肖興玉，張永哲，張凱華，陳惠杰，尹 銳

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132000）

肉類是人們生活中重要的食物來源，一直以來肉類的食品安全受到社會和消費(fèi)者的密切關(guān)注。近年來，肉類食品欺詐事件時(shí)有發(fā)生，如不法商家以低價(jià)的雞、鴨肉冒充牛羊肉出售，以獲得高額利潤。這嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者的利益和破壞市場公信力[1]。同時(shí)，肉類錯(cuò)誤標(biāo)識和摻假還涉及宗教信仰問題，影響民族團(tuán)結(jié)[2]。因此，對肉制品的種類和真實(shí)性進(jìn)行鑒別是十分必要的。

目前，PCR方法是鑒別肉及其制品中動物源性成分的主要方法[3]。PCR檢測的第一步需對樣本的DNA進(jìn)行提取，DNA的質(zhì)量直接決定著PCR檢測能否成功[4]。DNA提取方法主要有煮沸法、離心柱法、磁珠法等[5]。磁珠法具有操作簡單、用時(shí)短、安全無毒和高通量的優(yōu)點(diǎn)，受到科研人員的廣泛關(guān)注。但目前的磁珠法商業(yè)試劑盒價(jià)格昂貴，一定程度上限制了它的廣泛應(yīng)用。本研究自建了一種簡單、快速的磁珠法肉類食品DNA提取技術(shù)，該技術(shù)提取的DNA質(zhì)量高，成本低廉，可用于各類實(shí)驗(yàn)室開展肉類DNA的快速提取，為肉類食品的身份鑒定提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞肉、牛肉、魚肉、馬肉和驢肉均購自于吉林市某大型超市，-20 ℃保存。

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）、氯化鈉（NaCl）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）和蛋白酶K購自生工生物工程(上海)股份有限公司；動物組織DNA提取試劑盒（MagPure Tissue&Blood DNA LQ Kit）購自廣州美基生物科技有限公司；異丙醇和無水乙醇購自北京索萊寶生物科技有限公司；超順磁性硅羥基磁珠購自金準(zhǔn)智造生物科技（吉林)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MOLCI純水機(jī)，重慶市摩爾水處理設(shè)備有限公司；PHS-3CE pH計(jì)，上海雷磁傳感器科技有限公司；PTY-224Y電子天平，華志（福建）電子科技有限公司；HWS-28水浴鍋，上海一恒科技有限公司；Thermo Scientific NanoDrop One超微量紫外-可見光分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；

1.3 主要試劑的配制

DNA裂解緩沖液：CTAB 2 g、NaCl 7.91 g、0.5 mol/L EDTA 4 mL、1 mol/L Tris 10 mL，調(diào)pH至8.0～9.0，雙蒸水定容至100 mL，備用；DNA漂洗緩沖液：精密稱定無水乙醇70 mL，加入30 mL雙蒸水，振蕩混勻，備用；DNA洗脫緩沖液：精密稱定Tris base 0.121 g溶于100 mL雙蒸水中，pH調(diào)至8.0，雙蒸水定容至50 mL，備用。

1.4 肉類DNA的提取和提取方案的優(yōu)化

1.4.1 DNA提取

稱取肉類樣本0.1 g，剪碎，加入1.5 mL離心管。隨后，加入600 μL裂解緩沖液和20 μL蛋白酶K，渦旋10 s混勻；60 ℃水浴一定時(shí)間，每5 min振蕩混勻。12 000 r/min離心5 min，取上清液500 μL到1.5 mL新離心管。在新離心管中加入500 μL異丙醇，渦旋混勻，加入15 mL磁珠渦旋混勻，靜置5 min，磁力架吸附2 min，吸棄清液。向離心管中加入 500 μL漂洗緩沖液，渦旋混勻，磁力架靜置2 min，吸棄廢液。重復(fù)上述漂洗步驟若干次，磁力架上晾干5 min。隨后，加入50 μL洗脫緩沖液，渦旋混勻， 65 ℃水浴5 min。磁力架靜置5 min，吸取清液到另一個(gè)1.5 mL離心管，-20 ℃保存。

1.4.2 DNA提取方案的優(yōu)化

（1）DNA裂解緩沖液濃度優(yōu)化。使用牛肉樣本，使用不同濃度（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%和4.0%）CTAB作為DNA裂解緩沖液的主成分，以DNA質(zhì)量濃度（ng/μL）和純度（A260/A280、A260/A230）為評價(jià)指標(biāo)，篩選最適濃度。篩選時(shí)，裂解時(shí)間為10 min，漂洗次數(shù)為1次。

（2）裂解時(shí)間優(yōu)化。使用優(yōu)化后的DNA裂解緩沖液，對樣本水浴加熱5 min、10 min、15 min和 20 min，以DNA質(zhì)量濃度（ng/μL）和純度（A260/A280、A260/A230）為評價(jià)指標(biāo)，對DNA提取最適裂解時(shí)間進(jìn)行篩選。篩選時(shí)，漂洗次數(shù)為1次。

