段書眾，馬思佳，于文會，王歡歡，張華，王景福

（承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎臟內科，河北 承德 067000）

研究顯示，慢性腎臟病患者血管鈣化的抑制和促進因素之間穩(wěn)態(tài)失衡，導致血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）向成骨細胞轉分化［1］，血管內膜、中膜及心臟瓣膜鈣化［2］。血管鈣化是心腦血管疾病的重要危險因素，與慢性腎衰竭患者心血管并發(fā)癥和全因死亡率相關［3］。研究［4］顯示高磷血癥是慢性腎臟病患者血管鈣化的決定性因素；高磷血癥導致血管鈣化的機制包括VSMC向成骨/軟骨細胞轉分化、凋亡小體形成、細胞外囊泡釋放、細胞外基質蓄積、炎性細胞因子釋放、氧化應激反應等。內質網(wǎng)應激參與VSMC凋亡，導致動脈粥樣硬化、高血壓、血管瘤和血管鈣化等血管疾?。?］。目前，仍無預防血管鈣化的有效手段，因此需要探索可能的藥物治療靶點［6］。內質網(wǎng)應激是否參與高磷誘導的VSMC鈣化鮮有報道。本研究探討內質網(wǎng)應激是否參與高磷誘導的血管鈣化過程及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及分組

人胸主動脈VSMC（美國ScienCell Research Laboratories）于含10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2、濕度70%～80%恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d更換1次培養(yǎng)液，第5～8代細胞用于實驗。設置對照組（正常培養(yǎng)）、磷正常濃度（1.3 mmol/L，NP）組、磷高濃度（2.6 mmol/L，HP）組、HP+SP600125組 ［應用c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）抑制劑SP600125（美國Sigma-Aldrich公司，10 μmol/L）預處理30 min后，高濃度磷（2.6 mmol/L）培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d］、HP+siCHOP組［（C/EBP homologous protein，CHOP）siRNA使CHOP基因沉默，高濃度磷（2.6 mmol/L）培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d］。

1.2 方法

1.2.1 茜素紅染色觀察各組VSMC鈣沉積：VSMC接種到6孔板中，生長至60%時，各組實施干預措施，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛4 ℃固定10 min，PBS沖洗3次，放入1%茜素紅S溶液內染色30 min，然后0.2%醋酸溶液快速沖洗1次，濾紙吸干后乙醇脫水，二甲苯固定、封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 實時定量PCR檢測各組內質網(wǎng)應激及鈣化相關基因表達：棄去培養(yǎng)瓶內上清液，PBS沖洗，TRIzol法提取總RNA。取RNA 1 μg，用反轉錄試劑盒逆轉錄獲得cDNA。以cDNA作為PCR擴增模板，按照說明書配比反應體系，以GAPDH為內參基因。引物序列：骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2），正向引物 5’-GGGACCCGCTGTCTTCTAGT-3’，反向引物5’-TCAACTCAAATTCGCTGAGGAC-3’；Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx-2），正向引物5’-ACTGTGGTTACCGTCATGGC-3’，反向引物 5’-ACTTGGTTTTTCATAACAGCGGA-3’；CHOP，正向引物5’-GGAAACAGAGTGGTCATTCC C-3’，反向引物5’-CTGCTTGAGCCGTTCATTCTC；RNA依賴的蛋白激酶樣內質網(wǎng)激酶（RNA-dependent protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK），正向引物 5’-ACGATGAGACAGAGTTGCGA C-3’，反向引物 5’-ATCCAAGGCAGCAATTCTCCC-3’；肌醇需求因子1（inositol-requiring enzyme1，IRE1），正向引物5’-CATCCCCATGCCGAAGTTCA-3’，反向引物 5’-CTGCTTCTCTCCGGTCAGGA-3’；GAPDH，正向引物 5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，反 向引物 5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。反應條件：預變性95℃、5 min；循環(huán)反應 95 ℃、15 s，60℃、30 s，共40個循環(huán)；溶解曲線95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s?；蛳鄬Ρ磉_量采用2-ΔΔCt法進行計算。

