溫艷艷，馬一丹，黃山，劉艷，方玲，彭燦，3*（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230012；2.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實驗室，合肥 230012；3.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實驗室，合肥 230012；4.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，合肥 230022）

黃藤素，也稱巴馬?。╬almatine），是一種原小檗堿異喹啉生物堿，在其C2、C3、C9和C10部位含有四個甲氧基的季銨鹽[1-4]。黃藤素主要來源于傳統(tǒng)中藥紫蘇、黃連和延胡索，是一種天然的生物堿[5-7]。黃藤素具有廣泛的藥理作用和生物活性，近年來，人們對黃藤素的藥理作用進(jìn)行了大量研究，包括神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎和血脂調(diào)節(jié)[8-11]。這些藥理作用表明，黃藤素在預(yù)防和治療某些疾病方面具有價值，如癌癥、心臟肥大、骨質(zhì)疏松、糖尿病和糖尿病并發(fā)癥、阿爾茨海默病、特應(yīng)性皮炎及骨關(guān)節(jié)炎[12-13]等。

生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（biopharmaceutics classification system，BCS）是按照藥物的溶解性和腸道滲透性將藥物進(jìn)行分類的一個科學(xué)的框架系統(tǒng)[14]。根據(jù)生物藥劑學(xué)把藥物分為四類：BCS Ⅰ類，即高溶解性-高滲透性；BCS Ⅱ類，即低溶解性-高滲透性；BCS Ⅲ類，即高溶解性-低滲透性；BCS Ⅳ類，即低溶解性-低滲透性[15]。隨著BCS分類系統(tǒng)的完善，BCS分類系統(tǒng)逐步成為制藥企業(yè)向監(jiān)管部門申請生物等效性豁免的依據(jù)[16]。

目前市場上黃藤素相關(guān)的各種制劑均已被廣泛開發(fā)，并大量應(yīng)用于人們的日常生活中，但目前對黃藤素在BCS分類中的歸屬尚不明確，本文將對黃藤素的BCS分類屬性進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 儀器

電子天平（上海浦春計量儀器有限公司），P230 Ⅱ高效液相色譜系統(tǒng)（UV230 Ⅱ紫外-可見檢測器，大連依利特分析儀器有限公司），智城恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司），蠕動泵（上海嘉鵬，HL-2恒流泵）。

1.2 試藥

黃藤素對照品（成都普斯生物，批號：PS210402-01，純度＞98%），黃藤素原料藥（西安澤邦生物技術(shù)有限公司，批號：FHSW190619-1），三乙胺（潤捷化學(xué)，批號：20141130），磷酸（阿拉丁，批號：E2009049），乙腈（北京百靈威科技有限公司，批號：L330V117），氯化鈉（天津大茂化學(xué)試劑有限公司，批號：20200901），氯化鎂（天津福晨化學(xué)，批號：20070115），氯化鈣（批號：20180126）、葡萄糖（批號：S13J11H107301）、碳酸氫鈉（批號：Z11J12Y137272）、磷酸二氫鈉（批號：F27GS140266）、氯化鉀（批號：Z10M12Y141330）、鹽酸（批號：20180223）、醋酸鈉（批號：20190312）、冰醋酸（批號：20190529）、氫氧化鈉（批號：20200401）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），磷酸二氫鉀（阿拉丁，批號：L1918056），水為超純水。

1.3 實驗動物

SPF雄性大鼠，體質(zhì)量220 g左右[許可證號：SCXK（皖）2017-001，安徽醫(yī)科大學(xué)]。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃藤素含量測定分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Caprisil C18AQ（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相：0.02 mol·L-1磷酸溶液（含0.2%的三乙胺）-乙腈（65∶35）；檢測波長：346 nm；流速：1.0 mL·min-1；溫度：36℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 對照品溶液的配制 精密稱取黃藤素對照品2.05 mg加甲醇溶解并定容至10 mL，得對照品儲備液。精密量取對照品儲備液0.2 mL，加入甲醇稀釋至10 mL，過0.22 μm的微孔濾膜，即得。

