房旭，劉維賢

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院口腔頜面外科，沈陽 110004）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）占口腔癌的95%以上［1］，具有很強(qiáng)的復(fù)發(fā)、侵襲、轉(zhuǎn)移能力［2］。盡管近年來在診斷和治療方面取得了一些進(jìn)展，但OSCC患者的5年生存率仍低于50%［3］，未能早期診斷是導(dǎo)致高死亡率的重要原因。因此，探索OSCC的發(fā)生機(jī)制是指導(dǎo)OSCC診斷和治療的重點(diǎn)。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種內(nèi)源性非編碼RNA，由前體mRNA反向剪接產(chǎn)生，具有可區(qū)分的單鏈，共價閉環(huán)，缺乏5’-3’極性等特點(diǎn)［4］。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使circRNA廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)中，并對外切酶更具抵抗力，比線性RNA更穩(wěn)定［5］。研究［6-7］表明，circRNA作為微RNA（microRNA，miRNA）分子的海綿具有巨大的潛力，以互補(bǔ)的堿基配對方式抑制miRNA活性，從而促進(jìn)下游靶基因的翻譯和穩(wěn)定性。這種circRNA/miRNA/mRNA信號軸已被證明可在各種生理和病理?xiàng)l件下發(fā)揮多種功能［8-10］。已有研究［11］通過基因篩選發(fā)現(xiàn)，與子宮內(nèi)膜癌旁組織相比，子宮內(nèi)膜癌中hsa_circ_0009043表達(dá)顯著下調(diào)，但它在OSCC中的表達(dá)情況尚不明確。

本研究擬探討hsa_circ_0009043在OSCC組織中的表達(dá)情況，并結(jié)合相關(guān)病理因素分析其在OSCC發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本：收集2018年6月至2020年12月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院口腔頜面科接受手術(shù)治療的48例OSCC患者的腫瘤及癌旁組織。所有患者術(shù)前均未接受過放化療等治療，且均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為OSCC。所有組織離體后立即置于液氮中，冷凍保存?zhèn)溆?。所有患者均簽署知情同意書。本研究獲得中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 細(xì)胞：OSCC細(xì)胞系SCC-9、SCC-15、CAL-27購自上海西寶生物科技有限公司。正常人口腔角質(zhì)細(xì)胞（human oral keratinocytes，HOK）購自上海酶聯(lián)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）：用TRIzol試 劑盒獲得組織和細(xì)胞的總RNA。采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用Light Cycler 480ⅡReal-Time PCR系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR檢測。GAPDH作為內(nèi)參照。GAPDH正向引物序列為5’-CAGGAG GCATTGCTGATGAT-3’，反向引物序列為5’-GAAG GCTGGGGCTCATTT-3’；hsa_circ_0009043正向引物序列為5’-TGGTGGACAACATCCCCAAG-3’，反向引物序列為 5’-ACTTGATTTTGCTTCATGGCAGT-3’。

1.2.2 hsa_circ_0009043功能富集分析及circRNA/miRNA/mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：對hsa_circ_0009043進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集通路分析，P＜ 0.05表示富集結(jié)果顯著。利用Mireap軟件、Miranda（http：//www.microrna.org/microrna/home.do）和TargetScan（http：//www.targetscan.org）數(shù)據(jù)庫預(yù)測下游miRNA，并利用miRTarBase 數(shù)據(jù) 庫（http：//mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/index.html）預(yù)測miRNA靶標(biāo)mRNA，進(jìn)而構(gòu)建circRNA/miRNA/mRNA網(wǎng)絡(luò)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0和GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用t檢驗(yàn)比較OSCC組織與配對的癌旁組織中hsa_circ_0009043表達(dá)水平的差異。通過非參數(shù)檢驗(yàn)評估hsa_circ_0009043表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。通過受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估hsa_circ_0009043的診斷價值。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hsa_circ_0009043在組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況

qRT-PCR結(jié)果顯示，OSCC細(xì)胞系SCC-9和CAL-27中hsa_circ_0009043表達(dá)水平較正常HOK顯著降低（P＜ 0.01；P＜ 0.001），見圖1A；OSCC組織中hsa_circ_0009043表達(dá)水平［5.117（3.722～6.933）］較癌旁組織［3.849（2.945～5.088）］顯著降低（P＜ 0.001），見圖1B。

圖1 hsa_circ_0009043在OSCC組織及細(xì)胞中低表達(dá)Fig.1 Decreased expression of hsa_circ_0009043 in OSCC tissues and OSCC cells

