熊義愛

（商洛市食品安全檢驗檢測中心，陜西商洛 726000）

我國近年來頒布和修改了許多產(chǎn)品國家標(biāo)準(zhǔn)，已基本覆蓋了人們?nèi)粘Ｉ钪薪佑|的大多數(shù)食物。但目前國家標(biāo)準(zhǔn)未能涵蓋所有的食物，此類食品因無相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)可依，造成了對其微生物的日常檢驗與監(jiān)督不足。

1 食品中微生物限量要求現(xiàn)狀

1.1 預(yù)包裝食品

國家對不同預(yù)包裝食品中的基礎(chǔ)微生物項目菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母數(shù)的限量規(guī)定不同，重要判斷依據(jù)為產(chǎn)品相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)。由于罐頭食物通常是真空包裝，對其重點檢驗項目規(guī)定為商業(yè)生產(chǎn)無菌[1]。預(yù)包裝食品致病菌的限量要求主要依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》 （GB 29921—2021），該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了乳制品、肉制品、水產(chǎn)類制品、即食蛋制品、糧食制品、即食蔬菜制品、巧克力類及可可制品、飲料、冰凍飲品、即食調(diào)味品和堅果與籽類等13類食品中的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、致泄大腸埃希氏菌、克洛諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）和副溶血性弧菌6種致病菌的檢測方法和限量。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容涉及范圍廣，對預(yù)包裝食品的微生物監(jiān)測較全面，為地方監(jiān)管部門對預(yù)包裝食品的監(jiān)督管理工作提供了重要依據(jù)，并有效保證了此類食品的食用安全性[2]。

1.2 散裝食品

2022年以前，我國缺乏對散裝即食食品中基礎(chǔ)微生物及致病菌的限量標(biāo)準(zhǔn)，部分散裝即食食品中的基礎(chǔ)微生物及致病菌的限量指標(biāo)會參考我國相關(guān)食品行業(yè)的生產(chǎn)規(guī)范和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。但部分生產(chǎn)規(guī)范明確指出只應(yīng)用于預(yù)包裝食品，或明確指出不宜用作現(xiàn)制現(xiàn)售食物，如現(xiàn)制作的蛋糕或包子?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 糕點、面包》（GB 7099—2015）也規(guī)定，該規(guī)范中的菌落總數(shù)和大腸菌群國家標(biāo)準(zhǔn)不宜用作現(xiàn)制或現(xiàn)售商品。大多數(shù)非預(yù)包裝即食食品都無可依據(jù)的產(chǎn)品規(guī)范，如米飯、腸粉、饅頭等。 GB 29921—2021中雖提出了對致病細(xì)菌的限量條款，但其僅應(yīng)用于預(yù)包裝食品。2016年7月27日，廣東省衛(wèi)生和計劃生育委員會出臺了《廣東省食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 非預(yù)包裝即食食品微生物限量》 （DBS 44/006—2016）地方規(guī)范，彌補(bǔ)了對散裝即食肉制品微生物限量規(guī)范的空缺，但在全國區(qū)域內(nèi)通用的標(biāo)準(zhǔn)仍空缺，導(dǎo)致此類食品，特別是占比較大的餐飲業(yè)及現(xiàn)售行業(yè)的微生物監(jiān)測與日常監(jiān)督工作陷入了無章可循的局面[3]。

2 食品微生物檢驗技術(shù)的現(xiàn)狀

2.1 傳統(tǒng)檢測法

傳統(tǒng)檢測法是目前實驗室的主要檢測方法，在潔凈室內(nèi)將待測物用0.85%生理鹽水稀釋，制成符合要求的樣品均液，涂布或注入相應(yīng)選擇性的培養(yǎng)基上，在特定的溫度下需氧或厭氧培養(yǎng)24～48 h，有的甚至需要培養(yǎng)10 d，期間需配制試劑、環(huán)境監(jiān)測、增菌、分離、純化、革蘭氏染色、鏡檢和生化鑒定等一系列實驗，實驗結(jié)果準(zhǔn)確性較高，不足之處是耗時費(fèi)力。

