勵建榮, 檀茜倩, 王 丹, 崔方超, 呂欣然

(渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心, 遼寧 錦州 121013)

益生菌是在積累到一定數(shù)量的時候?qū)θ梭w健康產(chǎn)生有利影響的一類活的微生物,具有提高免疫力、增強腸道菌群調(diào)節(jié)能力、治療代謝疾病和改善情緒等多種功能[1-4]。 益生菌種類很多,其中的乳酸菌,包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、魏斯氏菌(Weissella)等[5]中的大部分,是公認的一類安全益生菌,其為革蘭氏陽性、微需氧、不形成芽孢、接觸酶陰性；另一類研究較多的益生菌為芽孢桿菌屬中的一部分細菌,其菌株特點為革蘭氏陽性、需氧或厭氧、可形成孢子,孢子的形成使其能更好地耐受高溫、高滲透壓和酸性環(huán)境,相比于乳酸菌在應(yīng)用上更具優(yōu)勢[6]；此外還有布勞特氏菌屬(Blautia)的部分細菌,屬毛螺菌科,多分布于哺乳動物的糞便和腸道,這個菌屬的一些菌曾經(jīng)一度被劃分到梭菌屬和瘤胃球菌屬中,其生長特性為嚴格厭氧,不具有運動性,成對或者成鏈狀出現(xiàn),大部分菌株不形成孢子但對環(huán)境(酸、鹽和氧化反應(yīng))具有較強的耐受性[7]；一些與腸道共生的真菌比如鮑氏酵母菌也被認為具有益生功效[8]。 食源性致病微生物在食品中的存在不僅會加速食品腐敗也會引發(fā)食用安全風(fēng)險。 目前研究發(fā)現(xiàn),很多益生菌及從其發(fā)酵液中分離的代謝物都具有抑制食源性致病微生物的作用,具有在食品安全和品質(zhì)控制方面應(yīng)用的潛力；并且由于其兼具益生特性,相對于其他食源性致病微生物的控制技術(shù)更具優(yōu)勢,有很好的開發(fā)前景[9-11]。 本研究擬分析現(xiàn)有益生菌及其代謝物對食源性致病微生物的抑制機制,基于目前益生菌及其代謝物在食品安全和品質(zhì)控制中的應(yīng)用研究實例,闡述其在果蔬、肉類等食品中的應(yīng)用方式、應(yīng)用條件、對貨架期的延長效果,并對其應(yīng)用研究趨勢進行探討。希望為基于益生菌及其代謝物的食品安全和品質(zhì)控制技術(shù)開發(fā)和應(yīng)用提供有益的借鑒和參考。

1 抑制食源性致病微生物的益生菌及其代謝物類型

益生菌及其產(chǎn)生的代謝物種類繁多,研究發(fā)現(xiàn),很多益生菌及其代謝物具有抑制包括細菌、真菌、病毒在內(nèi)的多種食源性致病微生物的功能。 益生菌對食源性致病微生物的抑制效果不僅取決于其種類、培養(yǎng)條件、分泌的代謝物種類,也與食源性致病微生物本身的特性(種類、耐藥性、生物被膜形成能力、毒力因子產(chǎn)生能力)有關(guān)[12-13]。 表1 列出了部分對食源性致病微生物有抑制作用的益生菌及其代謝物類型。 益生菌的生長和代謝受到自身特性和多種環(huán)境因素的影響,不同來源的同種益生菌的抑菌譜也有差別。 益生菌的代謝產(chǎn)物成分復(fù)雜,對食源性致病微生物起到抑制作用的活性物質(zhì)主要有肽類,如抗細菌肽和抗真菌肽,包括乳酸鏈球菌素(Nisin)、乳酸片球菌素(pediocin)、枯草菌素(subtilin)等；有機酸類,如乳酸、丙酸、醋酸、苯乳酸、吲哚乙酸等；此外還有過氧化氫、醇類、酚類、酶類和多糖類等多種物質(zhì)。 可通過微生物的抑制實驗結(jié)合分子生物學(xué)(基因檢測或基因組分析)以及儀器分析[氣相色譜-質(zhì)譜或高效液相色譜-質(zhì)譜(GC-MS 或HPLCMS)]等手段對這些活性物質(zhì)進行探定和分離。

表1 抑制食源性致病微生物的益生菌及其代謝物Tab.1 Inactivation effect of probiotics and their metabolites against foodborne pathogens

