夏亞文，徐瓊，劉洋*

上海市質量監(jiān)督檢驗技術研究院，上海食品快速檢測工程技術研究中心（上海 200233）

葉酸（folic acid）又名蝶酰胺谷氨酸，是一類具有蝶酰谷氨酸分子結構化合物的總稱[1]。葉酸具有參與氨基酸間相互轉化、DNA合成等人體內許多重要化合物合成與代謝的生理學功能，并在細胞的生長、分化、修復和宿主防御方面發(fā)揮著重要作用[2]。

天然葉酸的主要來源包括綠色蔬菜、水果、菇類、肉類以及谷物[3]。除此之外，微生物代謝合成也是葉酸的主要來源方式。據(jù)報道，芽孢桿菌和腸桿菌屬（Bacillus and Enterobacter）[4]、魏斯氏菌屬和腸球菌屬（Weissner and Enterococcus）[5]、乳桿菌屬和明串珠菌屬（Lactobacillus and Leuconostoc）[6-7]具有代謝合成葉酸的能力。深入發(fā)掘傳統(tǒng)發(fā)酵產品中有益微生物，并利用其自身代謝合成維生素的能力，是目前食品發(fā)酵領域的熱點之一。越來越多的天然發(fā)酵食品因其富含豐富的維生素而受到關注，如發(fā)酵豆制品[8]、發(fā)酵牛乳[9]、日本泡菜[10]、發(fā)酵椰汁[11]等。

腐乳作為一種天然發(fā)酵食品在中國已經有著上千年的歷史，研究表明腐乳具有抗氧化、降血壓、降膽固醇、防癌突變、改善阿爾茲海默癥、抗疲勞等保健作用。此外，腐乳因特殊是生產工藝—在生產過程中人工參與環(huán)節(jié)較多、發(fā)酵環(huán)節(jié)開放、產品無滅菌殺菌工藝等[12-13]，使得腐乳中存在各種有益微生物。對腐乳中微生物菌群分析表明，紅腐乳菌群中存在有多霉菌、酵母、乳酸菌屬[14]，這些微生物為腐乳提供了豐富的風味和營養(yǎng)物質。課題組前期對不同腐乳中維生素B12的含量進行了研究，發(fā)現(xiàn)相比于其他腐乳，臭腐乳具有較高的維生素B12[15]，并從臭腐乳中篩選出了產維生素B12的菌株，對于腐乳中營養(yǎng)物質的深入研究對新產品的開發(fā)和利用具有重要的現(xiàn)實意義。研究以市場上不同類型腐乳為研究對象，利用微生物法對市場上不同類型腐乳葉酸含量進行了測定，為腐乳制品中葉酸含量提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

試驗所使用的樣品均來自當?shù)剞r貿市場或超市，詳見表1。

表1 市售樣品目錄

1.1.2 菌株

葉酸測試菌株：鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus caseiATCC 7469）。

1.1.3 試劑

葉酸標準品（C19H19N7O6，純度＞98%，CAS號59-30-3，美國Sigma-Aldrich）；氫氧化鈉、無水乙醇。

1.1.4 培養(yǎng)基

MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、葉酸測定用培養(yǎng)基（北京陸橋有限公司）。

1.2 儀器與設備

GI6-2型電熱恒溫培養(yǎng)箱（美國SHELLAB）；Seven Easy酸度計（美國METTLER TOLEDO）；TECAN M200全波長多功能微孔板分析系統(tǒng)（瑞士Tecan）；Milli-Q超純水機（德國Merck）；GZ99/JPC100B型超聲波振蕩器（北京中西遠大科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

樣品處理參考GB 5009.211—2014[16]中，并稍作修改：取樣品可使用部分，均質后稱一定量的樣品，加入30 mL的磷酸緩沖液，振搖6 min后，具塞，于121℃水解15 min，樣品取出冷卻至室溫，加入1 mL雞胰腺溶液和1 mL蛋白酶-淀粉酶液，加入3～5滴甲苯后置于37±1 ℃恒溫培養(yǎng)箱中酶解16～20 h，取出，轉入100 mL容量瓶中，用水定容至100 mL，作為葉酸樣品溶液。

1.3.2 微生物法測定樣品中葉酸含量

將保存的鼠李糖乳桿菌轉接到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基中，37±1 ℃培養(yǎng)20～24 h，再將其接種于乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)24 h。將乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)液以4 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入10 mL生理鹽水，混勻，再離心5 min，重復清洗3次。之后以生理鹽水做空白，于550 nm下測定菌懸液的透光率，調節(jié)菌懸液的透光率在60%～80%之間用于葉酸的測定。

1.3.3 標準溶液的制備

精確稱取20.0 mg葉酸標準品，用0.01 mol/L的氫氧化鈉乙醇溶液溶解并定容至1 000 mL容量瓶刻度線，此為葉酸標準貯備液。從中吸取1.00 mL葉酸標準貯備液置100 mL容量瓶，用0.01 mol/L的氫氧化鈉乙醇溶液定容至刻度，此為葉酸標準中間液。從中吸取1.00 mL葉酸標準中間液置1 000 mL容量瓶，用0.01 mol/L的氫氧化鈉乙醇溶液定容至刻度，此為葉酸標準工作液。