2.1.3 供試品溶液的配制 精密稱取黃藤素原料藥2.12 mg加甲醇溶解并定容至10 mL，從中精密量取0.2 mL，加入甲醇稀釋至10 mL，過0.22 μm的微孔濾膜，即得。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 取適量對照品儲備液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為100、50、25、10、5 μg·mL-1的對照品溶液，過0.22 μm的微孔濾膜，進(jìn)樣檢測，以峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x）作線性回歸，得回歸方程y＝38.45x-46.07，R2＝0.9994，表明黃藤素在5～100 μg·mL-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度 精密量取對照品儲備液0.2 mL，加入甲醇稀釋至10 mL，過0.22 μm的微孔濾膜，進(jìn)樣檢測，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算得峰面積RSD值為0.19%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性 平行配制6份供試品溶液，進(jìn)樣檢測，計算6份供試品溶液中黃藤素含量的RSD值為0.27%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性 取供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣檢測，計算不同時間點(diǎn)的峰面積RSD值為0.62%，表明樣品在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2.5 加樣回收率 在已知含量的原料藥溶液中按照1∶0.8、1∶1.0和1∶1.2的比例加入適量對照品溶液，加甲醇定容，各平行3份，進(jìn)樣檢測，計算回收率。結(jié)果顯示黃藤素回收率在95%～105%，RSD均小于0.71%，表明該方法回收率良好。

2.3 溶解度實驗

2.3.1 溶解介質(zhì)的配制 ① pH 1.2的鹽酸溶液：取7.65 mL鹽酸加入到1000 mL水中，即得；② pH 4.0的醋酸鹽緩沖液：取20.5 mL 2 mol·L-1的醋酸溶液和1.22 g醋酸鈉加水稀釋至1000 mL，搖勻即得；③ pH 6.8的磷酸鹽緩沖液：取250 mL 0.2 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液，加入0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液112.0 mL，加水稀釋至1000 mL，搖勻即得；④ pH 7.4的磷酸鹽緩沖液：取250 mL 0.2 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液，加入0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液195.5 mL，加水稀釋至1000 mL，搖勻即得；⑤ 純凈水。

2.3.2 樣品溶液配制 稱取黃藤素原料藥適量，于5 mL離心管中，分別加入2 mL上述溶解介質(zhì)①～⑤，渦旋30 s，混勻，每種介質(zhì)設(shè)置3個平行組，置于37℃，100 r·min-1恒溫?fù)u床，振搖24 h后取出，4000 r·min-1離心25 min，取適量上清液加甲醇稀釋后，即得。

2.3.3 最大溶解度的計算 對于單體化合物，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）2015版工業(yè)指導(dǎo)原則中指出在37℃，pH 1～7.5內(nèi)，單次給藥最高劑量與溶解度的比值（D/S）小于250 mL的藥物為高溶解性的藥物，即D0＜1。將“2.3.2”項下制備的樣品，過0.22 μm的微孔濾膜，進(jìn)樣檢測，根據(jù)測得的結(jié)果計算樣品溶解濃度Cs，取平均值，計算D0值。

D0＝（M0/V0）/Cs

其中V0為250 mL，Cs為溶解度（mg·mL-1），M0為人體單次最高給藥劑量（mg）。根據(jù)上述公式計算的D0值，結(jié)合《中國藥典》中關(guān)于藥物溶解度的規(guī)定，進(jìn)行輔助證明藥物的溶解性。

參考《中國藥典》及藥智網(wǎng)數(shù)據(jù)查詢[藥智數(shù)據(jù)-醫(yī)藥健康產(chǎn)業(yè)數(shù)據(jù)服務(wù)商（yaozh.com）]黃藤素片劑人體單次最高給藥劑量為1200 mg，代入公式計算黃藤素的溶解度Cs和D0值（見表1）。

表1 黃藤素在不同pH值介質(zhì)中的溶解度 Tab 1 Solubility of palmatine in different pH media

根據(jù)D0值發(fā)現(xiàn)，在pH 1.2的介質(zhì)中，黃藤素屬于低溶解度藥物，在pH 4.0、6.8、7.4和水中屬于高溶解度的藥物。根據(jù)《中國藥典》對溶解度的定義：微溶系指溶質(zhì) l g（mL）能在溶劑100～1000 mL中溶解；黃藤素溶解性屬于微溶，又因其D0值接近1，故由此認(rèn)為黃藤素為低溶解度的藥物。

