項(xiàng)愛麗，段曉然，梅汝蕃，湯思凝，鄭百芹*，王秋悅*

1. 唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心（唐山 063000）；2. 河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院/河北省預(yù)防獸醫(yī)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（秦皇島 066000）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活水平的提高、食品工業(yè)的現(xiàn)代化及動(dòng)物優(yōu)質(zhì)食品生產(chǎn)的需求，肉類摻假問題逐漸受到社會(huì)各方面的廣泛關(guān)注。

鑒別肉類摻假的方法有很多種，有基于形態(tài)學(xué)檢測(cè)、代謝物檢測(cè)、蛋白質(zhì)檢測(cè)[1-6]、核酸檢測(cè)等方法。感官鑒定在一定程度上會(huì)產(chǎn)生主觀差異，只能作為初步判別。組織學(xué)鑒定及顯微鏡檢查，僅能做出初步的定性檢測(cè)，不能做出定量判斷。光譜法、質(zhì)譜法對(duì)實(shí)驗(yàn)操作要求較高，操作繁瑣，因此其應(yīng)用于肉制品摻假鑒定也日益減少。電子鼻、電子舌等技術(shù)可通過羊肉的組織結(jié)構(gòu)及其特殊的氣味鑒別羊肉的真?zhèn)危矁H能做出定性鑒別，不能定量。色譜技術(shù)和電泳技術(shù)可以有效分離和鑒別肉類制品中的各種成分，在實(shí)踐中有參考價(jià)值，但操作繁瑣且相對(duì)昂貴、費(fèi)時(shí)，不便日常樣品分析。免疫學(xué)方法由于蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性較弱，加熱過程中蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生變性，導(dǎo)致免疫學(xué)方法在肉類摻假檢測(cè)方面也存在一定局限性。

基于核酸檢測(cè)技術(shù)的PCR檢測(cè)方法對(duì)摻假鑒定比較成熟，這種鑒別方法最為權(quán)威，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高、用時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，因而在羊肉摻假檢測(cè)方面得到廣泛應(yīng)用。主要對(duì)基于核酸檢測(cè)技術(shù)的幾種常用的PCR檢測(cè)方法對(duì)羊肉制品摻假檢測(cè)進(jìn)行介紹。

