韓平安，孫瑞芬，唐寬剛，常悅，王良，金曉蕾，梁亞暉，李曉東，吳新榮

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)甜菜品種遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，呼和浩特 010031）

0 引言

食糖是人們?nèi)粘Ｉ畹闹匾M品。2019/2020 年榨季全國食糖僅從產(chǎn)量和消費量來看，產(chǎn)需差額400余萬t，2020/2021 年榨季預(yù)計國際市場供給短缺350萬t～380 萬t，國內(nèi)糖市“產(chǎn)穩(wěn)需增”[1]。我國食糖消費呈增長態(tài)勢，年均增速約3%，食糖供給每年缺口近500 萬t[2]。甜菜糖是食糖重要組成部分，甜菜（Beta vulgarisL.）是我國重要糖料作物之一，是確保我國食糖安全的重要戰(zhàn)略物資[3]，也是潛在的能源作物[4]。甜菜具有喜溫涼、耐瘠薄、耐鹽堿、適應(yīng)性廣的特點，是東北、西北、華北地區(qū)重要特色經(jīng)濟作物[5]。近年來，隨著國家政策的支持及國家糖料產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系的啟動，我國甜菜產(chǎn)業(yè)取得了長足進展，但與發(fā)達國家相比，仍存在甜菜種質(zhì)資源匱乏，原創(chuàng)性種質(zhì)不足，自育品種少等問題[6-7]。因此，利用基因工程技術(shù)手段創(chuàng)制高產(chǎn)甜菜種質(zhì)資源，對推進我國甜菜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展、確保食糖有效供給具有重要意義。

光合作用是植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)。景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶（SBPase）是卡爾文循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶，主要負(fù)責(zé)CO2分子受體核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）的再生，是植物光合作用途徑的主要限速酶之一[8]，因此，SBPase 對卡爾文循環(huán)的碳源流通具有十分重要的意義。眾多研究表明，SBPase 能夠提高植物的光合性能，促進光合效率的提高，是一種可以利用基因工程技術(shù)提高植物碳同化效率的酶類[9]。在煙草中過表達擬南芥SBPase基因，可以促進煙草植株生長，提高光合能力[10]。增強小麥SBPase 活性可以提高小麥的光合作用與籽粒產(chǎn)量[11]。轉(zhuǎn)基因番茄中，高水平的SBPase活性可增強番茄植株的光合作用，提高其耐冷性[12]。敲除番茄SlSBPASE基因后，突變體植株表現(xiàn)出嚴(yán)重的生長遲緩，SBPase 活性顯著降低，從而顯著抑制了RuBP的再生和碳同化速率，導(dǎo)致突變體植株的蔗糖和淀粉積累量較野生型植株低很多[13]。在水稻上鑒定到一個低分蘗突變體c6635，該突變體在生長初期葉片呈淡綠色，色素含量和光合能力急劇下降；成熟期有效穗數(shù)、粒數(shù)和結(jié)實率顯著降低，籽粒產(chǎn)量急劇減少。通過圖譜克隆、MutMap 分析和互補實驗證實，SBPase基因的一個單核苷酸突變是c6635突變表型的主要原因[14]。目前，有關(guān)甜菜光合碳固定方面的研究主要集中在栽培措施對甜菜產(chǎn)量的影響[15-19],而關(guān)于SBPase基因?qū)ζ涔夂咸脊潭爱a(chǎn)量的影響未見報道。本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將擬南芥SBPase基因轉(zhuǎn)入甜菜中獲得了分子檢測合格的轉(zhuǎn)基因植株，通過數(shù)字PCR 檢測篩選到了低拷貝轉(zhuǎn)基因株系，為探索甜菜塊根產(chǎn)量形成機理，創(chuàng)制具有高產(chǎn)潛力的甜菜種質(zhì)材料奠定了基礎(chǔ)，同時也為加強SBPase基因在作物高產(chǎn)育種上的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甜菜（Beta vulgarisL.）品系‘44176’無菌苗、植物表達載體pBWA(V)K、EHA105 農(nóng)桿菌菌株由甜菜分子育種課題組保存。通過Primer 5.0 設(shè)計SBPase基因的特異引物，內(nèi)參基因GS檢測引物參照劉二龍等[20]。引物由南京金斯瑞公司合成，序列如表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2 目的基因擴增