目前大量具有抑制食源性致病微生物的益生菌資源尚待挖掘,因為大部分來源的樣品菌群成分復(fù)雜[29]。 隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,常利用擴增子技術(shù)或宏基因組學(xué)技術(shù)對樣品中的菌群結(jié)構(gòu)進行分析,在確定其中具有益生潛力的菌株類型后可針對性采用合適的培養(yǎng)基對益生菌進行分離[30-31]；同時,培養(yǎng)組學(xué)的發(fā)展也加速了益生菌株資源的挖掘和研究。 培養(yǎng)組學(xué)是將優(yōu)化的培養(yǎng)條件應(yīng)用于微生物群研究的一種技術(shù),將基質(zhì)輔助激光解吸/電離-時間飛行質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI -TOF MS)與16S rRNA 擴增子測序技術(shù)結(jié)合對菌株進行鑒定。 培養(yǎng)組學(xué)高通量的培養(yǎng)條件可獲得大量菌株,尤其適宜一些對生長條件要求挑剔菌株的培養(yǎng),常應(yīng)用于新益生菌資源的挖掘中[32]。

2 益生菌及其代謝物對食源性致病微生物的抑制機制

2.1 對細菌的抑制機制

食源性致病菌常以兩種狀態(tài)存在,浮游態(tài)和生物被膜態(tài)。 細菌的生物被膜是細菌為了應(yīng)對極端環(huán)境所采取的保護行為。 生物被膜的形成始于黏附,是一個涉及菌群結(jié)構(gòu)、功能和組分之間變化的動態(tài)過程。 細菌會被大量的胞外多糖骨架包裹,附著在食品或者加工設(shè)備的表面,使其清除變得更加困難[33]。 益生菌及其代謝物對細菌的抑制機制主要包括破壞細胞結(jié)構(gòu),干預(yù)細菌內(nèi)部DNA、RNA、蛋白、細胞壁和脂肪酸等生命活動所需要的關(guān)鍵物質(zhì)合成,與細菌競爭關(guān)鍵性的營養(yǎng)物質(zhì),阻斷關(guān)鍵的能量代謝通路,干擾細菌群體行為和破壞生物被膜結(jié)構(gòu)等等。 這些機制與益生菌及其代謝物與食源性致病菌的類型和特性有關(guān),常同時包含多種機制。 圖1 列舉了其中的部分機制。

圖1 益生菌及其代謝物對食源性致病菌的抑制機制Fig.1 Inactivation mechanism of probiotics and their metabolites against foodborne pathogens

2.1.1 對浮游狀態(tài)細菌的抑制機制

2.1.1.1 破壞細胞壁完整性

益生菌分泌的代謝物會作用于細胞壁,在細胞壁上形成孔洞,引起內(nèi)部物質(zhì)溶出,最終導(dǎo)致細胞死亡。 很多抗菌肽對細菌的抑制多采用這種機制,且其抑菌譜與抗菌肽結(jié)構(gòu)和食源性致病菌的類型有關(guān)。 與細胞壁上的受體結(jié)合是抑制過程的第一步,結(jié)合位點包括脂質(zhì)Ⅱ和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的甘露糖滲透酶(mannose permease of the phosphotransferase system,man-PTS)等。 脂質(zhì)Ⅱ作為膜錨定的細胞壁合成前體,對細胞壁肽聚糖的生物合成至關(guān)重要。 Nisin 和很多羊毛硫類細菌素都以脂質(zhì)Ⅱ作為其對接位點[34]。 脂質(zhì)Ⅱ不是pediocin 與細胞結(jié)合的靶標(biāo)位點,pediocin 分子與目標(biāo)細菌接觸后,其分子上的正電荷會與細胞壁上的磷脂壁酸的負電荷結(jié)合,隨后pediocin 分子插入這些目標(biāo)細菌的細胞質(zhì)膜,形成孔洞[35]。 另一種由戊糖片球菌分泌的新型抗菌肽pentocin ZFM94 在細胞上形成孔洞同樣不以脂質(zhì)Ⅱ為受體,其具體結(jié)合位點還未明確,但這種抗菌肽抑菌譜很寬,對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都具有抑制作用,探明其結(jié)合機制對其應(yīng)用有十分重要的作用[36]。 分離自植物乳桿菌SHY 21-2 的植物乳桿菌素LP 21-2 (分子質(zhì)量為1362.82 Da,少于20 個氨基酸)也同樣具有較寬抑菌譜,對包括金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌、青霉等在內(nèi)的細菌、真菌均具有抑制作用,掃描電鏡和透射電鏡分析發(fā)現(xiàn)其可在細胞壁形成孔洞和褶皺以及破壞細胞膜和原生質(zhì)層的完整性,但具體結(jié)合位點和機制有待進一步探究[37]。

