童培珍，李國衛(wèi)，何嘉瑩，邱韻靜，王利偉，徐敏，何廣銘（廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244）

枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實，7月果皮尚綠時采收，具有理氣寬中，行滯消脹之功效，臨床常用于胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內(nèi)停、臟器下垂[1]；枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensisOsbeck的干燥幼果，5～6月收集自落的果實，具有破氣消積、化痰散痞的作用，臨床常用于積滯內(nèi)停、痞滿脹痛、瀉痢后重、大便不通、痰滯氣阻、胸痹、結(jié)胸、臟器下垂[1]?！侗静菥V目》曰：“枳實、枳殼，氣味功用俱同，上世亦無分別，魏晉以來，始分實、殼之用。潔古張氏，東垣李氏，又分治高治下之說。大抵其功皆能利氣，氣下則痰喘止，氣行則痞脹消，氣通則痛刺止，氣利則后重除。故以枳殼利胸膈，枳實則利腸胃，然張仲景治胸痹痞滿，以枳實為要藥，諸方治下血諸痢，大腸秘塞，里急后重，又以枳殼為通用，則枳實不獨治下，而枳殼不獨治高也[2]?！辫讓嵖嘀匦院?，善于破氣消積，枳殼味苦酸性微寒，善于理氣寬中，兩者性能各有側(cè)重，不可代用。研究表明，枳殼與枳實中含量較高的為黃酮類成分和香豆素類成分，具有調(diào)節(jié)胃腸道、抗癌等多種生物活性[3-7]。目前已有文獻(xiàn)報道不同物候期枳實、枳殼黃酮類和生物堿類成分變化，或是對枳殼與枳實黃酮類成分進(jìn)行單一定性定量研究，無法系統(tǒng)地評價枳殼與枳實的差異[8-14]。枳殼和枳實來源幾乎相同，化學(xué)成分也相似，通過外觀顏色和果實大小只能進(jìn)行主觀評價，可能會對其鑒別造成誤差，難以保證臨床藥效?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報道枳實及枳殼的含量或指紋圖譜多采用高效液相色譜法進(jìn)行測定，耗時長。本研究采用UPLC法建立枳實與枳殼的指紋圖譜，利用主成分分析及偏最小二乘法-判別分析尋找枳實及枳殼的主要差異成分；對上述差異性成分進(jìn)行定量分析，大大縮短了檢測時間，為枳殼和枳實的整體質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters Acquity UPLC H-Class型超高效液相色譜儀（四元泵，PDA檢測器）；Mettler-Toledo ME204E型萬分之一電子分析天平、Mettler-Toledo XP26型百萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；HWS28型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；Milli-Q Direct超純水系統(tǒng)（默克股份有限公司）。

1.2 試藥

柚皮苷（批號：110722-201714，含量：93.4%）、橙皮苷（批號：110721-201818，含量：96.20%）、新橙皮苷（批號：111857-201804，含量：99.4%）（對照品，中國食品藥品檢定研究院）；蕓香柚皮苷（批號：wkq19041908，含量：98.0%）、水合橙皮內(nèi)酯（批號：wkq20031904，含量：98.0%）、川陳皮素（批號：wkq20031701，含量：98.0%）、橘紅素（批號：wkq16011401，含量：98.6%）（對照品，四川維克奇生物科技有限公司）；馬爾敏（批號：CFS201901，含量：98.0%，Chem Face生物有限公司）。乙腈（默克股份有限公司），磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），甲醇（西隴科學(xué)股份有限公司），水為自制超純水。

枳殼與枳實經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心鑒定：枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實（編號：ZQ1-ZQ18）；枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥幼果（編號：ZS1-ZS10），樣品詳細(xì)信息見表1。

表1 樣品信息表 Tab 1 Information source of sample

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent SB C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；以乙腈為流動相A，0.05%磷酸水為流動相B，梯度洗脫（0～7 min，15%→25%A；7～8 min，25%→40%A；8～10 min，40%→45%A；10～13 min，45%→60%A；13～15 min，60%→15%A）；流速為0.4 mL·min-1；柱溫為30℃；檢測波長為320 nm；進(jìn)樣量為2 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、馬爾敏、川陳皮素、橘紅素對照品適量，加甲醇制成含蕓香柚皮苷336.6 μg·mL-1、柚皮苷257.4 μg·mL-1、橙皮苷221.6 μg·mL-1、新橙皮苷105.7 μg·mL-1、水合橙皮內(nèi)酯69.1 μg·mL-1、馬 爾 敏225.3 μg·mL-1、川陳皮素219.7 μg·mL-1、橘紅素256.4 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取枳殼和枳實粉末（過三號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流提取1.5 h，放冷，稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