人工合成擬南芥啟動子AtRBCS（X14564）和擬南芥SBPase（NM_115438）堿基序列，并根據(jù)該序列分別設(shè)計特異引物F1/R1和F2/R2，同時引入AarI酶切位點（見表1）。通過PCR 擴增AtRBC和SBPase片段，以構(gòu)建AtRBCS 驅(qū)動SBPase基因的植物表達載體。兩對引物的PCR 擴增體系（50 μL）：PCR Buffer 5μL，dNTPs Mixture 2 μL，上、下游引物各2 μL，Taq 2 μL，模板（人工合成序列DNA）1 μL，ddH2O 34 μL；PCR 擴增程序：94 ℃5 min；94 ℃30 s，50 ℃45 s，72 ℃90 s，30個循環(huán)；72 ℃10 min，16 ℃30 min。

1.3 連接轉(zhuǎn)化與鑒定

將引物F1/R1 擴增的AtRBCS（1 508 bp）和引物F2/R2 擴增的SBPase（1 182 bp）的電泳片段切下，放在同一個體系中進行溶膠回收DNA（AtRBCS-SBPase），用30μL ddH2O溶解回收AtRBCS-SBPase。用AarI分別酶切AtRBCS-SBPase 和載體pBWA(V)K，酶切反應(yīng)體系（20μL）：Buffer 2μL，AarI 1μL，AtRBCS-SBPase 4μL，ddH2O 13μL；Buffer 2μL，AarI 1μL，pBWA(V)K 4μL，ddH2O 13μL。37 ℃1 h。酶切產(chǎn)物純化回收后，用T4-ligase 將其連接，反應(yīng)體系（10 μL）：Buffer 1μL，載體酶切產(chǎn)物1μL，AtRBCS-SBPase 酶切產(chǎn)物5μL，T4-ligase 1μL，ddH2O 2μL，20 ℃2 h。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。待菌落出現(xiàn)后，用引物F3/R3 進行PCR 檢測AtRBCS-SBPase 轉(zhuǎn)化陽性克隆并測序，與人工合成序列進行比對。提取測序正確的陽性克隆質(zhì)粒并采用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，挑選大小一致菌落提取質(zhì)粒DNA，用EcoRV進行酶切鑒定。

1.4 菌液的制備

挑取酶切鑒定正確的農(nóng)桿菌單菌落于加有Kan（100 mg/L）的YEB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃黑暗條件下，200 r/min 振蕩培養(yǎng)16～20 h后，將菌液置于離心管中，5 000 r/min離心5 min 收集菌體，重新懸浮菌液，OD600值為0.4～0.5，備用。

1.5 侵染和共培養(yǎng)

將在分化培養(yǎng)基（MS+6-BA 1 mg/L+水解酪蛋白200 mg/L+瓊脂7 g/L，pH 值為5.8，pH 值下同）上預(yù)培養(yǎng)7 d左右的甜菜葉柄放于農(nóng)桿菌菌液中，置于搖床上，28 ℃侵染20 min后，用濾紙吸去多余菌液，將葉柄接種在共培養(yǎng)基（MS+6-BA 1 mg/L+水解酪蛋白200 mg/L+AS 300μmol/L+瓊脂7 g/L）上，25 ℃暗培養(yǎng)3 d。

1.6 抗性篩選與植株再生

葉柄與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)3 d后，轉(zhuǎn)移到含有Kan（50 mg/L）的篩選培養(yǎng)基（MS+6-BA 1 mg/L+水解酪蛋白200 mg/L+頭孢250 mg/L+Kan 50 mg/L+瓊脂7 g/L）中培養(yǎng)，每隔7 d轉(zhuǎn)接1次。當(dāng)叢生芽長至0.5～1 cm時，將其從外植體上切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（MS+NAA 1 mg/L+瓊脂7 g/L）中誘導(dǎo)生根。