2.1.1.2 破壞細胞膜的通透性和完整性

細菌的細胞膜是一種選擇透過性膜,通過與外界環(huán)境有選擇性地交換物質(zhì)為內(nèi)部提供利于各種關(guān)鍵生物化學(xué)反應(yīng)進行的條件。 細胞膜有選擇性地允許保持細胞膜正常功能的K+、Na+、H+等離子通過。 研究發(fā)現(xiàn),動物雙歧桿菌BB04 分泌的抗菌肽bifidocin A 會使大腸桿菌細胞膜的通透性增加,造成細胞內(nèi)K+和無機磷大量滲出導(dǎo)致細胞死亡[38]。細胞膜正常的選擇通透性也對細胞維持正常酶活力和代謝平衡非常重要,細胞膜通透性的改變會造成鐵離子失衡,進而影響到細菌能量代謝(轉(zhuǎn)運、代謝調(diào)控、調(diào)節(jié)細胞壓力和運動)有關(guān)的各種功能,導(dǎo)致細菌死亡[39]。

細菌的細胞膜還是細菌應(yīng)對外界環(huán)境不利因素的屏障,細胞膜完整性的破壞會造成細菌死亡。 研究發(fā)現(xiàn),鼠李糖乳桿菌代謝分泌的新型細菌素1.0320(表面帶有負電荷、分子質(zhì)量在1 ～3.3 kDa)具有破壞大腸桿菌UB1005 細胞膜的完整性和通透性的功能[40]。 芽孢桿菌JS-4 產(chǎn)生的抗菌肽(分子質(zhì)量為3346.6 Da,分子序列與subtilin 類似,但15位的丙氨酸和24 位的亮氨酸分別被纈氨酸和異亮氨酸替代)也通過破壞細胞膜的通透性和完整性,造成細胞內(nèi)外滲透壓的失衡,進而間接影響代謝、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等一系列的生物學(xué)過程來抑制食源性致病菌。 研究證實此抗菌肽有很好的熱和pH 穩(wěn)定性,但是容易被蛋白酶降解,其結(jié)構(gòu)特點可作為進一步探明其機制的基礎(chǔ)[41]。

2.1.1.3 影響基因表達和阻斷代謝通路

基因決定蛋白表達,對基因的破壞會阻斷細菌某些重要酶和受體的合成,最終導(dǎo)致細菌死亡。 益生菌的一些代謝物會破壞細菌的遺傳物質(zhì)。 研究發(fā)現(xiàn),苯乳酸可插入單增李斯特菌和大腸桿菌的基因組中,隨后影響DNA 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和表達,最后阻礙細菌生長導(dǎo)致細菌死亡,與溴化乙錠作用機制類似[42]。 益生菌的另一些代謝產(chǎn)物還可以通過影響基因表達和細菌正常代謝通路來抑制細菌。 研究發(fā)現(xiàn),細菌素BM1157 可使大腸桿菌蛋白表達水平發(fā)生明顯改變,其原生質(zhì)組分和細胞膜組分顯著降低,周質(zhì)空間也相對減少,蛋白酶和蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物的表達水平上調(diào)；同時大腸桿菌與鐵的結(jié)合能力降低,鐵缺失進而使其催化酶和水解酶活性降低,碳水化合物代謝和轉(zhuǎn)運受到顯著影響,導(dǎo)致生物活性分子合成時所需的物質(zhì)和能量供應(yīng)不足,氨基酸轉(zhuǎn)運和脂質(zhì)代謝等過程進而受到阻斷,細胞分化受到影響,最終導(dǎo)致細胞凋亡[43]。