1.2.3 Western blotting檢測內質網(wǎng)應激蛋白CHOP、磷酸化PERK（phosphorylated PERK，p-PERK）、IRE1、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）及鈣化蛋白BMP-2、Runx-2表達：于75 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)各組VSMC，PBS洗滌3次，經(jīng)裂解液在4 ℃下裂解30 min，離心、取上清液，BCA試劑盒測定蛋白含量。SDS-PAGE電泳分離蛋白組分，轉至PVDF膜上5%脫脂奶粉封閉60 min，一抗［分別為抗CHOP（1 ∶1 000）、抗BMP-2（1 ∶1 000）、抗IRE1（1 ∶1 000）、抗p-PERK（1 ∶1 000）、抗p-JNK（1 ∶500）、抗Runx-2（1 ∶1 000）和抗-β-actin（1 ∶5 000）］孵育液內4 ℃過夜，TBST洗滌3次，與相應辣根過氧化物酶標記的二抗結合，室溫孵育1 h?；瘜W發(fā)光法顯色發(fā)光，全自動凝膠成像系統(tǒng)掃描、拍照，Image J軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組VSMC鈣沉積比較

結果顯示，對照組與NP組未見鈣化表現(xiàn)；HP組VSMC染成深紅色，提示存在細胞鈣化；HP+SP600125組鈣化較HP組明顯減輕，提示JNK誘導細胞凋亡參與了高磷誘導的VSMC鈣化；HP+siCHOP組VSMC鈣化較HP組減輕，提示CHOP誘導的VSMC凋亡也參與了高磷誘導的VSMC鈣化。見圖1。

圖1 各組VSMC鈣沉積比較Fig.1 Comparison of VSMC calcium deposition in each group

2.2 各組VSMC鈣化相關基因BMP-2、Runx-2和內質網(wǎng)應激相關基因IRE1、PERK、JNK、CHOP表達比較

結果顯示，與對照組比較，NP組VSMC相關基因BMP-2、Runx-2表達無明顯增加，提示正常濃度磷無誘導VSMC鈣化的作用；而HP組BMP-2、Runx-2表達較對照組及NP組明顯增高（P＜ 0.05），提示高濃度磷可誘導VSMC鈣化。與對照組及NP組比較，HP組內質網(wǎng)應激相關基因IRE1、PERK、JNK及CHOP表達均顯著增加（均P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 各組VSMC鈣化相關基因BMP-2、Runx-2，內質網(wǎng)應激相關基因IRE1、PERK、JNK、CHOP表達比較Fig.2 The expression of BMP-2，Runx-2，IRE1，PERK，JNK，and CHOP in each group

2.3 高磷導致VSMC內質網(wǎng)應激反應增強

結果顯示，與對照組及NP組比較，HP組內質網(wǎng)應激蛋白IRE1、p-PERK、CHOP、p-JNK表達均顯著增高（均P＜ 0.05），提示高磷培養(yǎng)細胞可增強內質網(wǎng)應激反應，并且同時激活了pPERK-CHOP和IRE1-p-JNK 2條途徑。見圖3。

圖3 各組內質網(wǎng)應激相關蛋白IRE1、p-PERK、JNK、CHOP表達Fig.3 Protein expression of IRE1，p-PERK，JNK，and CHOP in each group

2.4 抑制內質網(wǎng)應激信號傳遞可減輕高磷血癥導致的鈣化

Western blotting結果顯示，與對照組比較，CHOPsiRNA使CHOP基因沉默后凋亡蛋白CHOP表達下調，說明轉染成功敲低了CHOP表達，見圖4。與HP組比較，CHOPsiRNA使CHOP基因沉默后，CHOP表達減少，說明抑制了內質網(wǎng)應激p-PERK-CHOP途徑。應用JNK抑制劑SP600125抑制內質網(wǎng)應激的IRE1-p-JNK途徑，與HP組比較，siCHOP+HP組與SP600125+HP組鈣化蛋白BMP-2及Runx-2表達均顯著減少（均P＜0.05），提示內質網(wǎng)應激參與了高磷誘導的VSMC鈣化。見圖5。

圖4 VSMC轉染siCHOP后CHOP蛋白表達Fig.4 Expression of CHOP protein in VSMC transfected with siCHOP

圖5 各組鈣化蛋白BMP-2及Runx-2表達比較Fig.5 Comparison of expression of calcifying proteins BMP-2 and Runx-2 in each group

