無法滿足食品領域對高安全性酶的需求。

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)作為公認的安全性(Generally regarded as safe，GRAS)菌株，在食品和藥品等領域得到廣泛應用[8]。目前報道的產(chǎn)甘露聚糖酶乳酸菌僅有5種，分別為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)M17[9]、綠色魏斯氏菌(Weissellaviridescens)LB37[10]、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)RI11[11]、ATCC14917TM[12]和M24[13]以及干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)HDS- 01[3]。挖掘產(chǎn)甘露聚糖酶乳酸菌資源并優(yōu)化提高產(chǎn)酶水平，才能滿足甘露聚糖酶在食品級領域日益增長的應用需求。微生物產(chǎn)甘露聚糖酶能力受培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件影響，單因素試驗是最直接有效的優(yōu)化方法。Khattab O H等[14]通過單因素優(yōu)化桔青霉(Penicilliumcitrinium)150GY發(fā)酵條件，菌株酶活優(yōu)化后達到26.50 IU·mL-1，相較于優(yōu)化前的16.82 IU·mL-1提高了57.55%。

本研究以L.casei3MP-5-3為供試菌株，通過改變培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件，以甘露聚糖酶酶活和生物量為指標，確定菌株產(chǎn)酶的最適條件。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

供試菌株3MP-5-3分離自東北酸菜發(fā)酵液，保藏于黑龍江大學微生物重點實驗室。

MRS培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母浸粉5，磷酸氫二鉀2，檸檬酸銨2，無水亞硫酸鈉0.1，硫酸鎂0.2，硫酸錳0.05，無水乙酸鈉5，吐溫80 1 mL；pH 5.5；121 ℃滅菌15 min，用于菌株的活化。

1.2 主要試劑

魔芋粉購自四川新星魔芋粉廠；甘露糖標準品購自上?？笊锛夹g有限公司；角豆膠購自Sigma Alrich公司(CAS：9000- 40-2)。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化

取-80 ℃冰箱內(nèi)保藏菌種按2%(v/v)接種量轉接至YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h活化2代后備用。

1.3.2L.casei3MP-5-3生物量及甘露聚糖酶活性測定

活化好菌液轉接至基礎產(chǎn)糖培養(yǎng)基中，30 ℃、150 rpm·min-1、發(fā)酵140 h，將發(fā)酵液適當稀釋，以相同稀釋倍數(shù)基礎產(chǎn)糖培養(yǎng)基為空白對照，測定L.casei3MP-5-3發(fā)酵液600 nm下吸光度，即為L.casei3MP-5-3生物量。

發(fā)酵液10 000 rpm·min-1離心10 min，上清即為粗酶液。粗酶液2 mL和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液0.5 mL配制pH 6.0的0.5%(w/v)角豆膠溶液。55 ℃水浴30 min后，加入3 mL DNS試劑沸水浴10 min終止反應，最后用蒸餾水定容至25 mL。以等量0.8%果膠水溶液作空白對照，540 nm測還原糖含量。1個酶活力單位定義為1 μmol·min-1還原糖所需的酶量[15]。

1.3.3 培養(yǎng)基組分對菌株生物量和甘露聚糖酶產(chǎn)量影響

1.3.3.1 碳源種類與濃度

分別以魔芋粉、角豆膠、果膠和瓜爾膠為產(chǎn)酶誘導物。在確定最適誘導物種類后，考察濃度分別為2、4、6、8、10 g·L-1對菌株生物量和產(chǎn)酶的影響。

1.3.3.2 葡萄糖濃度

培養(yǎng)基中添加2、4、6、8、10、12 g·L-1濃度的葡萄糖，考察菌株生物量和產(chǎn)酶情況。

1.3.3.3 氮源濃度

培養(yǎng)基選取不同濃度的3種有機氮源酵母浸粉濃度為1、3、5、7、9 g·L-1，蛋白胨濃度為6、8、10、12、14 g·L-1以及牛肉膏濃度6、8、10、12、14 g·L-1，通過對菌株生物量和產(chǎn)酶結果比較，確定3種有機氮源的最適濃度。并在此基礎上?？疾鞜o機氮源檸檬酸銨在1、2、3、4、5 g·L-1濃度下對菌株的生物量和產(chǎn)酶的影響。

1.3.3.4 乙酸鈉濃度

乙酸鈉的添加量分別為2、4、6、8、10 g·L-1，通過菌株生物量和產(chǎn)酶情況篩選出最適濃度。

1.3.4 培養(yǎng)條件對菌株生物量和β-甘露聚糖酶產(chǎn)量影響

1.3.4.1 初始pH值

培養(yǎng)基調(diào)整pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，考察菌株生物量和產(chǎn)酶情況。

1.3.4.2 溫度

菌株接種到培養(yǎng)基后在24、27、30、33、36 ℃溫度下發(fā)酵，探究溫度對菌株生物量和產(chǎn)酶情況的影響。

1.3.4.3 搖床轉速

培養(yǎng)基在60、80、100、120、140 rpm·min-1的轉速下培養(yǎng)，通過不同處理菌株生物量和產(chǎn)酶情況的比較，確定最適搖床轉速。