2.4 指紋圖譜研究

2.4.1 精密度試驗 取枳殼樣品（ZQ17）粉末約0.2 g，精密稱定，制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以新橙皮苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果顯示18個共有峰相對保留時間RSD在0.010%～0.040%，相對峰面積RSD在0.040%～0.89%，均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取枳殼樣品（ZQ18）粉末約0.2 g，精密稱定，制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測定，以新橙皮苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果顯示18個共有峰相對保留時間RSD在0.040%～0.15%，相對峰面積RSD在0.120%～0.63%，均小于2.0%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取枳殼樣品（ZQ17）粉末約0.2 g，平行6份，精密稱定，制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，以新橙皮苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果顯示18個共有峰相對保留時間相對保留時間RSD在0.020%～0.040%，相對峰面積RSD在0.34%～2.2%，均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜測定結(jié)果與分析

2.5.1 枳殼與枳實共有峰的確定 取18批枳殼樣品和10批枳實樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，結(jié)果得到18個共有峰，通過對照品指認(rèn)了8個峰，分別為蕓香柚皮苷（峰1）、柚皮苷（峰2）、橙皮苷（峰4）、新橙皮苷（峰5）、水合橙皮內(nèi)酯（峰7）、馬爾敏（峰13）、川陳皮素（峰15）、橘紅素（峰18）。其中新橙皮苷分離度好，保留時間適中，峰形穩(wěn)定，設(shè)為參照峰（S）。見圖1～3。

圖1 18批枳殼指紋圖譜疊加圖Fig 1 Fingerprint and chromatogram of 18 batches of Aurantii Fructus

圖2 10批枳實指紋圖譜疊加圖Fig 2 Fingerprint and chromatogram of 10 batches of Aurantii Fructus Immatutus

2.5.2 相似度評價 分別將18批枳殼和10批枳實指紋圖譜導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.0版本）”，生成枳殼和枳實對照指紋圖譜。結(jié)果顯示，18批枳殼與枳殼對照指紋圖譜的相似度在0.943～0.998；10批枳實與枳實對照指紋圖譜相似度在0.965～0.998。相似度均大于0.940，說明不同批次同種藥材質(zhì)量大體一致。18批枳殼與枳實對照指紋圖譜的相似度在0.843～0.989；10批枳實與枳殼對照指紋圖譜相似度在0.845～0.996，相似度均大于0.84，說明同一基原不同采收期的兩種藥材相似度較高，僅通過相似度評價難以區(qū)分（見表2）。

表2 相似度評價結(jié)果 Tab 2 Similarity evaluation

圖3 對照品、供試品UPLC色譜圖Fig 3 UPLC of reference substance and sample

2.5.3 聚類分析 將枳殼與枳實色譜峰峰面積導(dǎo)入SPSS 20.0軟件進(jìn)行聚類分析，采用組間聯(lián)接法，選用歐氏距離進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4。由聚類分析結(jié)果可知，枳殼與枳實明顯地分成兩大類，一類為枳殼樣品（Ⅰ），另一類為枳實樣品（Ⅱ），說明枳殼和枳實樣品間存在一定的差異。

圖4 枳殼與枳實樣品聚類分析結(jié)果Fig 4 Clusster analysis of Aurantii Fructus and Aurantii Fructus Immatutus

2.5.4 主成分分析 將枳殼與枳實的共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析。結(jié)果前三個主成分的累積貢獻(xiàn)率為73.1%，說明前三個主成分基本能反映枳殼與枳實樣品的主要特征（見圖5）。以前三個主成分建立坐標(biāo)系，構(gòu)建枳殼與枳實的主成分分析得分圖（見圖6）。由得分圖可知，枳殼與枳實聚為兩類。結(jié)合聚類分析和主成分分析結(jié)果，表明枳殼與枳實的化學(xué)成分含量存在明顯差異。

圖5 主成分方差貢獻(xiàn)率Fig 5 Variance contribution rate of principal components

圖6 主成分分析得分圖Fig 6 Principal components scores

2.5.5 偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA） 為了進(jìn)一步比較枳殼與枳實化學(xué)成分的差異和尋找兩者之間的差異性化合物，筆者進(jìn)行了PLS-DA建模分析。PLS-DA模型中，R2Y為0.923，Q2Y為0.871，均大于0.5，說明建立的模型穩(wěn)定可靠。由PLS-DA得分圖可知（見圖7），枳殼與枳實明顯分為兩類，與聚類分析和主成分分析結(jié)果一致。通過變量重要性投影值（VIP）篩選出兩者間化學(xué)成分差異的主要標(biāo)志性成分（見圖8）。以VIP值大于1作為標(biāo)準(zhǔn)篩選，貢獻(xiàn)由大到小的7個變量依次為：峰5、峰6、峰2、峰9、峰10、峰4、峰12。通過對照品指認(rèn)出3個成分，分別為峰5新橙皮苷、峰2柚皮苷，峰4橙皮苷，其中峰5新橙皮苷的VIP值最大，是枳殼與枳實差異最大的峰。

圖7 PLS-DA得分圖Fig 7 PLS-DA scores

圖8 枳殼與枳實差異標(biāo)志物的VIP圖Fig 8 VIP value of Aurantii Fructus and Aurantii Fructus Immatutus