3 討論

本研究結果顯示，高磷可誘導VSMC BMP-2及Runx-2表達增加，提示VSMC發(fā)生了成骨細胞表型轉分化。血管鈣化是VSMC向成骨細胞、軟骨細胞、成脂細胞及巨噬細胞表型轉分化驅動的主動過程［6］。隨著腎臟功能逐漸減退，腎臟排泄磷功能障礙，慢性腎臟病患者普遍存在高磷血癥。研究［7］顯示，高磷啟動和促進血管鈣化進展的機制包括：（1）促進VSMC向軟骨細胞表型轉變，增加細胞外基質鈣化；（2）誘導VSMC凋亡；（3）抑制單核細胞/巨噬細胞向破骨樣細胞分化；（4）增加成纖維細胞生長因子23（fibroblast growth factor 23，F(xiàn)GF23）水平；（5）減少Klotho蛋白表達。已有研究［8］顯示內質網(wǎng)應激機制通過多種機制誘導血管鈣化。

本研究應用高磷培養(yǎng)基刺激VSMC表達p-JNK等內質網(wǎng)應激特異性蛋白，探討內質網(wǎng)應激是否參與高磷誘導的VSMC鈣化。結果顯示，高磷培養(yǎng)細胞可增強內質網(wǎng)應激反應；同時發(fā)現(xiàn)p-JNK、CHOP等凋亡相關蛋白表達增多，提示內質網(wǎng)應激誘導了VSMC凋亡。已有體外實驗［9］證實VSMC凋亡先于血管鈣化，凋亡小體含有高濃度鈣，它沉積到細胞外基質，作為鈣沉積的內核而引起鈣化。內質網(wǎng)是細胞內負責合成蛋白和脂類的細胞器，同時又是主要的鈣儲存庫，維持細胞鈣穩(wěn)態(tài)；當內質網(wǎng)腔內未折疊蛋白或者錯誤折疊蛋白過多時，導致內質網(wǎng)應激穩(wěn)態(tài)破壞、發(fā)生內質網(wǎng)應激，從而導致多種疾病發(fā)生［10］。內質網(wǎng)應激主要通過誘導VSMC凋亡的方式促進血管鈣化［11］，其誘導凋亡的信號通路包括：（1）PERK活化后，磷酸化真核細胞起始因子（eukaryotic initiation factor 2，eIF2）的α亞單位，進而促進轉錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）轉位入核，激活凋亡蛋白CHOP，誘導細胞凋亡［12］。（2）IRE1發(fā)生二聚化和自身磷酸化，生成的IRE1α可以募集腫瘤壞死因子受體相關因子2（TNF receptor associated factor 2，TRAF2），依次激活凋亡信號調節(jié)激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）、JNK，JNK通過抑制B淋巴細胞瘤-2基因而誘導細胞凋亡［13］。（3）內質網(wǎng)應激時，caspase-12活化激活caspase家族蛋白而誘導凋亡。內質網(wǎng)應激除了通過誘導凋亡的方式參與血管鈣化外，還激活轉錄活化因子X盒結合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）結合Runx-2啟動子，促進血管平滑肌細胞轉分化［14］。

本研究在沉默CHOP基因后再高磷刺激VSMC，結果顯示BMP-2及Runx-2表達均減少，提示內質網(wǎng)應激的PERK-eIF2-CHOP途徑參與高磷誘導的VSMC鈣化。應用JNK抑制劑SP600125預處理高磷細胞后發(fā)現(xiàn)預處理后的VSMC鈣沉積減輕，提示內質網(wǎng)應激的IRE1-TRAF2-JNK途徑亦參與了高磷誘導的VSMC鈣化。已有研究［15］顯示體外培養(yǎng)子宮頸癌細胞時，細胞外液高磷環(huán)境可激活區(qū)細胞內質網(wǎng)應激，細胞凋亡蛋白裂解的caspase-3表達增加，但加入SP600125抑制JNK后表達減少。研究［16］顯示在糖尿病大鼠模型中，鐵死亡通過內質網(wǎng)應激參與心肌缺血/再灌注損傷。可見內質網(wǎng)應激誘導凋亡的機制可能發(fā)生在多種細胞內，因此可能成為與凋亡相關的血管鈣化等疾病的潛在治療靶點。

綜上所述，內質網(wǎng)應激機制參與了高磷誘導的VSMC鈣化，其作用機制可能是激活了pPERK-CHOP和IRE1-p-JNK兩條途徑。本研究不足之處：（1）未進行SP600125和CHOPsiRNA對VSMC鈣定量和堿性磷酸酶活性影響的檢測；（2）為體外實驗，僅采用細胞培養(yǎng)，今后應設計動物實驗來進一步論證。