1.3.4.4 接種量和裝液量

按照1%、3%、5%、7%、9%的接種量進行接種，以菌株生物量和產(chǎn)酶情況為結果對接種量進行篩選。并向在此基礎上，考察裝液量分別為40 mL/250 mL、60 mL/250 mL、80 mL/250 mL、100 mL/250 mL、120 mL/250 mL、140 mL/250 mL對菌株生物量和產(chǎn)酶的影響。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

本研究主要繪圖軟件為SigmaPlot 10.0，采用JMP 10.0軟件進行統(tǒng)計分析及多重比較。實驗均設置3個平行，數(shù)據(jù)的表示形式為均值±標準差。采用Tukey’s方法對組間數(shù)據(jù)多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與討論

2.1 碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

碳源種類對L.casei3MP-5-3生長及產(chǎn)甘露聚糖酶的影響見圖1。由圖1可見，角豆膠誘導產(chǎn)酶效果最好，魔芋粉次之。汪夢昀等[16]在研究不同碳源優(yōu)化酶產(chǎn)量的過程中得出魔芋微粉和魔芋精粉效果顯著優(yōu)于其他碳源。但魔芋粉溶液黏稠度高，培養(yǎng)基在發(fā)酵初期呈膠狀，影響菌株生物量和酶產(chǎn)量[17]。因此，后續(xù)研究將采用角豆膠為產(chǎn)酶誘導物。

圖1 碳源種類對L.casei 3MP-5-3生長及產(chǎn)甘露聚糖酶的影響Fig.1 Effects of carbon source on growth and mannanase production of L.casei 3MP-5-3

在確定的最適碳源條件下，用不同濃度的角豆膠對菌株進行發(fā)酵，對酶活影響見圖2，隨著角豆膠濃度的增加，酶活先增加，在角豆膠質(zhì)量濃度為6 g·L-1時達到最大值19.93±0.07 U·mL-1，隨后酶活逐漸降低。因此確定6 g·L-1為最適碳源濃度。

圖2 角豆膠濃度對L.casei 3MP-5-3生長及產(chǎn)甘露聚糖酶的影響Fig.2 Effects of carob gum concentration on growth and mannanase production of L.casei 3MP-5-3

2.2 葡萄糖對菌株產(chǎn)酶的影響

研究發(fā)現(xiàn)L.caseiHDS- 01是在由葡萄糖和魔芋粉組成的混合碳源條件下發(fā)酵產(chǎn)酶的，培養(yǎng)基內(nèi)適宜含量的葡萄糖使菌株積累足夠的生物量，而后菌株利用多聚糖產(chǎn)生甘露聚糖酶[18]。本研究利用2～12 g·L-1的葡萄糖發(fā)酵菌株3MP-5-3，其中酶活和OD值均在8 g·L-1達到最大值，分別為38.82±0.39 U·mL-1和4.26±0.04(圖3)。與未添加葡萄糖之前相比酶活提高了40.6%。張鑫等[19]在培養(yǎng)基中添加1%濃度的葡萄糖后，酶活提高了27.2%，達到了62.8±0.27 U·mL-1。本研究通過對多聚碳源和葡萄糖的篩選將利用6 g·L-1的角豆膠和8 g·L-1的葡萄糖組成的混合碳源用于后續(xù)發(fā)酵。

圖3 葡萄糖濃度對L.casei 3MP-5-3生長及產(chǎn)甘露聚糖酶的影響Fig.3 Effects of glucose concentration on growth and mannanase production of L.casei 3MP-5-3

2.3 氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

以甘露聚糖酶酶活為檢測指標篩選培養(yǎng)基的不同氮源濃度，結果見表1。由表1可見，分別對酵母浸粉、蛋白胨和牛肉膏3種有機氮源的不同濃度進行考察，其中酵母浸粉的最適濃度為7 g·L-1，此時酶活達到試驗范圍內(nèi)的最大值為42.95±0.13 U·mL-1。蛋白胨的最適濃度為10 g·L-1，菌株酶活達到46.22±0.27 U·mL-1得到進一步提高。在此基礎上，對牛肉膏的濃度進行篩選發(fā)現(xiàn)牛肉膏為10 g·L-1時，菌株酶活最大為48.80±0.39 U·mL-1。因此3種氮源均對菌株酶活的提高有積極影響，并分別確定了其最適添加濃度。研究在確定有機氮源后對無機氮源檸檬酸銨的添加量進行探索。檸檬酸銨在1～5 g·L-1下對甘露聚糖酶的產(chǎn)量有不同影響。當檸檬酸銨濃度達到3 g·L-1時，菌株產(chǎn)酶效果最優(yōu)為53.79±0.13 U·mL-1。

2.4 乙酸鈉對菌株產(chǎn)酶的影響

乙酸鈉濃度對L.casei3MP-5-3生長及產(chǎn)甘露聚糖酶的影響見圖4。由圖4可見，乙酸鈉的濃度達到6和8 g·L-1時，菌株酶活優(yōu)于其他處理組。乙酸鈉為6 g·L-1時，酶活達到55.73±0.13 U·mL-1；而乙酸鈉為8 g·L-1時，酶活為55.12±0.49 U·mL-1。出于成本的考慮，本研究將乙酸鈉濃度確定為6 g·L-1。

