李劍勛 步雨珊 劉銀雪 劉伊索 印伯星 周 煒 易華西

(1.中國海洋大學 食品科學與工程學院, 山東 青島 266003；2.揚州市揚大康源乳業(yè)有限公司, 江蘇 揚州 225000)

食品安全是關乎國計民生的重大問題,其中微生物安全是食品安全中的主要問題。 多年來抗生素在食品產(chǎn)業(yè)鏈不同環(huán)節(jié)的過度使用和濫用,導致致病菌或食品腐敗菌的耐藥性不斷提高[1]。 因此,尋求安全、高效且不易引起耐藥的新型抗生素替代品是目前食品安全和生物替抗領域的研究重點。 抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs),是一類具有抗細菌、抗真菌、抗病毒等多種生物活性的小分子多肽,其憑借獨特的膜穿孔機制發(fā)揮抗菌作用[2]。 由于具有獨特的抗菌機制,不易使致病菌產(chǎn)生耐藥性,AMPs 在食品安全和生物替抗領域具有廣闊的應用前景；但大部分AMPs 存在抑菌譜窄、抑菌活性低、生物相容性差和生產(chǎn)成本高等問題,限制了其應用。因此,亟需開發(fā)抑菌譜廣、抗菌活性強、安全性高且成本低廉的AMPs。

盡管AMPs 的作用機制仍存在爭議,但普遍認為AMPs 的活性發(fā)揮依賴于肽序列中疏水性和陽離子殘基排列而成的兩親性結構[3]。 研究表明,提高疏水性和疏水力矩可以同時提高抗菌肽對細菌細胞膜的穿透力和溶血活性[4]。 因此,通過改變AMPs的疏水性和兩親性分布,使抑菌活性和生物相容性達到理想的平衡狀態(tài)是AMPs 理性設計的關鍵。Jiang 等[5]在α-螺旋肽的非極性表面引入帶有正電荷的賴氨酸,改造后的肽在保留了抑菌活性的同時溶血活性降低,細胞選擇性提高。 Misawa 等[6]將賴氨酸殘基設計在螺旋結構的一側,將亮氨酸和丙氨酸殘基置于螺旋的另一側,得到的肽抑菌活性良好且細胞毒性較低。 由于α-螺旋在序列排列上具有周期性,因此易于對其兩親性特征進行設計。 隨著生物信息學的迅速發(fā)展,使得基于生物信息學數(shù)據(jù)庫、預測及分析工具獲得新型AMPs 的方法越來越具有可行性和科學性[7]。 本研究結合Database filtering 方法[8]、合理設計思路以及生物信息學工具進行新型AMPs 的從頭設計,設計方法便捷高效,避免了傳統(tǒng)序列優(yōu)化方法的盲目性和不確定性,得到了一條具有廣譜、高效抑菌活性,高細胞選擇性的YHX-1,旨在為解決AMPs 的應用瓶頸提供理論依據(jù)和技術支撐,為開發(fā)新一代高效、安全的AMPs 提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(Escherichia coliATCC 25922)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimuriumATCC 14028)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosaATCC 27853)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC 8095)、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenesATCC 19115)、變異鏈球菌(Streptococcus mutansATCC 25175),中國海洋大學功能性乳品與益生菌工程研究室。 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW 264.7 細胞,中國科學院細胞庫；LB 肉湯培養(yǎng)基、BHI 肉湯培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、瓊脂粉,青島海博生物技術有限公司；三氟乙醇TFE、十二烷基硫酸鈉SDS、MTT 噻唑藍、TritonX-100,北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Multiskan FC 型酶標儀,美國賽默飛世爾科技公司；TGL-16M 型臺式高速冷凍離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SHP-250 型生化培養(yǎng)箱,上海精宏實驗設備有限公司；THZ-98A 型恒溫振蕩器,上海一恒科技有限公司；BHC-1300IIA 型二級生物安全柜,蘇州凈化設備有限公司；LCI-270型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱,上海龍躍儀器設備有限公司；J-815 型圓二色(CD)光譜儀,日本分光株式會社。