2.1.2 對生物被膜態(tài)細菌的抑制機制

益生菌及其代謝物可通過干擾細菌的群體感應(yīng)信號通路來實現(xiàn)對生物被膜的控制,與殺死細菌的抑菌機制不同,這種機制以阻礙細菌的生長為目的,不容易使細菌產(chǎn)生耐藥性。 群體感應(yīng)(quorum sensing, QS)是細菌之間依靠其所分泌的信號分子(autoinducer, AI)的濃度進行交流的一種機制,與AI 的濃度呈現(xiàn)正向的相關(guān)性,能影響基因表達的調(diào)控,對細胞的運動、抗生素的合成、生物被膜的形成、毒力因子的產(chǎn)生都具有非常重要的作用[44-45]。 不同細菌QS 系統(tǒng)產(chǎn)生的信號分子種類不同,主要包括高絲氨酸內(nèi)酯類(HSL)、寡肽(AIP)和AI -2 三大類[46-47]。 群體感應(yīng)淬滅(quorum quenching, QQ)即通過干擾細菌QS 系統(tǒng)使其QS 現(xiàn)象消失,具有QQ 功能的物質(zhì)可以稱為QS 抑制劑,其抑制機制主要包括分解信號分子以及干擾信號分子與受體結(jié)合等。 在益生菌的代謝物中發(fā)現(xiàn)多種天然的QS 抑制劑[48-49]。 研究發(fā)現(xiàn),乳酸片球菌產(chǎn)生的乳酸可以抑制銅綠假單胞菌的las 和rhl 兩種QS 系統(tǒng),影響了C4-HSL 等短鏈的HSL 的產(chǎn)生,進而抑制銅綠假單胞菌的群集和泳動行為,減弱其生物被膜以及其他毒力因子(彈性蛋白酶、綠膿菌素等)的形成能力[50]。 干酪乳桿菌CRL431 和乳酸片球菌CRL730發(fā)酵液的三氯甲烷提取物可抑制銅綠假單胞菌,顯著影響其生物被膜形成、生物量以及代謝活動,同時可抑制其毒力因子的產(chǎn)生[51]。 部分芽孢桿菌和乳酸菌可分泌群體感應(yīng)淬滅酶(QQ 酶),通過水解信號分子的內(nèi)酯環(huán),破壞信號分子?；鶄?cè)鏈的酰胺鍵,還原信號分子阻止其被受體識別等機制,影響相應(yīng)食源性致病菌生物被膜的形成[52-54]。

另外益生菌及其代謝物還可以通過阻止致病菌黏附行為的發(fā)生,與致病菌競爭和外排作用來達到清除和抑制食源性致病菌生物被膜的目的。 研究發(fā)現(xiàn),乳酸片球菌PA003 可抑制大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌在不銹鋼、聚氯乙烯和玻璃表面形成生物被膜,對已經(jīng)形成的生物被膜通過競爭和外排作用破壞生物被膜結(jié)構(gòu)達到清除生物被膜的目的[55]。 多株乳酸乳球菌也可通過抑制單增李斯特菌的黏附過程來抑制其生物被膜形成[56]。

2.2 對真菌的抑制機制

益生菌對真菌的抑制作用主要是通過其產(chǎn)生的抗真菌肽以及有機酸、羧酸等物質(zhì)進行的,抑制機制與其對真菌細胞結(jié)構(gòu)的破壞和與真菌互相競爭營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。 研究發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌(Bacillus siamensisLZ88)代謝產(chǎn)物中的兩種肽類物質(zhì)iturins 和macrolactin,以及揮發(fā)性的有機酸二甲基丁酸可使互隔交鏈孢霉菌絲發(fā)生明顯的形態(tài)改變,使菌絲形成孔洞,并發(fā)生不規(guī)則萎縮和減少其上附著的分生孢子數(shù)目,這些不帶分生孢子的菌絲隨之會發(fā)生斷裂、萎縮、瓦解和死亡[57]。 益生菌也會和真菌競爭環(huán)境中的營養(yǎng)因子,尤其當(dāng)環(huán)境中的營養(yǎng)素含量較低時,益生菌會優(yōu)先利用營養(yǎng)素,其結(jié)果就是環(huán)境中剩下的營養(yǎng)物質(zhì)不足以保證真菌孢子萌發(fā),導(dǎo)致孢子的活性受到抑制。 雖然當(dāng)環(huán)境中的營養(yǎng)素濃度增高達到孢子萌發(fā)所需要營養(yǎng)條件時其可以正常萌發(fā),但研究發(fā)現(xiàn)其萌發(fā)率要遠低于未經(jīng)處理時的狀態(tài),說明益生菌代謝物對真菌孢子結(jié)構(gòu)也造成一定程度的損傷[58]。 益生菌及其代謝物可清除和抑制真菌生物被膜,研究發(fā)現(xiàn)其可抑制多株白色念珠菌生物被膜的形成,其機制主要與阻止生物被膜的黏附以及同真菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)[59]。