2.2 hsa_circ_0009043表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性

如表1所示，臨床病理特征分析結(jié)果顯示，hsa_circ_0009043的表達(dá)水平與腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P=0.01，P=0.037），與是否吸煙、飲酒等則無相關(guān)性。

表1 hsa_circ_0009043表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between hsa_circ_0009043 expression levels and patients’ clinical pathological characteristics

2.3 hsa_circ_0009043對OSCC的診斷價值

ROC曲線評估結(jié)果顯示，hsa_circ_0009043的ROC曲線下面積（area under curve，AUC）為0.6769（P＜ 0.01，95%CI：0.570 0～0783 7），見圖2。

圖2 hsa_circ_0009043診斷OSCC的ROC曲線Fig.2 The ROC curve of OSCC diagnosis by hsa_circ_0009043

2.4 circRNA/miRNA/mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測

為了探索hsa_circ_0009043的潛在功能，對目標(biāo)基因進(jìn)行了GO及KEGG富集分析。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，在分子功能、細(xì)胞組分及生物學(xué)過程中富集最強(qiáng)烈的分別是磷脂酰肌醇3-磷酸酶活性、被膜小泡及血管生成，見圖3A。KEGG富集分析的前10個條目顯示hsa_circ_0009043可能與多種腫瘤存在相關(guān)性，如肝癌、非小細(xì)胞肺癌等，見圖3B。為了進(jìn)一步確定hsa_circ_0009043的分子機(jī)制，構(gòu)建了circRNA/miRNA/mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，hsa_circ_0009043可能與hsa-miR-148b-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-7-5p和hsa-miR-152-3p相互作用，并間接調(diào)控61個靶基因，見圖3C。

圖3 hsa_circ_0009043的潛在功能分析Fig.3 Potential functional analysis of hsa_circ_0009043

3 討論

circRNA是一種可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼RNA［12］，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制密切相關(guān)［13-15］。有研究［16］發(fā)現(xiàn)，circRNA的差異表達(dá)與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期等臨床病理特征顯著相關(guān)。因此，circRNA的出現(xiàn)為探索腫瘤發(fā)病機(jī)制和尋找癌癥的潛在生物標(biāo)志物提供了新的方向。與其他惡性腫瘤一樣，OSCC的發(fā)生發(fā)展也是涉及編碼和非編碼基因的復(fù)雜生物學(xué)過程［17］。識別臨床相關(guān)的OSCC特異性circRNA，并檢測其功能及對OSCC的調(diào)控作用是了解該疾病的關(guān)鍵。

本研究首次發(fā)現(xiàn)在OSCC組織和細(xì)胞系中，hsa_circ_0009043表達(dá)顯著下調(diào)。對臨床病理相關(guān)資料的分析發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0009043的表達(dá)水平與腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。ROC曲線結(jié)果顯示，hsa_circ_0009043的表達(dá)與OSCC診斷具有相關(guān)性。提示hsa_circ_0009043是一種對OSCC的早期診斷和治療具有一定價值的新型生物標(biāo)志物。

為了探索hsa_circ_0009043與OSCC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，本研究還進(jìn)行了GO、KEGG富集分析，結(jié)果顯示，EGFR tyrosine kinase inhibitors與hsa_circ_0009043相關(guān)性最強(qiáng)，與已有研究［18］結(jié)果一致。以上結(jié)果均證實(shí)了hsa_circ_0009043在OSCC發(fā)生發(fā)展中的重要作用。

研究［19-20］表明，競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，CeRNA）在腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)張、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。circRNA可作為CeRNA參與調(diào)控腫瘤的CeRNA網(wǎng)絡(luò)［21-22］。本研究中，利用Target Scan、miRTarBase等數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建了hsa_circ_0009043/miRNA/mRNA網(wǎng)絡(luò)以預(yù)測hsa_circ_0009043可能發(fā)揮的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0009043可能與hsamiR-148b-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-7-5p和hsamiR-152-3p相互作用，并間接調(diào)控61個靶基因。說明hsa_circ_0009043可通過miRNA的海綿效應(yīng)促進(jìn)癌癥的進(jìn)展。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0009043在OSCC細(xì)胞系及組織中表達(dá)水平顯著下降，并與OSCC的臨床病理特征及診斷相關(guān)。同時，通過生物信息學(xué)分析，對hsa_circ_0009043參與OSCC的可能的分子機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測。因此，hsa_circ_0009043具有成為OSCC生物標(biāo)志物的潛力，但其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。