1.3 實驗方法

1.3.1 AMPs 的從頭設計

從抗菌肽數(shù)據(jù)庫APD[9]中篩選出對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有抑菌活性的AMPs 序列組成序列子集,對序列長度、帶電荷數(shù)、疏水氨基酸比例和氨基酸組成等序列參數(shù)進行統(tǒng)計分析,按照優(yōu)勢參數(shù)的選取原則確定新設計AMPs 的序列特征參數(shù)。 采用生物信息學預測及分析工具,使用數(shù)據(jù)庫CAMPR3、DRAMP 及DBAASP[10-12]對不同氨基酸排列順序的肽序列成為AMPs 的概率進行預測,使用軟件Heliquest、Expasy[13-14]對序列相對分子質量、平均疏水值、平均疏水力矩、不穩(wěn)定性指數(shù)、脂肪族指數(shù)、半衰期、螺旋輪圖等性質進行預測分析,使用I-TASSER、Pep-fold[15-16]對二級結構進行預測,并利用PyMOL 軟件可視化,進而篩選出最優(yōu)的AMPs序列。

1.3.2 瓊脂擴散法測定抑菌活性

抗菌肽由強耀生物科技(上海)有限公司合成,單次制備量為10 mg,純度高于95%,冷凍干燥后分裝規(guī)格為1 mg/管。 抗菌肽凍干粉保存于-20 ℃環(huán)境中,現(xiàn)用現(xiàn)配,溶液可短期保存至4 ℃冰箱中。 將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和鼠傷寒沙門氏菌接種于LB 肉湯培養(yǎng)基,單增李斯特菌和變異鏈球菌接種于BHI 肉湯培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。配置LB 和BHI 半固體培養(yǎng)基(瓊脂質量分數(shù)0.6%),待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃后以每皿20 mL 的體積量,加入7 μL 菌液振蕩混勻后倒入擺放好牛津杯的培養(yǎng)皿中,待培養(yǎng)基凝固后拔除牛津杯完成打孔。 每孔中加入160 μL AMPs 溶液(配置使用1 mg 抗菌肽溶于3 mL 超純水),置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后測量抑菌圈直徑[17],測量3 次取平均值。

1.3.3 最小抑菌濃度及最小殺菌濃度測定

參考Tang 等[18]的方法,向96 孔板中加入培養(yǎng)至對數(shù)生長期稀釋至1 × 106CFU/mL 的菌液50 μL,同時采用二倍稀釋法在孔中加入各濃度梯度AMPs 溶液(4 ～512 μg/mL)50 μL,并以未加AMPs的菌液作為陰性對照組,空白培養(yǎng)基作為空白對照組。 在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h 后測量各孔的OD600nm,取菌株生長被完全抑制的最低濃度作為AMPs 的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)。 從所有菌株生長被完全抑制的孔中吸取50 μL 樣液,涂布于相應的固體培養(yǎng)基表面,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后計算菌落數(shù),以殺死99.9%細菌的最低藥物濃度作為AMPs 的最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)。

1.3.4 殺菌動力學曲線測定

以單增李斯特菌為指示菌,將其培養(yǎng)至對數(shù)生長期并調(diào)整菌落數(shù)至1 ×105CFU/mL,同最小殺菌濃度的AMPs 溶液混合后,分別于0、5、10、20、30、60、120、240、300 min 取樣,用生理鹽水(質量濃度為0.009 g/mL 的NaCl 溶液)稀釋至合適倍數(shù)后涂布于BHI 固體培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后統(tǒng)計細菌存活情況。

1.3.5 AMPs 穩(wěn)定性測定

參考Mishra 等[8]的方法,以單增李斯特菌作為指示菌,探究不同環(huán)境條件對AMPs 抗菌活性的影響。 將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的單增李斯特菌分別在含有200 mmol/L NaCl、2 mmol/L CaCl2、10% ～25%人血漿,以及微酸性(pH 值5.4、6.8、7.4)培養(yǎng)環(huán)境中與AMPs 共孵育,按照1.3.3 節(jié)的方法測定MIC 的變化。