2.4 滲透性測定

本實驗主要采用在體單向原位腸灌流模型測定黃藤素在大鼠不同腸段的滲透性。

2.4.1 Krebs-Ringer（K-R試液）小腸營養(yǎng)液的配制分別精密稱取NaCl 7.80 g，KCl 0.35 g，CaCl20.37 g，NaH2PO40.32 g，MgCl20.02 g，葡萄糖1.40 g于500 mL的蒸餾水中溶解完全后，精密稱取NaHCO31.37 g加少量蒸餾水單獨(dú)溶解后，分少量多次緩慢加入，邊超聲邊攪拌，最后加蒸餾水定容至1000 mL。

2.4.2 含藥K-R液的制備 參照《中國藥典》2020年版中黃藤素片的含量及常用劑量，確定人口服常用劑量。假設(shè)按照最大劑量計算。對實驗所需的大鼠進(jìn)行稱重，根據(jù)徐叔云教授主編的《藥理實驗方法學(xué)》中的等效劑量系數(shù)折算法，人的體質(zhì)量按70 kg計算，換算成大鼠的劑量則為人體給藥劑量的0.18倍。單向原位腸灌流實驗中，常用的灌流體積為100 mL。腸灌流液中藥物的濃度＝換算的大鼠的劑量/100 mL，以K-R試液作為溶劑。人體黃藤素單次劑量400 mg，大鼠體內(nèi)為72 mg/200 g，即360 mg·kg-1。灌流液濃度為72 μg·mL-1。

2.4.3 腸灌流實驗過程 SPF雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，禁食不禁水18 h，按0.8 mL/100 g注射20%烏拉坦麻醉，腹部沿腹中線剪開3～4 cm，分離實驗用腸段：十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸，各腸段取8～10 cm，各腸段進(jìn)口端與注射泵相連，用預(yù)熱至37℃的生理鹽水以5 mL·min-1的速度對所取腸道內(nèi)容物進(jìn)行沖洗，沖洗干凈后排空生理鹽水。將注射泵流速調(diào)為0.2～0.3 mL·min-1灌流藥液，約30 min后藥物吸收達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。開始計時，用已知重量的小瓶在各腸段藥液出口處每隔15 min收集一次，作為一次取樣點(diǎn)，同時用下一個已知重量的小瓶替換，計算收集前后小瓶重量差，收集8次后，實驗完畢。實驗結(jié)束后處死大鼠并剪下被灌流的腸段，測量其長度和內(nèi)徑。取適量收集到的藥液加入甲醇對半稀釋，過0.22 μm的微孔濾膜，進(jìn)樣檢測，測定不同時間點(diǎn)流出藥液中藥物含量，代入公式，計算有效滲透系數(shù)Peff、腸吸收速率常數(shù)Ka和腸吸收分?jǐn)?shù)Fa。

Peff＝Qin·ln[Cout（cor）/Cin]/2πrL

Ka＝[1-Cout（cor）/Cin]Qin/V

Fa＝[1-Cout（cor）/Cin]×100%

Cout（cor）＝Cout（Qout/Qin）

Cout＝（Mout/Dout）/t

Qin是灌流液流速（mL·min-1），L是灌流腸段長度（cm）；r是灌流腸段半徑（cm）；Cin是灌流液中藥物初始質(zhì)量濃度（mg·L-1）；Cout（cor）是經(jīng)重量法校正后的灌流收集液中藥物質(zhì)量濃度（mg·L-1）；V是灌流腸道體積（mL）；Qout是通過灌流液密度測定的流出速度（mL·min-1）；Cout是灌流收集液中藥物質(zhì)量濃度（mg·L-1）；Mout是灌流收集液質(zhì)量（g），Dout是灌流收集液密度（g·mL-1），t是取樣周期（min）。

Peff（rat）與Peff（human）的轉(zhuǎn)化：

Peff（human）＝3.6×Peff（rat）＋0.03×10-4

Fa（human）＝1-exp[-38450×Peff（rat）]