（3）漂洗次數(shù)優(yōu)化。使用優(yōu)化后的DNA裂解緩沖液和裂解時(shí)間，將核酸樣本進(jìn)行1次、2次、3次漂洗，以DNA質(zhì)量濃度（ng/μL）和純度（A/A、260280A260/A230）為評價(jià)指標(biāo)，對最適漂洗次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.4.3 DNA測定

采用超微量紫外-可見光分光光度計(jì)測定樣品濃度和吸光度值，并記錄核酸濃度、A260/A280與A260/A230的比值。

1.5 提取方法適用性驗(yàn)證

使用優(yōu)化的DNA提取方法，對雞肉、魚肉、馬肉和驢肉進(jìn)行DNA提取，測定DNA濃度和純度，以驗(yàn)證DNA提取方法的適用性。

1.6 與商業(yè)試劑盒性能的比較

使用優(yōu)化后的DNA提取方法和試劑盒同時(shí)對雞肉、馬肉、驢肉進(jìn)行DNA提取，從核酸提取濃度及純度、單次核酸提取成本、提取時(shí)間3方面進(jìn)行 對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取體系優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 DNA裂解濃度優(yōu)化

首先，探討不同濃度的裂解緩沖液對肉類DNA提取結(jié)果的影響。研究表明，當(dāng)裂解液主成分為2% CTAB時(shí)，即可對樣本進(jìn)行充分裂解，且CTAB濃度過高時(shí)，引入了過量的裂解液成分，在漂洗過程中無法被充分洗滌，導(dǎo)致DNA純度下降，故選用2% CTAB作為DNA提取體系的最適裂解液，結(jié)果見表1。

表1 裂解液濃度的篩選

2.1.2 DNA裂解時(shí)間優(yōu)化

使用2% CTAB作為裂解液，對裂解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，60 ℃裂解10 min，即可將樣本中的DNA完全釋放出來，同時(shí)出于減少試驗(yàn)所需時(shí)間，所以將10 min作為最適裂解時(shí)間。當(dāng)裂解時(shí)間為20 min時(shí)，DNA濃度出現(xiàn)明顯下降，說明當(dāng)裂解時(shí)間過長，裂解釋放的DNA出現(xiàn)了部分降解，結(jié)果見表2。

表2 裂解時(shí)間篩選

2.1.3 漂洗次數(shù)優(yōu)化

以2% CTAB作為裂解液，水浴裂解10 min，對漂洗次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果見表3。當(dāng)漂洗次數(shù)為1次時(shí)，A260/A230在1.80以下，不符合相應(yīng)的純度要求。當(dāng)漂洗次數(shù)為2次時(shí)，A260/A280和A260/A230均達(dá)到1.90以上，且濃度未出現(xiàn)大幅度下降。當(dāng)漂洗次數(shù)為3次時(shí)，濃度出現(xiàn)了較大幅度的下降，故最優(yōu)的漂洗次數(shù)為2次。

表3 漂洗次數(shù)篩選

2.2 提取方法適用性驗(yàn)證

使用優(yōu)化后的DNA提取方法對除牛肉以外的雞肉、魚肉、馬肉和驢肉進(jìn)行DNA提取，以驗(yàn)證該方法在不同肉類檢測中的適用性。研究表明不同肉制品均提取到較高的核酸濃度，DNA濃度在560.2～ 2 297.92 ng/μL，A260/A280和A260/A230分別達(dá)到1.9和1.7以上，可滿足下游PCR實(shí)驗(yàn)的需求，結(jié)果見表4。

表4 通用性結(jié)果驗(yàn)證

2.3 與商業(yè)試劑盒性能的比較

使用試劑盒與本方法（CTAB法）同時(shí)對3種肉類進(jìn)行DNA提取，從核酸提取濃度及純度、提取時(shí)間、單次核酸提取成本3方面進(jìn)行對比，結(jié)果見表5。

表5 與商業(yè)試劑盒的性能比較

結(jié)果顯示本研究建立的方法在核酸提取純度上與市售試劑盒并無較大差別，且有著提取濃度高、提取所需時(shí)間短、單次提取成本低的優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié)論

本研究建立了一種簡單、快速磁珠法肉類 DNA提取方法，該方法的核酸提取快速、質(zhì)量高，同時(shí)避免了傳統(tǒng)核酸提取中有毒有機(jī)試劑的使用。本方法采用常規(guī)的CTAB作為裂解液，只使用70%的乙醇作為漂洗液，一定程度上減少了核酸提取試劑的溶液配制難度，且具有提取過程耗時(shí)短、成本低廉、檢測結(jié)果可靠的優(yōu)點(diǎn)。本研究建立的磁珠法肉類DNA提取技術(shù)可作為基層實(shí)驗(yàn)室自建肉類DNA提取方案，用于肉類DNA的快速提取，為肉類食品安全檢測提供技術(shù)保障。