1.3.6 溶血活性測定

在簽訂知情同意書的前提下,用采血針抽取1 mL 來自健康志愿者的新鮮血液置于肝素鈉抗凝管中,4000 r/min 離心10 min 后取沉淀,將紅細胞用PBS 緩沖液沖洗3 次并重懸。 在96 孔板中加入終濃度為4 ～512 μg/mL AMPs 溶液與紅細胞懸液共孵育,以PBS 緩沖液作為陰性對照,以TritonX-100(質量濃度為0.001 g/mL)作為陽性對照。 在37 ℃恒溫孵育1 h 后,離心取上清液并使用酶標儀測定OD570nm[19]。 溶血活性計算如式(1)。

式(1)中,AT為實驗組的吸光度；AC為陽性對照組的吸光度；AO為陰性對照組的吸光度。

1.3.7 細胞毒性測定

參考Khara 等[20]的方法,測定了YHX-1 對小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7 的細胞毒性。 將凍存于液氮中的RAW264.7 細胞復蘇后在含有胎牛血清(體積分數(shù)為10%)和雙抗(質量濃度為0.01 g/mL)的DMEM 培養(yǎng)基中,37 ℃、體積分數(shù)5% CO2條件下傳代培養(yǎng)。 以1 ×104細胞/mL 的密度將細胞接種于96 孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。 待細胞貼壁后,吸去舊培養(yǎng)基,加入200 μL 使用二倍稀釋法得到的不同質量濃度 YHX - 1 溶液(4 ～512 μg/mL)處理24 h。 隨后,用200 μL 新鮮DMEM和40 μL MTT(5 mg/mL)溶液取代培養(yǎng)基,并在37 ℃下再孵育4 h。使用150 μL 的DMSO 溶解得到的甲瓚晶體,并在595 nm 下測量吸光度。 以未經(jīng)處理的細胞作為對照組并計算細胞存活率。

1.3.8 圓二色光譜分析

使用CD 光譜法測定YHX-1 的二級結構[21]。將YHX-1 分別溶于10 mmol/L PBS(pH =7.4)溶液、體積分數(shù)50% 的三氟乙醇(TFE) 溶液和30 mmol/L十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液中,使肽的終濃度為200 μmol/mL。 配置好的多肽溶液加入光徑為1 mm 的比色皿中,在室溫條件下用CD 光譜儀測定YHX-1 在190 ～250 nm 的橢圓率,掃描速度為100 nm/min,重復3 次取平均值,并根據(jù)式(2)計算多肽的平均殘基橢圓率。

式(2)中,θM為平均殘基橢圓率,deg·cm2·dmol-1；θobs為實測橢圓率,mdeg；c為多肽濃度,mmol/L；l為光徑,mm；n為多肽中的氨基酸殘基個數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗結果以平均值±標準偏差表示,方差分析采用SPSS 23.0 軟件中One-way ANOVA 分析,P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。 實驗獨立重復3 次。

2 結果與分析

2.1 AMPs 的設計結果

將從AMPs 數(shù)據(jù)庫APD 中篩選得到的843 條AMPs 序列組成序列子集,該序列子集包括了已被證實對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌有抗菌活性的天然及人工合成AMPs。 對AMPs 序列參數(shù)進行分析,包括序列長度、帶電荷數(shù)、疏水氨基酸比例和氨基酸組成等。 依據(jù)Database filtering 方法中的優(yōu)勢參數(shù)選取原則同時結合合理設計思路,確定了新型AMPs 的各項序列參數(shù)(見表1)。

為降低合成成本,同時降低細胞毒性,序列長度選擇參數(shù)頻率第一位的13。 選取在數(shù)據(jù)庫中出現(xiàn)頻率最高的甘氨酸Gly、賴氨酸Lys、絲氨酸Ser、亮氨酸Leu 組成AMPs 序列,其中帶正電氨基酸Lys 和極性不帶電荷氨基酸Ser 組成抗菌肽的極性面,選取疏水性氨基酸Leu 形成疏水面,來保證AMPs 的兩親性結構。 電荷數(shù)確定為+ 5,保證AMPs 對細菌細胞膜的親和力。 在此基礎上使用Expasy 和Heliquest 對不同氨基酸排列順序肽序列的螺旋輪圖及物化性質進行分析,使用I-TASSER等對二級結構進行預測,篩選得到的最優(yōu)肽序列YHX-1 及物化性質如表1,螺旋輪圖及二級結構預測結果如圖1。

