孫夢笛,劉 暢,馮國軍,劉大軍,閆志山,楊曉旭

(黑龍江大學 現代農業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，哈爾濱 150080)

0 引 言

菜豆(PhaseolusvulgarisL.)也稱蕓豆，豆科，菜豆屬[1]，是短日照植物，喜溫，不耐凍。如今菜豆在我國大面積地種植，菜豆的品種資源非常豐富，屬于我國主要的蔬菜種類之一，也是重要的食用豆類之一。 菜豆種子萌發(fā)開始溫度為8 ℃左右，適宜生長溫度為20～25 ℃，種子萌發(fā)適應的地溫為10～12 ℃[2]。

植物在生長過程中，經常會受到低溫的影響，降低植株的出苗率，導致其產量迅速下降。種子的萌發(fā)是其生長過程中的重要階段，萌發(fā)過程所發(fā)生的生化反應都需要適宜的溫度，低溫會導致種子的萌發(fā)受到抑制，貯藏物質水解迅速，發(fā)芽率降低,過氧化物酶的功能減退，破壞了活性氧原有的平衡，導致細胞代謝紊亂。因此，研究在低溫脅迫下對菜豆種子的影響，對菜豆的生產具有重要的意義[3]。

水楊酸作為一種小分子酚類物質，也是植物內源激素,在植物逆境條件下具有較強的生理作用。對于低溫的逆境條件，水楊酸能夠進一步緩解低溫脅迫對植物生長造成的負面影響。近年來，關于水楊酸在低溫脅迫下的研究表明：經外源水楊酸處理的植物抗寒性有所提高，如茄子[4]，玉米[5]，棉花[6]等，但是水楊酸在低溫脅迫條件下對菜豆種子萌發(fā)的影響少有報道。本文以低溫敏感的“熱那亞”為試驗材料，研究在低溫脅迫條件下，施加外源物質水楊酸對菜豆種子萌發(fā)以及生理生化特征的影響，為菜豆低溫脅迫的有效防御提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選擇低溫敏感型的“熱那亞”菜豆為試驗材料，由黑龍江大學呼蘭校區(qū)園藝學團隊提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子萌發(fā)試驗

本研究選取低溫敏感型的“熱那亞”品種。選擇大小一致、成熟飽滿的種子，用10%的次氯酸鈉消毒10 min，再用蒸餾水沖洗3～5次，吸干水后置于帶有濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿50粒種子。在對菜豆種子進行低溫脅迫實驗時，發(fā)現低溫處理12 h種子的發(fā)芽率較高，因此設置3個處理組，每組進行3次重復試驗。①CK：25 ℃+30 mL蒸餾水，置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；②LT：4 ℃+30 mL蒸餾水，置于4 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h進行低溫脅迫處理，再置于25 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；③LT+SA：4 ℃+30 mL，2.5 mg·L-1SA，置于4 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h進行低溫脅迫處理，再置于25 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

以胚根伸出種皮2 mm作為發(fā)芽標志，計算發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數，第4天測量胚根胚軸長度。發(fā)芽勢=(發(fā)芽初期規(guī)定日期內發(fā)芽數/供試種子數)×100%，發(fā)芽率=(發(fā)芽末期規(guī)定日期內發(fā)芽數/供試種子數)×100%，發(fā)芽指數=不同時間的發(fā)芽數/對應的發(fā)芽天數。

1.2.2 生理指標的測定

1.3 生理指標測定方法

1.4 數據處理

試驗數據均采用DPS軟件進行差異顯著性分析，試驗圖表均采用Excel軟件繪制。

2 結果分析

2.1 外源水楊酸對低溫脅迫下菜豆種子萌發(fā)的影響

外源水楊酸對低溫脅迫下菜豆種子萌發(fā)的影響見表1。由表1可見，與CK相比，在低溫脅迫下，菜豆種子的發(fā)芽率，發(fā)芽勢，發(fā)芽指數分別降低了53.43%，58.74%，61.19%；在低溫下施加水楊酸，與LT相比分別提高了94.13%，113.58%，117.16%；與CK相比，LT+SA處理分別降低了9.59%，11.89%，15.70%。由此表明：在低溫脅迫下，菜豆種子的萌發(fā)受到抑制，但施加外源SA能夠有效緩解低溫對菜豆種子萌發(fā)的抑制，菜豆種子發(fā)芽率，發(fā)芽勢，發(fā)芽指數顯著提高，但未恢復到常溫組原有的發(fā)芽水平。

表1 外源水楊酸對低溫脅迫下菜豆種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of exogenous salicylic acid on Phaseolus vulgaris seeds under low temperature stress

2.2 外源水楊酸對低溫脅迫下菜豆種子胚軸胚根的影響

外源水楊酸對低溫脅迫下菜豆種子胚軸胚根的影響見表2。由表2可見，CK和LT處理的胚軸長差異顯著，但胚根長差異不顯著，在低溫條件下與CK相比，胚軸，胚根長分別降低了36.82%，17.68%。因此，低溫脅迫抑制了菜豆種子的生長。LT+SA組的胚軸和胚根長與LT相比分別提高了72.93%，28.83%，表明施加外源SA促進菜豆種子胚的伸長。

表2 外源水楊酸對低溫脅迫下菜豆種子胚軸胚根的影響Table 2 Effects of exogenous salicylic acid on Phaseolus vulgaris seeds under low temperature stress

Note: The averages and standard errors are from 3 independent experiments. Different lowercase letters in each column indicate significant differences at the 0.05 level.

