李 毅，張玉潔

（1.山東省中準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)有限公司，山東威海 264209；2.威海市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東威海 264209）

隨著人們生活節(jié)奏的加快，生存壓力的增大，速凍調(diào)理肉制品以其方便快捷、簡(jiǎn)單易操作的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)進(jìn)入人們的餐桌并逐步占據(jù)主導(dǎo)。速凍調(diào)理肉制品是指以畜禽肉為主要原料，經(jīng)攪拌、調(diào)味等工藝加工而成的非即食類肉制品。

喹諾酮類抗生素作為廣譜抗菌藥物，廣泛用于革蘭陰性細(xì)菌感染的治療，由于價(jià)格低且藥效明顯而廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖[1]。喹諾酮類等獸藥的安全合理使用，可以降低畜禽發(fā)病率與死亡率，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，但部分養(yǎng)殖戶過(guò)分追求經(jīng)濟(jì)利益、盲目加大用藥，導(dǎo)致藥物在畜禽體內(nèi)富集，人食用此類動(dòng)物組織后，造成人體疾病或?qū)λ幬锂a(chǎn)生耐藥性，長(zhǎng)期攝入可能引起食用者惡心、嘔吐、疼痛等胃腸道不適及腸道菌群失調(diào)[2]；也會(huì)引起頭痛、頭暈、睡眠不良等癥狀[3]；并有潛在的致癌、致畸、致突變風(fēng)險(xiǎn)。因此，喹諾酮類藥物殘留問(wèn)題越來(lái)越引起人們的關(guān)注。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局于2005年宣布禁止用于治療家禽細(xì)菌感染的抗菌藥物恩諾沙星的銷售和使用。我國(guó)也在GB 31650—2019中規(guī)定環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星和洛美沙星等6種喹諾酮類藥物在動(dòng)物肌肉組織中的最高殘留限量為10～500 μg/kg。

喹諾酮類藥物在動(dòng)物組織中的殘留分析方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、高效液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析法。傳統(tǒng)方法多采用液液萃取法或者固相萃取法，液液萃取法浪費(fèi)溶劑，準(zhǔn)確度低，若提取溶劑中含有乙腈，旋蒸容易報(bào)廢且最終會(huì)有水分殘留，影響最終的定量分析結(jié)果；固相萃取法需要經(jīng)過(guò)活化、上樣、淋洗、洗脫和氮吹等諸多步驟，消耗時(shí)間太長(zhǎng)，大批量檢測(cè)樣品時(shí)會(huì)降低工作效率。本方法基于QuEChERS原理，采用快速過(guò)濾柱對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

乙腈（CH3CN），色譜純，美國(guó)FISHER公司；甲酸（CH3COOH），色譜純，上海麥克林生化科技有限公司；恩諾沙星（Enrofloxacin），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；氧氟沙星（Ofloxacin），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；培氟沙星（Pefloxacin），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；諾氟沙星（Norfloxacin），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；洛美沙星（Lomefloxacin），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AB 3500液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，配電噴霧離子源，美國(guó)AB SCIEX公司；SQP電子天平，美國(guó)Sartorius公司；超純水機(jī)，法國(guó)Millipore公司；移液槍，美國(guó)Sartorius公司；高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；超聲波清洗器，昆山美美超聲儀器有限公司；渦旋混合器，德國(guó)IKA公司；色譜柱：Kinetex C18100 mm×2.1 mm×2.6 μm。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的速凍牛排樣品5.00 g置于50 mL離心管中，加入含5%甲酸的乙腈溶液 10 mL，渦旋混合，15 ℃超聲15 min。加入2 g氯化鈉，渦旋混合90 s，以轉(zhuǎn)速8 500 r/min，溫度2 ℃， 冷凍離心10 min，取1 mL上清液待凈化。將1 mL提取液轉(zhuǎn)移到ProElut QuE 2mL Tube，渦旋30 s，離心后取上清液，加水100 μL，渦旋混合，氮吹至近干，加乙腈-0.1%甲酸水（1∶9）定容至1 mL， 過(guò)0.22 μm微孔濾膜，進(jìn)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 分析。

1.3.2 儀器條件

（1）色譜條件。流動(dòng)相：A 0.1%甲酸溶液，B 乙腈，梯度洗脫，見(jiàn)表1；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧（ESI）離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電離電壓：3 000 V；源溫：100 ℃；霧化溫度：350 ℃；錐孔氣流速：25 L/h；霧化氣流速：450 L/h。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在參考GB/T 21312—2007[4]、農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告—1—2008[5]的基礎(chǔ)上，首先對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以離子豐度比較大且干擾較小為原則，選擇適合的子離子，同時(shí)以豐度值較大的子離子作為定量離子。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行分析，表2為該方法獲得的最佳質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)，圖1為特征峰。

圖1 6種喹諾酮類特征峰

表2 定向離子對(duì)、定量離子對(duì)和碰撞能量

在優(yōu)化質(zhì)譜條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化了流動(dòng)相比例，最終確定在正離子模式下，以乙腈和0.1%甲酸水為流動(dòng)相，6種喹諾酮類藥物能夠在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)色譜分離，且互不干擾。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和檢出限

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：取喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品各約100 μL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為1 mg/L的喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)貯備液，-20 ℃保存，有效期3個(gè)月。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：取喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)貯備液各 1 mL于10 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度均為100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取20 μL、50 μL、100 μL、200 μL和400 μL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動(dòng)相稀釋至1 mL配制成濃度為2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL和40 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積比為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

將100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋至1.00 ng/mL、 2.50 ng/mL、5.00 ng/mL后依次添加至樣品中，按照上述實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行測(cè)定，以3倍信噪比計(jì)算檢出限，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 線性參數(shù)和檢出限

2.3 精密度

對(duì)實(shí)驗(yàn)操作樣品進(jìn)行了方法精密度試驗(yàn)，用來(lái)保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性，用加標(biāo)濃度為5.00 ng/mL的喹諾酮類樣品，重復(fù)檢測(cè)6次，結(jié)果精密度如表4 所示。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 回收試驗(yàn)

按照上述實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)速凍牛排制品進(jìn)行了3個(gè)不同濃度（2.50 ng/mL、5.00 ng/mL、10.00 ng/mL）的加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算出以下6種喹諾酮類藥物的回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 加標(biāo)回收結(jié)果

3 結(jié)論

經(jīng)多次試驗(yàn)驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)采用的ProElut QuE 2 mL Tube快速凈化技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法成功解決了檢測(cè)大批量樣品喹諾酮時(shí)面對(duì)的時(shí)效長(zhǎng)、準(zhǔn)確度低的問(wèn)題，對(duì)速凍調(diào)理肉制品中喹諾酮類藥物殘留的測(cè)定具有重要意義。