1.3.4 標準曲線的制作

按表2順序加入水、標準曲線工作液和葉酸測定用培養(yǎng)基于培養(yǎng)管中，一式三份。

表2 標準曲線的制作

1.3.5 樣品待測液的制作

按表3順序加水、樣品溶液和葉酸測定用培養(yǎng)基于培養(yǎng)管內，一式三份。每份樣品需帶樣品空白試管一只，管內分別加入5 mL待測液和5 mL培養(yǎng)基。

表3 待測液的制作

1.3.6 接種培養(yǎng)

將標準曲線培養(yǎng)管和樣品管與121曲滅菌5 min，取出后將試管迅速冷卻。根據(jù)各試驗項目接種對應的菌懸液50 μL至上述各試管中。將試管放入恒溫培養(yǎng)箱，在37±1 ℃培養(yǎng)20～40 h。

1.3.7 結果測定和計算

以樣品空白管作為空白，在550 nm下測定各試管吸光度（A）。以葉酸標準品含量為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線。

樣品中維生素含量按式（1）計算。

2 結果與分析

2.1 腐乳中葉酸含量分析

以葉酸含量為橫坐標，鼠李糖乳桿菌生長的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線見圖1。葉酸含量為0.0～1.0 ng時，回歸方程為y=（1.045 95）/[1+（x/0.322 56）-1.00040]+0.119 08，R2=0.996 48，微生物法對葉酸含量線性關系良好，可用于測定腐乳中葉酸含量。

圖1 微生物法測定葉酸的標準曲線

從市場上采集了24例腐乳樣品，分別是紅腐乳（7批次）、白腐乳（9批次）和臭腐乳（8批次）。由于葉酸是一種水溶性維生素，故利用微生物法對腐乳塊和樣品中鹵水葉酸含量分別進行了測定，結果見表4。

表4 腐乳樣品葉酸的含量 單位：μg/100 g

腐乳根據(jù)加工工藝主要分為三種類型：紅腐乳、白腐乳和臭腐乳。三種不同類型腐乳葉酸顯示出一定的差異：9例白腐乳樣品有4例未檢測到葉酸，平均葉酸含量為5.89 μg/100 g，7例紅腐乳有1例未檢測到葉酸，平均葉酸含量為7.22 μg/100 g，而臭腐乳中葉酸含量相比紅腐乳和白腐乳都高，8例臭腐乳均檢測到葉酸含量，且平均葉酸含量達到19.26 μg/100 g。葉酸是水溶性維生素，在對應的樣品鹵水中的檢測結果與腐乳塊結果基本一致，且比腐乳塊葉酸含量略高。

同一類型不同樣品的腐乳在葉酸含量上也存在顯著的差異性：在檢測到葉酸的白腐乳樣品中，各樣品中葉酸含量普遍不高，除樣品B7外，其余樣品均低于10 μg/100 g；與白腐乳相似，紅腐乳最高葉酸含量是樣品H4，達到15.7 μg/100 g，紅腐乳最高，最低的為樣品H3，含量為2.03 μg/100 g。臭腐乳中葉酸含量最高的樣品為C3，其含量達到了69.3 μg/100 g，其次是樣品C2，含量為21.7 μg/100 g，最低的是樣品C4，含量為4.26 μg/100 g。

2.2 討論

傳統(tǒng)發(fā)酵食品腐乳在中國的消費習慣有著悠久的歷史，含有多種對人體有益的營養(yǎng)價值及特有的功能性成分。文章利用微生物法對腐乳中葉酸含量的測定發(fā)現(xiàn)臭腐乳中的葉酸含量比紅腐乳和白腐乳高，該結果與本課題組之前對腐乳中B12含量的研究結果相似[15]。

不同類型腐乳的主要區(qū)別在于后熟階段添加的鹵水不同，臭腐乳一般只添加一定比例的鹽水進行后熟階段的發(fā)酵，微生物種類更為復雜多樣，使得發(fā)酵更為徹底。在此階段臭腐乳中可能通過微生物的發(fā)酵作用最終積累了一定量的葉酸。

在發(fā)酵食品中已有報道，芽孢桿菌和腸桿菌屬[4]、魏斯氏菌屬和腸球菌屬[5]、乳桿菌屬和明串珠菌屬等[6-7]具有合成葉酸能力。對于臭腐乳中菌群結構研究表明，腐乳中的主要菌群有明串珠菌屬（Leuconostoc）和鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、四鏈球菌屬（Tetragenococcus）等[17]。李娜等[18]通過PCR-DGGE和純培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)腐乳中鑒定出7株乳酸菌，說明腐乳中蘊含著豐富的微生物資源。

3 結論

利用微生物法對不同類型腐乳葉酸含量進行了測定，結果發(fā)現(xiàn)臭腐乳中葉酸含量高于紅腐乳和白腐乳。此次試驗旨在為腐乳等相關發(fā)酵食品中葉酸的研究提供試驗方法和數(shù)據(jù)參考。