2.3 外源水楊酸對低溫脅迫下菜豆種子抗氧化酶活性的影響

低溫脅迫下SA對菜豆種子抗氧化酶活性的影響見圖1～圖3。由圖1可見，LT組處理的POD活性明顯低于CK組，經SA處理的POD活性提高，并且隨著處理時間的變化逐漸升高，與LT比，POD活性在12、24、36、48 h分別提高101.33%，70.82%，17.28%，20.65%，且差異顯著。

圖1 低溫脅迫下SA對菜豆種子過氧化物酶活性的影響Fig.1 Effects of SA on POD activity of Phaseolus vulgaris seeds under low temperature stress

由圖2可見，在4個不同的時間段中，低溫條件CAT活性受到抑制，施加外源SA使CAT活性分別上升了69.84%，33.33%，27.91%，37.78%。并且施加外源SA的CAT活性高于常溫對照組，在36 h和48 h時差異顯著。

圖2 低溫脅迫下SA對菜豆種子過氧化氫酶活性的影響Fig.2 Effects of SA on CAT activity of Phaseolus vulgaris seeds under low temperature stress

由圖3可見，在低溫處理下SOD活性降低，與CK相比在36 h顯著降低；與LT相比，SA處理下的SOD活性略微提高，均高于對照組CK且在12、24、48 h差異顯著。

圖3 低溫脅迫下SA對菜豆種子超氧化物歧化酶活性的影響Fig.3 Effects of SA on SOD activity of Phaseolus vulgaris seeds under low temperature stress

由此說明施加水楊酸可以通過提高抗氧化酶的活性來實現保護生物膜的目的，進一步減少了低溫對膜系統(tǒng)的傷害，提高菜豆種子的抗寒能力。

2.4 外源水楊酸對低溫脅迫下菜豆種子MDA含量和產生速率的影響

MDA是判斷植物膜結構被損害程度的標準之一。低溫脅迫下SA對菜豆種子丙二醛含量的影響見圖4。由圖4可見，低溫條件明顯提高了菜豆種子的MDA含量，隨著處理時間的延長，MDA含量逐漸升高，與CK對比，分別提高了44.14%，4.64%，19.44%，35.89%，且差異顯著。施加外源水楊酸減少了MDA在低溫下的積累，與LT對照比在12、24、36、48 h分別降低了13.02%，1.38%，7.89%，9.80%；且在12 h和48 h時差異顯著，在24 h和36 h時差異不顯著。

圖4 低溫脅迫下SA對菜豆種子丙二醛含量的影響Fig.4 Effects of SA on MDA content of Phaseolus vulgaris seeds under low temperature stress

圖5 低溫脅迫下SA對菜豆種子產生速率的影響Fig.5 Effects of SA on production rate of Phaseolus vulgaris seeds under low temperature stress

因此，低溫下外源水楊酸可以降低菜豆在冷脅迫時自由基和活性氧的含量，避免積累過多的MDA，緩解了低溫對膜系統(tǒng)的傷害程度。

2.5 外源水楊酸對低溫脅迫下菜豆種子脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響

低溫脅迫下SA對菜豆種子脯氨酸和可溶性蛋白質含量的影響見圖6，圖7。由圖6，圖7可見，在4 ℃低溫對照組，脯氨酸和可溶性蛋白的含量隨著處理時間的延長，均呈現先升高后下降的趨勢，在36 h達到最大值，與CK比分別提高了5.77%，6.46%。在低溫下加入外源SA，與LT處理比增加了脯氨酸和可溶性蛋白的積累，其中，脯氨酸在不同的時間段分別增加了11.85%，6.64%，4.77%，6.24%，可溶性蛋白分別增加13.82%，9.85%，2.41%，13.84%。

圖6 低溫脅迫下SA對菜豆種子脯氨酸含量的影響Fig.6 Effects of SA on Proline content of Phaseolus vulgaris seeds under low temperature stress

圖7 低溫脅迫下SA對菜豆種子可溶性蛋白含量的影響Fig.7 Effects of SA on Soluble protein content of Phaseolus vulgaris seeds under low temperature stress