2.3 對病毒的抑制機制

益生菌及其代謝物對病毒的抑制機制包括干擾病毒復(fù)制和阻止其與宿主細胞結(jié)合等,具體機制還有待于進一步研究。 已發(fā)現(xiàn)乳酸菌的一些無細胞提取物尤其是乳酸可抑制病毒的復(fù)制[60]。 還有研究發(fā)現(xiàn),植物乳桿菌LBP-K10 分泌的一種環(huán)二肽可以抑制流感病毒(H3N2),其抑制機制與其豐富的手性結(jié)構(gòu)有關(guān),其中4 個可以改變立體化學(xué)和構(gòu)象結(jié)構(gòu)的位點被認為在抗病毒中起到比較關(guān)鍵的作用,并可能通過與人蛋白酶或者病毒血球凝集素裂解蛋白互作阻止病毒感染宿主細胞[61]。

3 基于益生菌及其代謝物的食源性致病微生物控制技術(shù)的應(yīng)用

基于益生菌及其代謝物的食源性致病微生物控制技術(shù)是利用益生菌及其代謝物所具有的抑制食源性微生物功能特性,將其應(yīng)用于食品來達到對食品安全和品質(zhì)進行控制的技術(shù)。 這種技術(shù)會以從益生菌發(fā)酵液中分離提取的某些純化或半純化產(chǎn)物(單一代謝物)、益生菌無細胞提取液(多種代謝物的復(fù)合物)、益生菌(活菌)的形式應(yīng)用到對食品的品質(zhì)控制中。 益生菌及其代謝物的類型、應(yīng)用方式、應(yīng)用條件、食品基質(zhì)的類型、食源性致病微生物的種類都會對其技術(shù)應(yīng)用效果(食品安全性、貨架期的延長和食品品質(zhì)保持)產(chǎn)生不同的影響。

3.1 在果蔬安全與品質(zhì)控制中的應(yīng)用

果蔬的水分和糖含量較高,容易受到機械損傷,在食源性致病微生物污染以及酶的作用下發(fā)生品質(zhì)劣變,同時因其食用方式多為生食,故存在引發(fā)食源性疾病的風(fēng)險。 基于益生菌及其代謝產(chǎn)物的食源性致病微生物控制技術(shù)目前已經(jīng)應(yīng)用于果蔬從采后保藏到加工等多個環(huán)節(jié),可以保證果實的鮮度和安全性。

益生菌及其代謝物可應(yīng)用于果蔬的保鮮保藏,研究發(fā)現(xiàn),pediocin 對萵苣、生菜、芹菜和菠菜等新鮮蔬菜具有很好的品質(zhì)控制效果,可有效降低新鮮蔬菜在貯藏期間產(chǎn)生單增李斯特菌的數(shù)目[62]。 番茄和酸面團中分離的植物乳桿菌TR7 和植物乳桿菌TR71 發(fā)酵液可延長番茄的鮮度和貯藏時間,這兩種益生菌無細胞提取液(活性成分為乳酸、乙酸、苯乳酸和吡嗪衍生物)可以很好地抑制擴展青霉和黃曲霉的生長, 霉菌最小抑菌濃度在6.3 ～100.0 g/L,在貯藏期間能很好地控制番茄品質(zhì),避免其腐敗[63]。

益生菌及其代謝物可對鮮切水果中的食源性致病微生物進行控制,保證消費者食用的安全性和口感。 利用鼠李糖乳桿菌GG 直接噴涂到鮮切蘋果的表面,可在貯藏期間不同程度降低單增李斯特氏菌和沙門氏菌的菌落數(shù),雖未達到完全殺滅效果,但根據(jù)體外實驗,兩種食源性致病菌在模擬消化道內(nèi)的生存能力下降,說明其對宿主致病力有所減弱；同時貯藏期間鮮切蘋果的顏色、可溶性固形物和硬度可得到很好保持[64]。 將鼠李糖乳桿菌GG 噴灑于鮮切梨表面,可在貯藏期間顯著控制單增李斯特氏菌的菌落數(shù)；鮮切梨果肉可溶性固形物和總酸含量在整個貯藏期基本保持穩(wěn)定；風(fēng)味物質(zhì)(酯類、醇類、醛類、萜類、酮類、酸類)種類多樣,醇類和酯類的特征物濃度隨著貯藏時間延長而升高,比不處理以及采用氯化鈣處理更有效地保證了梨的特征風(fēng)味[65]；鮮切梨的硬度、外觀以及抗氧化性也比不采用任何處理和氯化鈣處理的效果好[66]。