2.5 pH對菌株產(chǎn)酶的影響

pH過高或過低都會降低菌株產(chǎn)酶能力。菌株在pH=5.5偏酸性的條件下，酶活和OD值均達到最大值分別為59.51±0.20 U·mL-1和4.04±0.04(圖5)，Kumar U等[20]在考察菌株米曲霉(Aspergillusoryzae)產(chǎn)酶的最適pH值為9，與L.casei初始pH相差較大，可能是本研究菌株為乳酸菌，在弱酸性條件下適宜其生長。

圖5 初始pH對L.casei 3MP-5-3生長及產(chǎn)甘露聚糖酶的影響Fig.5 Effects of initial pH on growth and mannanase production of L.casei 3MP-5-3

2.6 溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

溫度對L.casei3MP-5-3生長及產(chǎn)甘露聚糖酶的影響見圖6。由圖6可見，在一定溫度范圍內(nèi)，菌株的酶活和OD值隨著溫度的升高呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢，其中在33 ℃出現(xiàn)峰值，在此溫度下甘露聚糖酶酶活達到最大值為59.73±0.20 U·mL-1。結果表明過高或過低的溫度均不利于菌株的生長，影響酶的產(chǎn)量。熊進等[21]優(yōu)化畢赤酵母(Pichiapastoris)的產(chǎn)酶條件時，因過高溫度對蛋白質(zhì)降解的影響，確定的最佳產(chǎn)酶條件不超過28 ℃，而汪夢昀等[16]和張鑫等[19]分別對枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和L.casei產(chǎn)酶條件中的溫度進行優(yōu)化時，結果表明兩種不同種屬的菌株最適溫度均為37 ℃，受不同菌株種屬特異性的影響其最佳產(chǎn)酶溫度有所異同。

圖6 溫度對L.casei 3MP-5-3生長及產(chǎn)甘露聚糖酶的影響Fig.6 Effects of temperature on growth and mannanase production of L.casei 3MP-5-3

2.7 搖床轉速對菌株產(chǎn)酶的影響

菌株在液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)過程中，搖床轉速對菌株生物量和酶產(chǎn)量的提高具有重要作用，適宜的搖床轉速可使菌株在液體培養(yǎng)基中分散的更將均勻利于菌株對培養(yǎng)基組分吸收促進生長，避免某一區(qū)域過分密集造成競爭而使菌株產(chǎn)生競爭，抑制生長(圖7)。由圖7可見，在100 rpm·min-1的搖床轉速下，菌株產(chǎn)酶效果最好，酶活達到最大值60.98±0.20 U·mL-1。

圖7 搖床轉速對L.casei 3MP-5-3生長及產(chǎn)甘露聚糖酶的影響Fig.7 Effects of shaking speed on growth and mannanase production of L.casei 3MP-5-3

2.8 接種量和裝液量對菌株產(chǎn)酶的影響

接種量通過對菌株發(fā)酵周期的影響，進而影響菌株酶產(chǎn)量。接種量及裝液量對L.casei3MP-5-3生長及產(chǎn)甘露聚糖酶的影響見圖8。由圖8(a)可見，當接種量為5%時，酶活力最大為63.30±0.52 U·mL-1。隨著接種量增加OD值出現(xiàn)顯著的下降趨勢，可能因為營養(yǎng)物質(zhì)的消耗菌株之間競爭增大，造成菌株的大量死亡。在確定接種量基礎上，通過優(yōu)化裝液量發(fā)現(xiàn)，由圖8(b)在40～140 mL/250 mL的范圍內(nèi)，隨著裝液量的逐步增大酶活先升高后下降，在120 mL/250 mL達到最大值64.55±0.20 U·mL-1。

圖8 接種量(a)及裝液量(b)對L.casei 3MP-5-3生長及產(chǎn)甘露聚糖酶的影響Fig.8 Effects of inoculation (a) and liquid loading (b) on growth and mannanase production of L.casei 3MP-5-3

3 結 論

本文以一株產(chǎn)甘露聚糖酶乳酸菌L.casei3MP-5-3為供試菌株，通過對培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件的單因素試驗優(yōu)化，實現(xiàn)菌株酶產(chǎn)量的提高。確定了L.casei3MP-5-3最優(yōu)產(chǎn)酶條件下的培養(yǎng)基各組分為角豆膠6 g·L-1、葡萄糖8 g·L-1、有機氮源中酵母浸粉7 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，牛肉膏10 g·L-1、檸檬酸銨3 g·L-1、乙酸鈉6 g·L-1、吐溫80 1 mL、初始pH值5.5。培養(yǎng)條件33 ℃，100 rpm·min-1搖床轉速，接種5%的種子液，120 mL/250 mL裝液量，酶活達到64.55±0.20 U·mL-1，較優(yōu)化前的19.93±0.07 U·mL-1提高了2.24倍。此結果不僅提高了甘露聚糖酶產(chǎn)量，也為研究乳酸菌產(chǎn)酶奠定了基礎。