由此表明：菜豆種子在低溫冷害下，施加水楊酸促進脯氨酸和可溶性蛋白含量的積累，進而有效地保護種子免受低溫的傷害。

3 討 論

由已報道的實驗研究表明水楊酸常作為一種信號調節(jié)因子，不僅參與植物的各種脅迫反應，而且還會促進植物的生長，改善植物的生理生化特征[11]。通常水楊酸通過充當抗氧化劑來清除植物體內的活性氧，并且可以激活植物的抗氧化系統(tǒng)來直接抵御逆境給植物造成的氧化破壞影響[12]。在低溫條件下，植物出現不同的脅迫反應，損害生物膜的結構，影響膜的透性，植物生理生化也發(fā)生不同程度的變化。本實驗低溫環(huán)境明顯抑制了菜豆種子的萌發(fā)，施加外源水楊酸能夠抵御低溫冷害對菜豆種子造成的傷害，增強菜豆種子自身的抗寒特性。這與Diao Q N等[13]試驗結果是一致的。

低溫條件下，會使細胞膜受到傷害，發(fā)生膜脂過氧化反應最終產生丙二醛。丙二醛作為判斷植物受到逆境危害程度的重要指標之一，與種子的活力密切相關，一般情況下，MDA的含量高，表明：種子受到一定程度的傷害導致種子發(fā)芽能力降低。在本實驗中，低溫逆境抑制種子的萌發(fā)，種子發(fā)芽率，發(fā)芽勢和發(fā)芽指數有所下降，而MDA的含量有所上升，這與王宏燕等[14]研究情況相同。通過外源水楊酸的處理，能夠抑制膜脂過氧化現象的產生，降低了MDA的含量，以此來減少低溫逆境對菜豆種子帶來的傷害，保持細胞膜的穩(wěn)定性，提高菜豆種子在萌發(fā)階段的抗寒能力。

脯氨酸作為一種滲透調節(jié)物質，在諸多脅迫環(huán)境中均有表現，同樣在低溫的條件下也積累游離的脯氨酸。在植物體內，脯氨酸能夠加強蛋白質的水合作用，穩(wěn)定細胞的結構，促進可溶性蛋白的含量的積累，保護細胞不受逆境的傷害?？扇苄缘鞍滓彩呛饬恐参锟购詮娙醯囊环N指標，其含量的提高表明植物對低溫脅迫的適應性強，趙萌[15]認為可溶性蛋白的含量與植物抗寒的能力呈正相關。研究中，低溫下的菜豆種子積累少量的脯氨酸和可溶性蛋白，但SA的添加提高了菜豆種子中脯氨酸和可溶性蛋白含量，進一步提高了菜豆種子在萌發(fā)過程中的抗寒性，該結果在玉米種子[16]，扁稽豆種子[17]上早有報道。

活性氧在低溫逆境的誘導下產生速率加快，導致種子的萌發(fā)受到抑制，為了防止活性氧帶來的傷害，種子內形成保護酶系統(tǒng)來抵抗植物面臨的逆境條件，保護酶系統(tǒng)主要包含POD，SOD，CAT 3種酶，本實驗與常溫對照比在低溫下的保護酶的活性均降低，施加SA后可以提高菜豆種子內各個部位清除活性氧的能力，導致菜豆種子的POD和CAT活性顯著提高，而SOD有略微的提高。

4 結 論

在低溫逆境下，菜豆種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數分別降低了53.43%，58.74%，61.19%；通過外加水楊酸分別提高了94.13%，113.58%，117.16%。與LT對照比，外源SA的施加減少了膜的損害，使菜豆種子MDA含量在12、24、36、48 h分別降低了13.02%，1.38%，7.89%，9.80%。脯氨酸在不同的時間段分別增加了11.85%，6.64%，4.77%，6.24%，可溶性蛋白分別增加了13.82%，9.85%，2.41%，13.84%。抗氧化酶作為ROS的清除系統(tǒng)之一，外源SA的處理增強了抗氧化酶對細胞膜的保護，提高抗氧化酶的活性，緩解低溫逆境對菜豆種子的傷害。由此表明：低溫脅迫打破了菜豆種子內部原有的動態(tài)平衡，導致氧代謝失調，積累大量的活性氧及MDA，降低抗氧化酶的活性，使細胞膜的透性發(fā)生改變，影響菜豆種子的正常萌發(fā)。而水楊酸作為植物生長過程中的調節(jié)物質，能夠進一步改善菜豆種子在低溫脅迫下的萌發(fā)情況，提高菜豆種子的抗氧化酶活性，同時減少了MDA和活性氧的積累，保護細胞膜的穩(wěn)定性，維持菜豆種子內原有的平衡狀態(tài)，能夠有效抵御低溫脅迫對菜豆種子帶來的傷害，使菜豆種子在萌發(fā)過程中對低溫環(huán)境產生一定的適應能力，提高其抗寒性。