2.4.4 滲透性結(jié)果 根據(jù)測得的數(shù)據(jù)代入上述公式，計算得黃藤素相關(guān)腸吸收參數(shù)見表2。結(jié)果顯示在十二指腸、回腸和結(jié)腸段吸收差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與空腸段相比，吸收差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且黃藤素在十二指腸、回腸和結(jié)腸段的吸收明顯大于空腸段吸收。

通常情況下認(rèn)為Peff（rat）＞5.0×10-5cm·s-1，Pefff（human）＞4.7×10-5cm·s-1的藥物為高滲透性藥物。根據(jù)FDA規(guī)定，藥物吸收百分率不小于90%的藥物為高滲透性藥物，根據(jù)歐盟藥品審評局（EMEA）和世界衛(wèi)生組織（WHO）的規(guī)定，藥物吸收百分率不小于85%的藥物為高滲透性藥物。

根據(jù)表2結(jié)果可知黃藤素在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的Peff（rat）均小于5.0×10-5cm·s-1，Pefff（human）均小于4.7×10-5cm·s-1，根據(jù)公式換算得人體吸收百分率Fa（human）均小于85%，故可判斷黃藤素屬于低滲透性藥物。

表2 黃藤素在不同腸段的Peff(rat)值、Ka值、Peff(human)值和Fa(human) Tab 2 Peff(rat)，Ka，Peff(human)，and Fa(human) of palmatine in different intestinal segments

結(jié)合溶解度和滲透性數(shù)據(jù)，可確定黃藤素為BCS Ⅳ類藥物。

3 討論

BCS主要應(yīng)用于化學(xué)藥物的分類，對于中藥單一天然產(chǎn)物來說尚未進(jìn)行明確的分類，故本研究主要針對中藥天然產(chǎn)物黃藤素進(jìn)行研究，并對其進(jìn)行BCS分類，判斷其BCS分類屬性。

不同當(dāng)局對于高溶解度高滲透性的規(guī)定如下：FDA認(rèn)為37℃條件下藥物單次最高劑量可溶解于250 mL，pH 1～7.5的介質(zhì)中，且≥90%的藥物可以在小腸中吸收；EMEA認(rèn)為37℃條件下藥物單次最高劑量可溶解于250 mL，pH 1～8的介質(zhì)中，藥物在小腸中呈線性吸收或完全吸收；WHO認(rèn)為37℃條件下藥物單次最高劑量可溶解于250 mL，pH 1.2～6.8的介質(zhì)中，且≥85%的藥物可以在小腸中吸收。因此本研究中選擇pH 1.2、4.0、6.8、7.4 和水進(jìn)行溶解度考察，根據(jù)計算出的D0值判斷藥物溶解度。根據(jù)D0值計算結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃藤素在酸性條件下屬于低溶解度藥物，在弱堿性以及中性條件下則屬于高溶解度藥物，這種情況可能與藥物自身結(jié)構(gòu)有關(guān)，同時也表明FDA 2015版工業(yè)指導(dǎo)原則中采用D0值判斷藥物的溶解度是有缺陷的，因此借助《中國藥典》中對于溶解度的規(guī)定輔助證明藥物的溶解性，結(jié)果表明黃藤素屬于低溶解度的藥物。

關(guān)于滲透性研究，目前主要研究方法有離體腸囊外翻模型、Caco2細(xì)胞模型、人工滲透膜（PAMPA）模型以及在體單向原位腸灌流模型。本文主要采用在體原位腸灌流模型，相對于其他方法而言該方法相對簡單，且成本低，易操作；同時在實驗過程維持體內(nèi)環(huán)境、神經(jīng)支配、血液供應(yīng)等的特點(diǎn)及擁有黏液層的存在、活性載體和酶的表達(dá)等優(yōu)勢，相對于體外法可以更好地模擬藥物在體內(nèi)的吸收過程[17-18]。但該方法的主要缺點(diǎn)在于進(jìn)行實驗的動物數(shù)量較多，實驗結(jié)果易受動物個體差異影響。本文通過溶解度和滲透性研究最終確定黃藤素屬于低溶解度、低滲透性藥物，即為BCS Ⅳ類藥物。