益生菌及其代謝物也可以應(yīng)用于非發(fā)酵型果汁飲料品質(zhì)的控制。 鼠李糖乳桿菌GG 能控制低溫和常溫貯藏期間沙棘果汁飲料中大腸桿菌的生長以及保證果汁品質(zhì),其控制效果與益生菌的適宜生長溫度有關(guān)。 相對高的溫度下鼠李糖乳桿菌的代謝旺盛,可快速分泌有機酸和抗菌肽,因此會使大腸桿菌的數(shù)量在儲藏前期即發(fā)生非常明顯下降；而低溫貯藏條件下大腸桿菌數(shù)目則在貯藏中期開始下降[67]。利用益生菌對非發(fā)酵果汁進行品質(zhì)控制的過程中應(yīng)合理評估益生菌與致病菌的生長互作和果汁風(fēng)味保持之間的關(guān)系。

3.2 在肉類安全與品質(zhì)控制中的應(yīng)用

肉及肉類制品的味道鮮美、品種和營養(yǎng)豐富,在人們?nèi)粘Ｉ攀持姓急容^大,是獲取蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)素的主要來源。 肉類容易被大腸桿菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌、副溶血弧菌等致病微生物污染,在食用過程中殺菌不徹底以及致病菌產(chǎn)生的毒素會引起很大的食用安全隱患。 受到日式和地中海飲食方式的影響,消費者對一些紅肉和水產(chǎn)品(三文魚、金槍魚、牡蠣)會傾向采用生食方式,根據(jù)益生菌及其代謝物的特點,人們對其在肉類安全與品質(zhì)控制方面也開展了大量研究。

益生菌可以作為發(fā)酵劑保證發(fā)酵肉類品質(zhì)。 采用植物乳桿菌和德氏乳桿菌作為發(fā)酵劑生產(chǎn)薩拉米香腸,可以使香腸中的梭狀芽胞桿菌的菌落數(shù)下降2 lg CFU/g 左右。 雖然薩拉米香腸在制作過程中的環(huán)境(較高的脂肪含量和熟化過程不斷增高的鹽濃度)對益生菌生長不利,益生菌抑菌效果略低于化學(xué)防腐劑,但是益生菌的加入可減少香腸生產(chǎn)過程中的亞硝酸鹽添加量,提高發(fā)酵肉類品質(zhì),滿足當(dāng)前消費者的綠色、健康、微加工、無添加食品選購理念[68]。 益生菌的添加既作為發(fā)酵劑,也兼具生物保護劑的作用,已經(jīng)被應(yīng)用于包括香腸、熏肉等多種肉品安全和品質(zhì)控制中。

除了作為發(fā)酵劑,也可以將鮮肉浸泡于益生菌液處理一定時間來達到保證鮮度和安全性的效果,在應(yīng)用中需考慮益生菌的初始活菌數(shù)目以及貯藏條件等因素。 研究發(fā)現(xiàn):初始活菌數(shù)目為7.5 lg CFU/g 的干酪乳桿菌和彎曲乳桿菌混合液的浸泡處理可以顯著降低低溫真空貯藏牛肉樣品中的致病微生物以及TVBN 值；處理后牛肉表面菌落復(fù)雜程度明顯低于未處理組,其中腐敗微生物腸桿菌、假單胞菌和熱殺索絲菌數(shù)目顯著降低。 在品質(zhì)方面,未經(jīng)處理的牛肉樣品于貯藏中后期TVBN 開始上升迅速,在貯藏末期達到15 mg/100 g,已超中國冷鮮肉衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB2707—2016；而益生菌處理可使貨架期延長10 d,且貯藏末期TVBN 值只有10 mg/100 g 左右,滿足國家標(biāo)準(zhǔn)[69]。 還有研究利用干酪乳桿菌CTC494 控制低溫貯藏的真空包裝煙熏三文魚中的單增李斯特氏菌,來保證煙熏三文魚微生物安全性和品質(zhì)。 研究發(fā)現(xiàn),煙熏三文魚的品質(zhì)控制效果與益生菌菌株有很大關(guān)系,相對于干酪乳桿菌CTC494,彎曲乳桿菌CTC1742 對煙熏三文魚中單增李斯特菌的控制能力相對較弱[70]。