1.7 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測

切取卡那抗性植株幼葉，利用高通量核酸提取儀（KingFisher Flex,Thermo Fisher）提取基因組DNA，具體步驟按磁珠法植物DNA 提取試劑盒說明書進行。以DNA 為模板，用特異引物F4/R4進行SBPase基因擴增，以檢測SBPase基因的整合情況。PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序同1.2。

1.8 轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR檢測

取陽性無菌苗葉片提取總RNA，利用微量紫外分光光度計（NanoDrop 2000）測定其濃度，并將其稀釋為200 ng/μL，用RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。RNA 的提取和cDNA 的合成按照TakaRa公司RNA 試劑盒和M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書進行。以cDNA 為模板，甜菜GS基因為內(nèi)參基因（引物為F6/R6），用引物F5/R5（表1）進行PCR擴增以檢測SBPase基因在甜菜植株中的表達情況。

1.9 轉(zhuǎn)基因植株啟動子拷貝數(shù)檢測

利用數(shù)字PCR（ddPCR）技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因植株中SBPase基因的拷貝數(shù)。首先對SBPase和內(nèi)參基因GS（AY026353.1，甜菜單拷貝基因）擴增引物的特異性進行檢測，之后用特異引物F5/R5（表1）對RT-PCR 檢測陽性植株進行SBPase基因插入拷貝數(shù)檢測。ddPCR 擴增體系（25μL）：2xPerfeCTa Qpcr ToughMixUNG 5μL，Alexa FluorTM647 1 μL，EvaGreen20xin water 2 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板2 μL，ddH2O 14.2 μL。將25μL 反應(yīng)液加入芯片，于數(shù)字PCR 儀（Naica，Stilla Techn Logieso，F(xiàn)rance）上進行擴增反應(yīng)，擴增程序為94 ℃5 min；95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，40 個循環(huán)；72 ℃5 min，每個樣品進行3 次平行重復(fù)試驗。擴增反應(yīng)完畢后，將芯片放入微滴讀取儀，依據(jù)熒光信號的有無對陽性微滴和陰性微滴進行判定讀值。利用軟件Crystal Reader對數(shù)據(jù)進行分析，得到核酸絕對定量結(jié)果。外源基因拷貝數(shù)為外源基因濃度/內(nèi)參基因濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段獲得

用特異引物F1/R1 和F2/R2 進行啟動子AtRBCS 和SBPase基因的PCR 擴增，分別獲得約1 500 bp 和1 200 bp條帶，與預(yù)期大小一致（圖1）。

圖1 目的基因擴增Fig.1 Amplification of target gene

2.2 重組載體獲得

目的片段（AtRBCS-SBPase）與載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，隨機挑取3個單菌落進行PCR 檢測，獲得預(yù)期大小（1 036 bp）條帶（圖2）。將陽性克隆測序后與人工合成序列比對，證實獲得序列完全正確。將測序正確質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，提取質(zhì)粒進行序列測定，證明目的片段已插入到表達載體中，將重組載體命名為pBWA(V)K-AtRBCS-SBPase-NOS（10 629 bp，見圖3）。

圖2 菌落PCR檢測電泳圖Fig.2 Colony electrophoretogram of PCR detection

圖3 重組載體結(jié)構(gòu)簡圖Fig.3 Structure diagram of recombinant carrier

2.3 抗性植株獲得

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甜菜葉柄，共培養(yǎng)3 d 后，將葉柄移入篩選培養(yǎng)基（含Kan 50 mg/L）中誘導(dǎo)芽分化，當(dāng)叢生芽長至0.5～1 cm 時，將其從葉柄上切下進行生根培養(yǎng)，獲得抗性植株，待根系長至2～3 cm 時移栽至花盆中（圖4）。