1 摻假羊肉及肉制品基于核酸檢測(cè)技術(shù)的PCR檢測(cè)方法

1.1 普通PCR

普通PCR技術(shù)在食品領(lǐng)域最早被用于有害微生物的檢測(cè)。郭鳳柳等[7]使用該方法對(duì)5種動(dòng)物進(jìn)行肉源成分的檢測(cè)，其中采集的羊肉樣品共56份，摻假率達(dá)75%，結(jié)果顯示檢測(cè)濃度可達(dá)到pg，甚至部分可達(dá)fg。Bhat等[8]針對(duì)線粒體cytB設(shè)計(jì)引物，采用多重PCR方法對(duì)羊肉中2種肉類（牛肉、水牛肉）摻假進(jìn)行鑒別，設(shè)計(jì)多重PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)中使用優(yōu)化好的反應(yīng)條件以及反應(yīng)體系進(jìn)行PCR，得到了預(yù)期效果，熟羊肉的比例從20%降低到1%，其條帶亮度與純羊肉相似。在混合肉樣中，牛和水牛cyt B基因片段的條帶強(qiáng)度隨著其在熟羊肉Rista中的比例從20%下降到1%而呈進(jìn)行性下降。但仍可以準(zhǔn)確檢測(cè)，羊肉摻假鑒別檢測(cè)限低至1%（W/W）。Jia等[9]基于線粒體16S rRNA設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物，采用多重PCR方法對(duì)羊肉摻假分子進(jìn)行鑒定，成功鑒別出混合肉中的各種類肉成分，同時(shí)為了檢測(cè)混合比例對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，進(jìn)行不同比例混合肉的檢驗(yàn)，均能準(zhǔn)確地檢測(cè)出其肉源成分。Nagappa等[10]針對(duì)羊的線粒體D環(huán)的一個(gè)獨(dú)特靶區(qū)設(shè)計(jì)引物，采用高度種屬PCR的方法對(duì)羊肉進(jìn)行摻假鑒別，對(duì)生的以及不同程度熱處理的羊肉進(jìn)行PCR檢測(cè)，在不高于121 ℃的高溫下，均可在羊肉中提取出理想的DNA，此外，該方法的靈敏度為0.1%，綿羊DNA的檢測(cè)限低至1 pg。普通PCR靈敏度高，特異性強(qiáng)，但相對(duì)耗時(shí)較長(zhǎng)，因反應(yīng)不是在閉管內(nèi)進(jìn)行的，還存在一定的污染概率。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)際是對(duì)核酸的定量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR主要包括Taq和SYBR Green兩大類。通過向反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，在PCR指數(shù)擴(kuò)增過程中連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)特異性產(chǎn)物的數(shù)量，通過目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析[11]。凌睿等[12]以MY為通用引物，利用SYBR Green實(shí)時(shí)PCR方法對(duì)市場(chǎng)中常見的肉類（豬、牛、山羊、綿羊、鴨、雞）進(jìn)行DNA提取檢測(cè)，成功地檢測(cè)出各肉類DNA，并對(duì)含1%豬肉的模擬樣品摻假羊肉類進(jìn)行檢測(cè)，豬肉的檢出限為0.1 ng，對(duì)含有0.1%羊肉的模擬樣品摻假豬肉進(jìn)行檢測(cè)，亦可檢出羊肉成分，其檢出限為0.01 ng。顧文佳等[13]以羊的線粒體細(xì)胞色素B基因?yàn)樘禺愋曰?，?2S rRNA為內(nèi)摻基因，采用熒光定量PCR檢測(cè)冷凍羊肉卷中羊肉的相對(duì)含量，同時(shí)與稱重法進(jìn)行了比較。徐瑗聰?shù)萚14]以線粒體細(xì)胞色素B基因?yàn)榘谢?，采用?shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)豬、牛、羊肉的摻假情況進(jìn)行檢測(cè)，成功檢測(cè)出火腿腸、牛肉粒、綿羊肉泡饃中的豬肉、牛肉、羊肉成分，對(duì)豬、牛、羊3種肉類的最低檢出限分別為5，5和50 pg，其對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)分別約1.69，1.52和17.5。劉國(guó)強(qiáng)等[15]通過探針法對(duì)鴨源性摻假進(jìn)行檢測(cè)，可檢出含1%的鴨肉與羊肉混合物中的鴨源成分，對(duì)鴨源成分檢測(cè)限可達(dá)10 fg。熒光定量PCR，自動(dòng)化程度高，特異性強(qiáng)，靈敏度高，具有實(shí)時(shí)性及高定性、定量判斷[16]。但實(shí)時(shí)熒光定量操作要求嚴(yán)格，價(jià)格相較普通PCR昂貴。

1.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）方法是一種在等溫溫度下擴(kuò)增靶DNA的新方法。該方法依賴于4個(gè)特異性引物——內(nèi)引物（FIP和BIP）和外引物（F3和B3），識(shí)別靶DNA的6個(gè)不同區(qū)域[17]。也可以通過向反應(yīng)混合物中加入SYBR Green I染料目視測(cè)定LAMP反應(yīng)，在存在LAMP擴(kuò)增子的情況下，溶液的顏色變?yōu)榫G色，但在無擴(kuò)增的混合物中保持橙色[18]。目前LAMP已被用于檢測(cè)細(xì)菌、病毒、寄生蟲和轉(zhuǎn)基因生物等研究中。陳珍金等[19]以大鼠線粒體COX基因KP244683.1及小鼠16S rRNA 基因KY018919.1為靶基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物，首次通過LAMP法進(jìn)行羊肉制品中鼠源性成分鑒定檢測(cè)，成功檢測(cè)出羊肉串、羊肉卷中的鼠源性成分，檢出率達(dá)100%，并對(duì)檢出限進(jìn)行檢測(cè)，大鼠檢出限達(dá)0.1%（W/W），小鼠檢出限達(dá)0.5%（W/W）。邵長(zhǎng)春等[20]以豬ND1、牛COXI、羊cytB為靶基因設(shè)計(jì)特異性引物，通過LAMP檢測(cè)豬牛羊源性成分，結(jié)果表明豬、羊、牛源性成分的檢出限為0.01%（W/W），豬、羊源性成分檢測(cè)靈敏度為10 pg，牛源性成分檢測(cè)靈敏度為1 pg。柳海賓等[21]以鴨cytB為靶基因設(shè)計(jì)特異性引物，將LAMP與免疫層析試紙條（ICTS）技術(shù)相結(jié)合，檢出限為0.01%（W/W），用LAMP-ICTS方法檢測(cè)的市售樣品羊肉中鴨源性成分的結(jié)果與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)出的結(jié)果一致，且LAMPICTS檢測(cè)方法可在40 min內(nèi)檢測(cè)出結(jié)果。LAMP方法有顯著的靈敏度高、特異性、快速和易于操作的優(yōu)點(diǎn)，使DNA在等溫條件下有效擴(kuò)增，無需復(fù)雜、昂貴的熱循環(huán)儀和信號(hào)檢測(cè)的后擴(kuò)增程序[22]，檢測(cè)限可達(dá)到幾個(gè)拷貝。但環(huán)節(jié)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)需要設(shè)計(jì)較多的引物，操作相對(duì)復(fù)雜。