表1 YHX-1 的序列參數(shù)及物化性質Tab.1 Sequence parameters and physicochemical properties of YHX-1

圖1 YHX-1 的螺旋輪圖及二級結構預測Fig.1 Helical wheel and predicted secondary structure of YHX-1

通過GRAVY(總平均疏水值)和疏水力矩可以看出預測的肽序列具有適中的疏水性和較好的兩親性,在對細菌細胞膜具有較好親和力的同時有利于深入細胞膜的磷脂雙分子層,進而破壞細胞膜的完整性。 脂肪族指數(shù)(aliphatic index)和不穩(wěn)定性指數(shù)(instability index)均被認為與肽的穩(wěn)定性相關,其中不穩(wěn)定性指數(shù)低于40 表明了序列較好的穩(wěn)定性,通過預測結果可知YHX-1 具有較好的穩(wěn)定性。 基于3 種不同算法(SVM、Random Forest、ANN) 使用CAMPR3 對AMPs 的成肽可能性進行預測,肽序列YHX-1 的成肽可能性均在0.94 以上。

2.2 YHX-1 的抑菌活性分析

通過瓊脂擴散法、最小抑菌濃度、最小殺菌濃度的測定以及殺菌動力學曲線對YHX-1 的體外抑菌活性進行了評價,見表2。 結果表明,YHX-1 對革蘭氏陽性菌(單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、變異鏈球菌)和革蘭氏陰性菌(銅綠假單胞菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌)均有明顯的抑菌活性。 其中,對單增李斯特菌的抑菌圈直徑最大,達到了20.56 mm。最小抑菌濃度及最小殺菌濃度測定結果表明, YHX - 1 對不同致病菌的 MIC 在4 ～128 μg/mL,其中對單增李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果最好,MIC 均為4 μg/mL。 YHX-1 對各株致病菌的MBC 為MIC 的1 ～4 倍,與朱潔[22]的結果一致。 YHX-1 在1 ×MBC(8 μg/mL)對單增李斯特菌的殺菌動力學曲線如圖2。 由圖2 可知,YHX-1 在2 h 內(nèi)可殺死99.99%以上的菌體,具有很高的殺菌效率。

圖2 YHX-1 對單增李斯特菌的殺菌動力曲線Fig.2 Time-killing curve of L. monocytogenes treated with YHX-1

表2 YHX-1 對致病菌的抑菌活性Tab.2 Antimicrobial activity of YHX-1 against pathogenic bacteria

2.3 YHX-1 的穩(wěn)定性分析

在鹽離子和血漿環(huán)境中的活性降低一直是AMPs 開發(fā)中不可忽視的問題。 血漿中的高密度脂蛋白和清蛋白與LL-37 結合后可使其失活[23],鹽離子可能通過降低陽離子AMPs 對細胞膜表面的靜電吸附力或降低AMPs 與細菌外膜的相互作用降低抗菌肽的抑菌活性[24]。 本研究探究了在不同體積分數(shù)血漿、不同鹽離子濃度以及不同pH 值下YHX-1 的MIC 變化情況(表3)。 結果表明,隨著培養(yǎng)環(huán)境中血漿體積分數(shù)的增大, YHX-1 對單增李斯特菌的抑菌活性不斷降低。 在體積分數(shù)25%的血漿環(huán)境下,MIC 增大到32 μg/mL,為原來的8 倍。 在Na+和Ca2+環(huán)境中YHX-1 對單增李斯特菌的MIC 會提高2 ～4 倍,說明YHX-1 對鹽離子具有一定的敏感性,但仍然會保持良好的抗菌活性。 比較研究了5.4、6.8 和7.4 這3 個pH 梯度對肽抑菌活性的影響,結果表明,不同的微酸性環(huán)境對YHX-1 的MIC不會產(chǎn)生顯著影響。

表3 不同環(huán)境條件下YHX-1 對 單 增 李斯特菌的MICTab.3 MIC of YHX-1 against L. monocytogenes at different environmental conditions