圖4 甜菜的遺傳轉(zhuǎn)化Fig.4 Genetic transformation of sugar beet

2.4 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR 檢測

隨機取8株抗性植株進行SBPase基因的擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得預(yù)期大?。?08 bp）條帶（圖5），初步判斷目的基因已整合到甜菜染色體基因組中。

圖5 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測Fig.5 PCR detection of transgenic plants

2.5 轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR檢測

以GS基因為內(nèi)參基因，對PCR 檢測陽性植株進行SBPase基因的RT-PCR 檢測。結(jié)果顯示，8 個陽性植株均獲得預(yù)期大小條帶（圖6），表明該基因在RNA水平上獲得表達。擴繁RT-PCR 檢測陽性植株。

圖6 轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR檢測Fig.6 RT-PCR detection of transgenic plants

2.6 SBPase基因拷貝數(shù)檢測

為了利于轉(zhuǎn)基因植株純合，通過ddPCR 技術(shù)對PCR 檢測陽性植株進行SBPase基因插入拷貝數(shù)鑒定，以篩選低拷貝轉(zhuǎn)基因植株。首先以甜菜GS基因為內(nèi)參基因，檢測SBPase擴增引物的特異性和ddPCR重復(fù)性。圖7顯示，GS和SBPase對應(yīng)引物的陽性微滴（藍(lán)色帶）與陰性微滴（黑色帶）都能明顯區(qū)分開，表明SBPase引物的特異性較好。ddPCR 重復(fù)性分析結(jié)果顯示，所有樣品SBPase和GS基因的實驗有效微滴總數(shù)均介于25 000～28 000（表2），滿足微滴數(shù)字PCR 微滴的分析要求，實驗中生成微滴的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation,RSD）介于2%～6%（表2），小于25%，符合歐盟核酸定量檢測的要求，說明實驗中建立的微滴數(shù)字PCR 體系微滴生成穩(wěn)定，重復(fù)性良好，數(shù)據(jù)可靠性高。ddPCR 結(jié)果顯示，8株轉(zhuǎn)基因植株中有2株為低拷貝轉(zhuǎn)基因植株（樣品編號為2和3），拷貝數(shù)分別為1.3和1.6（表3）。

表2 ddPCR 重復(fù)性分析Table 2 Repeatability analysis of ddPCR

表3 轉(zhuǎn)基因植株SBPase 拷貝數(shù)分析Table 3 SBPase copy number analysis of transgenic plant

圖7 ddPCR引物特異性檢測Fig.7 Primer specificity detection of ddPCR

3 討論與結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，景天庚酮糖-1,7-二磷酸酯酶（SBPase）是卡爾文循環(huán)中參與光合碳固定的關(guān)鍵酶[12]，通過遺傳轉(zhuǎn)化手段在植物中過表達SBPase基因，調(diào)節(jié)光合作用、提高生物量，已在多種植物上得到了成功應(yīng)用。在衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中超表達SBPase，顯著增強過表達植株的光合速率[21]。在小麥中高表達二穗短柄草（Brachypodium distachyonL.）的SBPase基因，溫室條件下，轉(zhuǎn)基因植株葉片光合作用增強，總生物量和干種子產(chǎn)量增加[22]。在擬南芥上超表達楊樹SBPase基因，轉(zhuǎn)基因植株的葉面積更大，光合速率更快，產(chǎn)量更多，同時也提高了擬南芥的固碳能力[23]。本團隊前期將SBPase基因轉(zhuǎn)入煙草中，3個轉(zhuǎn)基因煙草株系植株的莖圍、葉長、凈光合速率均顯著高于野生型煙草[24]。迄今，SBPase基因在甜菜中的過表達研究未見報道。本研究成功獲得SBPase轉(zhuǎn)基因甜菜植株，后期擬對轉(zhuǎn)基因植株光合特性、農(nóng)藝性狀等進行測定。

本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對甜菜葉柄進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了SBPase低拷貝插入的轉(zhuǎn)基因甜菜植株，為探索甜菜產(chǎn)量形成機理，創(chuàng)制高產(chǎn)新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。