1.4 數(shù)字PCR技術(shù)

數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是近20年興起的第3代PCR技術(shù)。它是根據(jù)傳統(tǒng)PCR原理與泊松統(tǒng)計(jì)分布（Poisson distribution）設(shè)計(jì)的新型PCR技術(shù)[23]。陳傳君等[24]以羊、牛單烤貝生長(zhǎng)激素基因GH為特異性基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，采用微滴式數(shù)字PCR方法檢測(cè)羊等肉制品中的鴨源性成分，通過向樣品中添加牛肉作為內(nèi)標(biāo)，通過DNA拷貝數(shù)與質(zhì)量間的線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)拷貝數(shù)與質(zhì)量間的轉(zhuǎn)換。羊肉成分為0.01時(shí)，拷貝數(shù)可達(dá)0.12 copies/μL。能夠檢測(cè)出樣品中含有5%以上的羊源性成分。陳晨等[25]根據(jù)羊和豬的單烤貝基因設(shè)計(jì)引物與探針，驗(yàn)證肉的質(zhì)量與DNA濃度及DNA拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，建立檢測(cè)肉制品中豬源及羊源性成分含量的鑒別方法，通過檢測(cè)肉制品中羊肉以及豬肉的拷貝數(shù)即可推斷出肉的質(zhì)量。王珊等[26]通過3份羊肉制品檢測(cè)對(duì)比微滴式數(shù)字PCR與熒光定量PCR的檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，熒光定量方法通過Ct值來粗略判斷DNA的含量，微滴式數(shù)字PCR方法通過檢測(cè)出的拷貝數(shù)計(jì)算出羊源及豬源性成分含量。數(shù)字PCR特異性強(qiáng)、靈敏度高、耗時(shí)短，檢測(cè)限可達(dá)到拷貝數(shù)級(jí)別。但操作復(fù)雜，且需要昂貴的儀器及探針。

1.5 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性-PCR（PCR-RFLP）是一種用特異性內(nèi)切酶將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切割成不同大小的片段，得到解析圖譜的鑒定方法。PCR-RFLP在成本、檢測(cè)能力、適用性等方面被視為最高效的方法之一。Kumar等[27]以cytB為目的基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性正反向引物，使用PCR-RFLP檢測(cè)法，鑒別5種常見食用動(dòng)物的肉類。用AluI和TaqI限制性內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的目的片段，鑒定樣品中的水牛肉、牛肉、綿羊肉、山羊肉和豬肉成分，限制性內(nèi)切酶AluI在綿羊中得到大小為259和350 bp的2個(gè)片段，但不能裂解山羊PCR產(chǎn)物。TaqI限制性內(nèi)切酶在山羊中得到大小為43，131，163和272 bp的4個(gè)片段，且每個(gè)種屬的AluI和TaqI獨(dú)特限制性酶切模式都可很好地鑒定所有5種食用動(dòng)物種屬，但其耗時(shí)較長(zhǎng)，幾乎需要24 h。Mahajan等[28]根據(jù)MT 12S rRNA基因作為靶標(biāo)設(shè)計(jì)通用引物，對(duì)不同混合比例的水牛、牛、綿羊、山羊肉進(jìn)行檢測(cè)，僅用AluI限制性內(nèi)切酶消化無法區(qū)分綿羊和山羊，同時(shí)使用BspTI和ApoI這2種限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)物可以區(qū)分綿羊肉和山羊肉。在BspTI酶消化物中，在山羊樣品中觀察到323和133 bp的2個(gè)片段，在綿羊樣品中未觀察到切割，當(dāng)所有組合中混合物比例為75∶25時(shí)，該技術(shù)仍可區(qū)分動(dòng)物種屬。PCR-RFLP檢測(cè)是區(qū)分密切相關(guān)種屬（如牛/水牛和綿羊/山羊）的有效方法，該方法具有較高的精密度和專屬性，且花費(fèi)較少。但該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，不適用于現(xiàn)場(chǎng)肉類摻假檢測(cè)。