2.6 含量測定

由指紋圖譜測定結(jié)果可知，枳殼與枳實化學(xué)成分類似，但存在含量間的差異。故采用UPLC法對枳殼和枳實的4個黃酮類成分（蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷）和4個香豆素類成分（水合橙皮內(nèi)酯、馬爾敏、川陳皮素、橘紅素）進(jìn)行含量測定。

2.6.1 精密度考察 取“2.2”項下混合對照品，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、馬爾敏、川陳皮素、橘紅素8個成分峰面積RSD分別為0.52%、0.83%、1.0%、1.3%、1.1%、1.2%、1.6%、1.0%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性考察 取枳殼樣品（ZQ17）粉末約0.2 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測定，計算蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、馬爾敏、川陳皮素、橘紅素8個成分峰面積RSD分別為1.6%、1.6%、1.4%、1.3%、1.6%、1.6%、1.1%、1.7%，表 明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.3 線性關(guān)系考察 精密移取“2.2”項下對照品溶液，加甲醇稀釋成6個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程及線性范圍 Tab 3 Regression equation and linearity

2.6.4 重復(fù)性試驗 取枳殼樣品（ZQ17）粉末約0.2 g，平行6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、馬爾敏、川陳皮素、橘紅素8個成分含量RSD分別為1.6%、0.82%、0.66%、1.1%、1.3%、1.6%、1.1%、1.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 加樣回收試驗 取已知含量的枳殼樣品（ZQ17）粉末約0.1 g，精密稱定，平行6份，1∶1加入對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計算各成分的加樣回收率。結(jié)果8種成分的平均回收率在96.14%～104.88%，RSD在0.91%～4.2%。

2.6.6 樣品測定結(jié)果 精密吸取18批枳殼和10批枳實供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見表4。除川陳皮素外，枳實整體含量高于枳殼，尤其是柚皮苷和新橙皮苷含量遠(yuǎn)高于枳殼含量，說明柚皮苷和新橙皮苷為枳殼與枳實的差異性化合物，與PLS-DA分析結(jié)果一致。

表4 含量測定結(jié)果(mg·g-1) Tab 4 Content determination (mg·g-1)

2.6.7 結(jié)果分析 以上述8個含量測定指標(biāo)為檢驗變量，枳殼與枳實作為分組變量，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行獨立樣本檢驗分析，由表5可知，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、馬爾敏、川陳皮素含量在枳殼與枳實中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；橘紅素含量無顯著性差異（P＜0.05）。綜上，說明除橘紅素外，枳殼與枳實其余7個指標(biāo)成分含量變化明顯。

表5 獨立樣本檢驗分析表 Tab 5 Independent sample analysis

3 討論

本試驗在流動相、檢測波長、柱溫、流速等色譜條件優(yōu)化基礎(chǔ)上，采用UPLC法對18批枳殼藥材和10批枳實藥材進(jìn)行研究，建立了指紋圖譜，標(biāo)定了18個共有峰，通過對照品指認(rèn)出8個色譜峰。相似度分析結(jié)果表明，枳殼藥材與枳實藥材樣品相似度均大于0.90，枳殼藥材與枳實藥材指紋圖譜共有峰一致，表明兩者所含化學(xué)成分基本一致，但兩者共有峰峰面積相差較大，表明枳殼藥材與枳實藥材某些化學(xué)成分含量差異較大。為尋找枳殼藥材與枳實藥材差異性化合物，采用了聚類分析、主成分分析及PLS-DA分析等方法進(jìn)行分析，均能對枳殼與枳實進(jìn)行識別與聚類，并確認(rèn)了新橙皮苷、柚皮苷和橙皮苷等7個成分是枳殼與枳實質(zhì)量差異的主要物質(zhì)。

本研究在指紋圖譜基礎(chǔ)上，對枳殼藥材和枳實藥材中8個指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測定，除川陳皮素外，枳實整體含量高于枳殼，尤其是柚皮苷和新橙皮苷含量遠(yuǎn)高于枳殼藥材，與文獻(xiàn)[8，14-15]報道一致。黃酮類成分隨著果實成熟而呈下降趨勢，這與其在植物體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化過程相關(guān)，多種因素對不同生長發(fā)育階段物質(zhì)成分的積累具有一定影響?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃酮類化合物如橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷可促進(jìn)胃腸動力，有明顯的促進(jìn)胃排空、胃腸蠕動作用，這與枳實行氣力量較大，多用于破積導(dǎo)滯，通利大便，而枳殼作用較緩，長于理氣寬胸，消脹除痞的作用相一致，兩者功效性能不一，臨床應(yīng)用也有所側(cè)重。本試驗通過建立指紋圖譜和多指標(biāo)成分含量測定的方法，可較好地反映枳殼與枳實指紋圖譜的差異，也可為枳殼與枳實藥材的鑒別和質(zhì)量評價提供依據(jù)。