2.4 YHX-1 的溶血活性分析

由于AMPs 通過與膜直接作用發(fā)揮抗菌活性,當多肽中各項序列參數(shù)失衡時,AMPs 不僅可以殺滅致病微生物,對哺乳動物細胞同樣會存在裂解毒性。 天然及人工合成的AMPs 往往具有溶血活性,如天然線性陽離子肽蜂毒肽(melittin) 在2.219 μg/mL時即會引起10%以上的人血紅細胞溶血[25]。 因此缺乏足夠的細胞選擇性是當前AMPs廣泛應用的主要瓶頸之一。 本研究測定了YHX-1對人血紅細胞的溶血活性(圖3)。 結果表明,在測試質量濃度下(2 ～256 μg/mL),YHX-1 的溶血率均低于10%；256 μg/mL 的溶血率為4.71%,8 μg/mL 僅會引起0.57%的人紅細胞溶血。 Zhang 等[26]以蜂毒肽為模板進行設計優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)當將疏水表面的丙氨酸和異亮氨酸替換為帶正電荷的極性氨基酸賴氨酸或精氨酸后,肽A(A1R、A8R、I17R)的最小溶血濃度增至200 μmol/L,同時抗菌活性與原肽相似。 因此,本研究設計的YHX-1 細胞選擇性高,具有很好的生物相容性。

圖3 YHX-1 對人紅細胞的溶血活性Fig.3 Hemolytic activity of YHX-1 on human erythrocytes

2.5 YHX-1 的細胞毒性分析

使用MTT 法測定了不同質量濃度的YHX-1 對RAW264.7 細胞的細胞毒性,結果如圖4。 YHX-1對RAW264.7 細胞的毒性作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性,且與溶血活性表現(xiàn)出相同的作用趨勢。 在低于16 μg/mL 時,YHX-1 作用24 h 后的細胞存活率均在90.00% 以上；而當肽質量濃度增大到256 μg/mL時,YHX-1 對RAW 264.7 的細胞毒性較明顯,細胞存活率降低至66.55%。 因此,YHX-1質量濃度在MIC 時表現(xiàn)出了較好的生物相容性。

圖4 YHX-1 對RAW 264.7 細胞的細胞毒性Fig.4 Cytotoxicity of YHX-1 on RAW 264.7 cells

2.6 YHX-1 的二級結構測定

CD 光譜用于研究各種環(huán)境中多肽的二級結構。本研究使用50% TFE 模擬疏水性環(huán)境,用于評估多肽的固有螺旋傾向,30 mmol/L SDS 模擬磷脂雙分子層的陰離子環(huán)境,10 mmol/L PBS(pH=7.4)模擬親水環(huán)境,結果如圖5。 YHX-1 在30 mmol/L SDS和50% TFE 環(huán)境中,在192 nm 附近出現(xiàn)正峰,在208、222 nm 附近出現(xiàn)2 個特征性的負峰,說明在細胞膜模擬環(huán)境中均呈現(xiàn)α-螺旋構象。 而YHX-1 在PBS 模擬的水相環(huán)境中呈現(xiàn)無規(guī)卷曲的狀態(tài)。

圖5 YHX-1 在不同環(huán)境中的圓二色光譜Fig.5 CD spectra of YHX-1 in different environments

3 結論

結合Database filtering 方法、合理設計及生物信息學預測及分析工具設計得到了對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有良好抑菌活性的肽YHX-1。YHX-1 對單增李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌的MIC為4 μg/mL,在2 h 內(nèi)可殺死99.99%以上的菌體,256 μg/mL 時的溶血率為4.71%,同時具有良好的鹽離子及血漿穩(wěn)定性和生物相容性。 圓二色光譜分析表明,YHX-1 在細胞膜模擬環(huán)境中呈現(xiàn)典型的α-螺旋構象。 YHX-1 具有抑菌譜廣、抑菌活性高、細胞選擇性好、序列短及合成成本低等優(yōu)點,有望作為一種生物抗菌劑應用于食品防腐保鮮和生物替抗領域。 同時,本研究應用的AMPs 從頭設計方法較為便捷高效,可為開發(fā)新一代高效、安全的AMPs 提供參考。