2 討論

近年來，肉類摻假檢測(cè)技術(shù)發(fā)展越來越迅速。在試驗(yàn)過程中，研究人員使用多種技術(shù)對(duì)肉類摻假進(jìn)行檢測(cè)，每種技術(shù)都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)?；贒NA的物種鑒定技術(shù)逐漸取代其他傳統(tǒng)技術(shù)，這是因?yàn)镈NA分子存在于個(gè)體的任何組織中，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、較耐高溫，在不高于121 ℃的情況下穩(wěn)定性也較強(qiáng)。因此，使用基于DNA的方法提高了檢測(cè)的特異性及靈敏度。普通PCR方法操作簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，可以檢測(cè)到微量的摻假數(shù)量，但檢測(cè)數(shù)量不能精確到具體的拷貝數(shù)量，且存在一定的感染可能性；實(shí)時(shí)熒光定量PCR由于是在閉管中進(jìn)行檢測(cè)的，降低了污染的可能性，可檢測(cè)出肉類摻假物種及數(shù)量，但其需要昂貴的儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求較嚴(yán)格；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)無需昂貴的儀器，僅需一個(gè)水浴鍋，在40 min左右即可完成檢測(cè)，耗時(shí)短，且對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境及儀器沒有嚴(yán)格要求，也可通過向反應(yīng)混合物中加入SYBR Green I染料目視測(cè)定LAMP反應(yīng)，但沉淀物可視化的難度高，尤其是在較低的目標(biāo)DNA濃度和交叉污染的高風(fēng)險(xiǎn)下，可能限制LAMP檢測(cè)的有用性，且其引物設(shè)計(jì)及篩選工作量較大、較繁瑣；數(shù)字PCR根據(jù)質(zhì)量與DNA拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，即可精確檢測(cè)出肉制品的摻假的拷貝數(shù)，特異性強(qiáng)，靈敏度高，耗時(shí)短，但對(duì)實(shí)驗(yàn)操作要求較高，操作繁瑣；限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)物種，其靈敏度高，專屬性強(qiáng)，花費(fèi)少，但其耗時(shí)較長(zhǎng)。隨著技術(shù)的發(fā)展，建立一種耗時(shí)短、花費(fèi)少、靈敏度高的檢測(cè)方法是肉類產(chǎn)假行業(yè)的必然之事，隨著肉制品摻假檢測(cè)技術(shù)的逐步成熟，肉制品摻假必將寸步難行。

3 結(jié)語(yǔ)

PCR法在肉類科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究越來越多，因?yàn)樵摷夹g(shù)具有應(yīng)用迅速而無需進(jìn)一步樣品制備的優(yōu)點(diǎn)。許多研究表明，分子生物學(xué)PCR法是一種強(qiáng)大的分析工具，可以通過確認(rèn)種屬的真實(shí)性，在增加消費(fèi)者對(duì)肉類和最終肉制品的信心中發(fā)揮作用，特別適用于定性及定量檢測(cè)。因此，可能在肉類摻假檢測(cè)中替代基于形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法、基于代謝物檢測(cè)方法、基于蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。但該方法目前主要是用于定性檢測(cè)，對(duì)于定量檢測(cè)還不普遍。隨著科學(xué)的飛速發(fā)展，相信PCR法與其他方法進(jìn)行有機(jī)的結(jié)合使用也是指日可待的，肉類摻假檢測(cè)方法將會(huì)有更大的發(fā)展空間。