3.3 技術(shù)應(yīng)用研究趨勢

3.3.1 開發(fā)高產(chǎn)高效抗菌肽

抗菌肽是目前在食品品質(zhì)控制中應(yīng)用較多的一種益生菌代謝物,其中Nisin 已被多國批準(zhǔn)作為食品添加劑使用,因為受到純化技術(shù)的影響,Nisin 的一種半純品Nisaplin 的工業(yè)應(yīng)用比較常見[71]。 雖然抗菌肽的分離困難,使用成本較高,部分抗菌肽的抑菌譜較窄,但是近年來還是受到了持續(xù)關(guān)注和廣泛研究；人們還結(jié)合數(shù)據(jù)科學(xué)等技術(shù)針對已有抗菌肽抗菌特性開發(fā)了相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫,利用基因組學(xué)數(shù)據(jù)的自動識別和篩選評估其安全性[72],已篩選到很多具有相對寬抑菌譜的抗菌肽。 提高抗菌肽產(chǎn)量的手段包括對益生菌的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化、對菌株進行基因工程改造以及人工合成等,同時需要配合加速下游益生菌純化技術(shù)的開發(fā)[73-74]。 高產(chǎn)高效抗菌肽的開發(fā)可為益生菌代謝物在食品安全和品質(zhì)控制中的工業(yè)化應(yīng)用提供一定基礎(chǔ)。

3.3.2 提升益生菌抑制微生物性能

對益生菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化可提升其抑制微生物的性能,以達到更好地控制食源性致病微生物的效果。 益生元的添加可以提高益生菌有效代謝物產(chǎn)量并在一定程度上增強其抑制食源性致病微生物的能力。 研究發(fā)現(xiàn),巖藻多糖的添加可提高鼠李糖乳桿菌GG 代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和抑菌能力。 巖藻多糖可促進鼠李糖乳桿菌GG 有機酸的產(chǎn)生,傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析發(fā)現(xiàn),鼠李糖乳桿菌GG 細胞的磷脂雙分子層受到巖藻多糖的影響,膜蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,細胞形態(tài)變長；低質(zhì)量濃度(8 mg/mL)相對于高質(zhì)量濃度(80 mg/mL)巖藻多糖的添加對鼠李糖乳桿菌GG 抑菌性能的提升作用更強,這可能與高濃度益生元添加造成的高滲透壓和快速生長分泌的有機酸影響了鼠李糖乳桿菌GG 的某些信號通路有關(guān)[75],其具體機制有待于進一步研究。 另外將益生菌在比較溫和的壓力下培養(yǎng)也可以增強其抑菌性能[76],但其機制以及在食品品質(zhì)控制中的應(yīng)用效果也有待于進一步的研究證實。

3.3.3 人工合成多功能益生菌

可考慮采用基因工程手段構(gòu)建具有多重功能的益生菌。 有研究構(gòu)建了一種可同時分泌γ-氨基丁酸(GABA)(抗氧化劑)以及抗菌肽Nisin 的功能益生菌F44/GadB1C1,使其發(fā)酵液同時具有控制食源性致病微生物和抗氧化作用。 這株菌的發(fā)酵過程采用pH 調(diào)節(jié)的兩段式發(fā)酵,控制GABA 以及Nisin 的生物合成,發(fā)酵過程結(jié)束后F44/GadB1C1 菌的GABA產(chǎn)量可以達到9.12 g/L,是恒定pH 值發(fā)酵過程GABA產(chǎn)量的2.2 倍。 F44/GadB1C1 凍干的發(fā)酵產(chǎn)物(具有抑菌劑和抗氧化劑的雙重功能)可顯著降低豬肉冷藏期間表面微生物水平,對大腸桿菌和乳酸菌的抑制效果高于山梨酸鉀,并可很好地控制豬肉脂質(zhì)氧化,豬肉樣品的TBARS 值在貯藏期間上升緩慢,與添加叔丁基羥基茴香醚對脂肪氧化的抑制效果類似；同時F44/GadB1C1 的發(fā)酵液也可以顯著降低草莓腐爛率,比單獨采用Nisin 具有更好的品質(zhì)保持效果,與添加苯甲酸鈉和山梨酸鉀的防腐效果相當(dāng)[77]。