2.2 微生物測試片法

微生物測試片通常由介質(zhì)、冷水或凝膠、顯影劑等組成。顯影劑通常由細(xì)胞代謝物和顏色基因組成，在細(xì)胞生長過程中利用代謝蛋白與光致變色底物相互作用，彩色顯影介質(zhì)的原理和結(jié)構(gòu)基本相同[4]。該方法具有操作簡單、誤差較小和效率高等優(yōu)點。測試過程中無需配備試劑，大大提高了檢測效率，有效減少了測試誤差，可在24～48 h完成測試。以比色法為基礎(chǔ)的分析方法比一般方法更適合計數(shù)，更適合用于實驗室快速檢測。目前，市場上的主要快檢品牌有3M（美國）、美正生物（中國）、路橋（中國）、DNP（日本）、環(huán)開（中國）和建一（中國）。

2.3 全自動快速培養(yǎng)方法

隨著對智能化和質(zhì)量要求的提高，微生物檢測方法正逐步將傳統(tǒng)的手工操作與高度智能化的生物監(jiān)測系統(tǒng)融合，涉及儀器設(shè)備、試劑等。自動微生物檢測裝置主要包括快速測定和鑒定裝置，但其也使用了傳統(tǒng)的培養(yǎng)和鑒定原理。例如，諾金soleris系列由實時光伏發(fā)電測試儀和大數(shù)據(jù)組成分析軟件及相應(yīng)的檢測試劑盒組成[5]。細(xì)菌的代謝過程會產(chǎn)生光，從而改變培養(yǎng)基的生化特性和試劑S的顏色，Oleris光學(xué)系統(tǒng)實時監(jiān)測上述化學(xué)變化引起的光度變化，細(xì)菌濃度越高，檢測時間越快[6]。

2.4 免疫分析

免疫分析的基本原理是利用特異性反應(yīng)抗原或抗體快速檢測靶細(xì)胞。目前主要有兩種產(chǎn)品，即膠體檢測卡和酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）試劑盒。這兩種技術(shù)都比較成熟。目前，國內(nèi)大多數(shù)企業(yè)生產(chǎn)的檢測產(chǎn)品可以檢測到農(nóng)藥、獸藥殘留和非法添加劑，但細(xì)菌性產(chǎn)品相對較少。在國內(nèi)外市場上主要有艾默氏、美正生物和默克等品牌，主要產(chǎn)品有沙門氏菌、大腸桿菌O157和李斯特菌等檢測項目[7]。目前，酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)已進(jìn)入成熟階段，若能從細(xì)菌中獲得特異性抗原抗體，也可通過ELISA試劑盒檢測，還可以開發(fā)該盒的快速測試功能。目前，三明治模式仍是應(yīng)用最廣泛的微生物檢測方法。該檢測方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點。目前，國內(nèi)市場上采用該技術(shù)的品牌有百發(fā)、美利爾和美正生物等。

2.5 三磷酸腺苷（ Adenosine-triphosphate， ATP）熒光檢測方法

ATP檢測最早于20世紀(jì)80年代在英國開發(fā)，后來發(fā)展到歐盟、美洲和日本。自20世紀(jì)90年代以來，ATP檢測法已廣泛應(yīng)用于食品加工行業(yè)，包括食品加工、超市和餐館，檢測細(xì)菌和食物殘渣中的三磷酸腺苷。ATP廣泛存在于各種生物體中。通過檢測ATP，人們可以間接地確認(rèn)生物體的存在。根據(jù)螢火蟲發(fā)光原理，通過測定三磷酸腺苷（ATP）、熒光素和熒光素酶（Luciferase）系統(tǒng)，可以快速判斷人體健康狀況。ATP熒光檢測方法可對食品飲料加工、餐飲、綜合醫(yī)院和水產(chǎn)養(yǎng)殖等進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測，對醫(yī)療系統(tǒng)和食品衛(wèi)生監(jiān)督進(jìn)行實時抽樣檢查。但由于ATP可以在任何生物中形成，所以ATP方法也可以測量清潔度，通過實驗測試估算細(xì)菌濃度，而不是直接判斷細(xì)菌的存活和濃度。

2.6 聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR)

（1）熒光定量PCR。熒光定量PCR技術(shù)，即在PCR擴(kuò)增過程中，利用熒光信息實時監(jiān)控PCR的發(fā)展。由于PCR擴(kuò)增模塊的CT值與模塊的初始拷貝數(shù)之間存在線性關(guān)系，可作為定性依據(jù)。目前，國內(nèi)PCR儀器的主要品牌包括Semefeld、Roche、Bole、天龍、雅瑞和紅石等。食品檢測領(lǐng)域使用的試劑盒或檢測系統(tǒng)的主要品牌包括杜邦Bax、默克、Semefeld和美正生物等品牌。試劑盒主要包括沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、克羅諾桿菌、大腸桿菌O157、單核細(xì)胞增生李斯特菌和諾沃克病毒等核酸檢測試 劑盒。

（2）等溫PCR技術(shù)。等溫PCR技術(shù)是近年來發(fā)展的新技術(shù)。通過采用PCR擴(kuò)增儀對靶細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，采用瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行檢測，這一技術(shù)對溫度變化的反應(yīng)靈敏度較高，操作更簡單。該技術(shù)更適用于現(xiàn)場快速測量。以一種DS分子控制器為例，該控制器采用熱放大環(huán)狀DNA和生物熒光處理技術(shù)，利用電子捕獲生物放大反應(yīng)過程中形成的ATP發(fā)射的生物熒光，對DNA生物放大產(chǎn)物進(jìn)行智能檢測，并以電子圖像和光學(xué)檢測點的形式顯示檢測結(jié)果。由于該方法通常對目標(biāo)基因的檢測限較低，因此對實驗室人員的空間布局、檢測設(shè)施和操作條件提出了更嚴(yán)格的要求，實驗室需嚴(yán)格進(jìn)行分子生物學(xué)分型試驗，以減少對環(huán)境污染檢測結(jié)果的影響。質(zhì)譜是一種新的細(xì)菌鑒定方法，能快速鑒定現(xiàn)有的和未知的細(xì)菌，其基本原理是質(zhì)譜儀的分子源通過電離效應(yīng)使被測細(xì)菌具有更高的電子能力，在吸收電能后，目標(biāo)細(xì)菌被激活，形成強(qiáng)大的電離效率，將載氣引入質(zhì)譜儀，在電流的影響下加速導(dǎo)航[8]。由于不同的分子具有不同的質(zhì)荷比，探測器上捕獲的帶電粒子產(chǎn)生的信號信息也不同，可通過與標(biāo)準(zhǔn)生物知識圖譜和質(zhì)譜庫中的其他數(shù)據(jù)信號進(jìn)行比較完成細(xì)菌的識別。

3 微生物檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢

（1）廣譜快速富集培養(yǎng)的發(fā)展是未來的技術(shù)重點。大多數(shù)食品中的主要致病菌含量較低，很難檢測到食品中的少量致病菌。目前，檢測到的食源性病原體一般需要完成預(yù)濃縮步驟，每種病原體都有相應(yīng)的生長習(xí)性和營養(yǎng)條件。因此，所有病原體都必須使用不同的富集介質(zhì)，這對實際檢測的影響較大。因此，開發(fā)一種廣譜快速富集介質(zhì)將是未來技術(shù)的重要發(fā)展方向。

（2）過程系統(tǒng)越來越受到重視，方法系統(tǒng)需從企業(yè)的實際應(yīng)用情況進(jìn)行充分的考慮?；谌蚬芾砝砟詈蛷默F(xiàn)場到風(fēng)險分析形成的全過程管理體系規(guī)范，我國食品安全管理模式正逐步從成品檢驗向過程管理轉(zhuǎn)變，我國的標(biāo)準(zhǔn)化管理體系正在向強(qiáng)調(diào)基本標(biāo)準(zhǔn)和工藝規(guī)范[食品制造標(biāo)準(zhǔn)和危害分析的關(guān)鍵控制點（Hazard Analysis Critical Control Point，HACCP）]轉(zhuǎn)變。在過程控制的應(yīng)用中，公司可建立適當(dāng)?shù)臏y試體系，采用過程控制的應(yīng)用環(huán)節(jié)，通過使用快速測試方法建立適當(dāng)?shù)臏y試系統(tǒng)和開發(fā)快速測試方法。在食品微生物檢驗的過程中，檢驗人員需具備良好的分析判斷能力。在選擇微生物檢測技術(shù)時，企業(yè)需考慮可操作性、實驗室條件是否滿足精度以及成本等 因素。