3.3.4 設(shè)計益生菌活性包裝

益生菌的活力大小以及其活力是否可以在貯藏期間得到保持是影響其對食源性致病微生物品質(zhì)控制效果的一個重要因素。 可考慮將益生菌和大分子可食用材料相結(jié)合來達到保證其活力的目的,因此開發(fā)含有益生菌的活性包裝產(chǎn)品也成為目前益生菌在保鮮領(lǐng)域應(yīng)用和活性包裝材料研發(fā)的熱點。 該技術(shù)在保證益生菌具有抑制食源性致病微生物活力的同時還可以避免將益生菌直接作用于食品對食品的風(fēng)味可能造成的影響,同時這種活性包裝材料還具有保水、阻隔、抗氧化等性能。 有研究制作了益生菌植物多糖活性包裝膜,并將其應(yīng)用于水果和蔬菜的品質(zhì)控制。 該方法利用木瓜、亞麻和羅勒的種子(含有不同多糖)包裹益生菌,制備了有高保濕性、熱穩(wěn)定性和高機械強度的可食用膜,發(fā)現(xiàn)這種可食用膜不僅具有很強的阻隔性,并能同時保證鼠李糖乳桿菌GG 的活力；用其包裝草莓、香蕉、黃瓜和圣女果等鮮果可使鮮果免受紫外線照射,保持水分(黃瓜和圣女果水分的保持分別能持續(xù)7 d 和30 d)、維持良好外觀以及避免褐變等[78]。 另有研究制作了含有多種植物乳桿菌(植物乳桿菌LP3、植物乳桿菌AF1 和植物乳桿菌LU5)的魔芋基可食用膜,對鮮切獼猴桃品質(zhì)及其真菌進行控制。 該研究發(fā)現(xiàn),隨著貯藏天數(shù)的增加,可食用膜中的益生菌仍保持較高的存活率(7 lg CFU/g 左右),且植物乳桿菌LP3 的存活率要高于其他菌株；與對照組相比,鮮切獼猴桃的腐爛和顏色變化得到了很好的控制,霉菌和酵母菌的數(shù)量顯著減少,葉綠素和抗壞血酸的含量基本沒有發(fā)生變化,且總酚含量和抗自由基活性也比對照組高,其感官的接受度也更高,說明其食用安全性和品質(zhì)都得到了很好的保持[79]。

3.3.5 聯(lián)合其他食品安全和品質(zhì)控制技術(shù)

益生菌及其代謝物還可以和其他食品安全和品質(zhì)控制技術(shù)結(jié)合達到協(xié)同增效的效果。 研究發(fā)現(xiàn),使用益生菌和EDTA 及黑胡椒提取物復(fù)配后,相對于分別單獨采用羅伊氏乳桿菌、干酪乳桿菌、EDTA和黑胡椒提取物,復(fù)配物可將對大腸桿菌的抑制能力提升2 倍,也使低溫條件貯藏的牛肉中微生物數(shù)量顯著降低,并可抑制牛肉在貯藏過程中的脂肪氧化,保證牛肉的食用安全和品質(zhì)[80]。 利用超高壓技術(shù)結(jié)合乳酸乳球菌對肉類進行處理后可有效減少變形菌門類腐敗細菌的數(shù)目,可以在很大程度上減少和避免亞硝酸鹽的使用,降低消費者食用后的致癌風(fēng)險[81]。 與其他技術(shù)的聯(lián)用擴大了益生菌及其代謝物在食品安全和品質(zhì)控制中的應(yīng)用范圍。

4 展望

基于益生菌及其代謝物的食源性致病微生物控制技術(shù)在食品安全和品質(zhì)控制上的應(yīng)用具有很大優(yōu)勢,但其工業(yè)化仍然面臨很多問題。 首先要考慮的就是益生菌生物及其代謝物的食用安全性問題,目前已經(jīng)批準(zhǔn)在食品中添加的益生菌及其代謝物的種類較少,且研究發(fā)現(xiàn)某些抑菌物質(zhì)對人體內(nèi)正常益生菌群存在抑制作用,他們之間的關(guān)系也需要進一步研究。 未來的研究需要側(cè)重對益生菌及其代謝物的安全性評價,為其工業(yè)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)；同時還需要進一步對具有益生和抑制食源性致病微生物功能的益生菌菌株資源進行挖掘,結(jié)合生物信息學(xué)、計算生物學(xué)、數(shù)據(jù)科學(xué)和現(xiàn)代儀器分析等手段確定合適的分離培養(yǎng)方案。 益生菌抑菌活性物質(zhì)的確定和分離也是目前研究的一個瓶頸,需要開發(fā)敏感度更高和更有效的識別和分離方法；同時相關(guān)菌株及其代謝物抑制食源性致病微生物的機制、環(huán)境對益生菌抗菌性能影響等機制也有待于進行更深層次的研究,為更好地實現(xiàn)基于益生菌及其代謝物的食源性致病微生物控制技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。