郁永輝, 周琳悅, 劉柯杉, 李欣萍, 王 靜

(北京工商大學(xué) 中加食品營(yíng)養(yǎng)與健康聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室/食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心, 北京 100048)

燕麥作為全谷物中一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的全球性栽培物,具有悠久的種植和食用歷史[1-2]。 燕麥富含蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)素及黃酮類、多酚類等生物活性成分[3-4]。 燕麥蒽酰胺(avenanthramides, Avns)是燕麥中獨(dú)特存在的一種醇溶性化合物,自然條件下主要由燕麥中鄰氨基苯甲酸及其衍生物和肉桂酸及其衍生物在相應(yīng)酶作用下脫水縮合而生成[5]。 目前已發(fā)現(xiàn)的Avns 已達(dá)40余種[6-7],主要分布在燕麥麩皮及糊粉層中。 燕麥蒽酰胺2p(N-4′-羥基肉桂酰-5-羥基鄰氨基苯甲酸)、2f(N-4′-羥基-3-甲氧基肉桂酰-5-羥基鄰氨基苯甲酸)和2c(N-3′,4′-二羥基肉桂酰-5-羥基鄰氨基苯甲酸),又稱為Avn A、Avn B 和Avn C,是燕麥中含量較高的3 種主要活性成分[8]。 此外,燕麥蒽酰胺D、E、F、G、H、K、X、Y、Z 九種結(jié)構(gòu)是由鄰氨基苯甲酸及其衍生物分別與p-香豆酸、阿魏酸和咖啡酸脫水縮合而成；O、P、Q、L、M、N、R、S、T、U、V、W 十二種結(jié)構(gòu)分別由鄰氨基苯甲酸2,4-戊二烯及其鄰羥基甲氧基取代物、鄰羥基的羥基取代物結(jié)合生成[9-10]。 Avns 的天然含量較低,且受生長(zhǎng)環(huán)境及基因型等因素的影響,含量差異較大,報(bào)道顯示,Avns的天然含量在2 ～290 mg/kg[11-12]。 本課題組先前的報(bào)道表明,發(fā)芽過(guò)程可改變燕麥籽粒中Avns 合成相關(guān)酶活性,參與Avns 合成的羥氨基苯甲酸-N-羥基肉桂酸轉(zhuǎn)移酶(hydroxycinnamoyl-CoA: hydroxyanthranilic acidN-hydroxycinnamon acyltransferase,HHT)活性明顯提高,有效促進(jìn)Avns 的生物轉(zhuǎn)化[7],這為獲取足量天然來(lái)源的Avns 提供了理論基礎(chǔ)。

已有報(bào)道顯示,Avns 在維持機(jī)體健康方面發(fā)揮著重要作用,具有良好的抗氧化、緩解炎癥、抑制過(guò)敏反應(yīng)、調(diào)節(jié)腸道菌群及預(yù)防腫瘤等功效[7,12]。 研究表明,Avns 的體外抗氧化活性是燕麥中其他酚酸類物質(zhì)如咖啡酸、阿魏酸的10 ～30 倍[13],并可顯著緩解氧化應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷[14]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究也證實(shí),富含Avns 飲食有助于降低核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB) 活性并抑制運(yùn)動(dòng)等誘發(fā)的肌肉組織中促炎因子表達(dá)[7]；另外,Avns 具有良好的抗過(guò)敏活性,Avns 干預(yù)可顯著抑制肥大細(xì)胞等參與的過(guò)敏反應(yīng)[15],臨床研究也顯示含有Avns 的護(hù)膚品可有效降低兒童過(guò)敏性皮炎的發(fā)生率[16]。 目前,Avns 類似物曲尼司特已被廣泛應(yīng)用于治療過(guò)敏性疾??；Avns 及其代謝產(chǎn)物也是優(yōu)良的腸道菌群調(diào)節(jié)劑,Avns 的體內(nèi)代謝依賴于腸道菌群,同時(shí)酚酸類代謝產(chǎn)物又可顯著改善機(jī)體腸道菌群[7,17]；研究也證實(shí)Avns 可在抑制結(jié)腸癌、肝癌和乳腺癌等癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用[18-20],且隨著全球癌癥患病人數(shù)和死亡人數(shù)的逐年增加,Avns 在防控腫瘤方面的作用也備受關(guān)注。

據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì),肺癌是全球發(fā)病率和致死率最高的一種癌癥[21],其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)在肺癌中占比可達(dá)85%[22]。 2015年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率分別為每10 萬(wàn)人中733.3 人和610.2 人,且預(yù)計(jì)到2030年死亡率還會(huì)增加約40%[23-24]。 臨床組織樣本分析發(fā)現(xiàn),肺癌組織中X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis,XIAP)表達(dá)以及核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)活性均明顯高于正常組織,且NF-κB 的激活可上調(diào)XIAP 蛋白表達(dá),從而增強(qiáng)XIAP 在NSCLC 細(xì)胞中的抗凋亡作用[25-26]。 因此,XIAP 是參與肺癌細(xì)胞抗凋亡調(diào)控的關(guān)鍵蛋白,抑制XIAP蛋白表達(dá)將有助于肺癌防控。 盡管先前的研究已證實(shí)Avns 在癌癥防控中發(fā)揮作用,但其對(duì)NSCLC 細(xì)胞的調(diào)控作用尤其是XIAP 蛋白表達(dá)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。 本研究擬采用燕麥發(fā)芽方式對(duì)Avns 進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化,優(yōu)化其提取條件,重點(diǎn)探究天然Avns 對(duì)NSCLC 細(xì)胞H1299 和A549 凋亡相關(guān)NF-κB/XIAP通路及細(xì)胞凋亡的影響,進(jìn)而揭示天然Avns 參與肺癌防控的潛力及其作用機(jī)制,希望為全谷物燕麥特有活性成分Avns 應(yīng)用于肺癌防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正己烷(分析純),上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；無(wú)水乙醇(分析純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、十二烷基硫酸鈉(SDS),美國(guó)MREDA 公司；標(biāo)準(zhǔn)品Avn A、Avn B、Avn C,美國(guó)Sigma 公司；非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H1299、A549,南京草之源生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)、雙抗(青霉素+鏈霉素)、DMEM 高糖培養(yǎng)基、RPMI 1640 培養(yǎng)基、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25% 胰蛋白酶,美國(guó)Gibco 公司；p-p65 抗體、p65 抗體、XIAP 抗體、β-actin 抗體,武漢愛(ài)博泰克(ABclonal)生物科技有限公司；CCK-8 檢測(cè)試劑盒,東仁(DOJINDO)化學(xué)科技(上海)有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒、Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒,北京索萊寶科技有限公司；0.5 mol/L Tri-HCl 緩沖液(pH 值6.8)、1.5 mol/L Tri-HCl 緩沖液(pH 值8.8),武漢卡諾斯科技有限公司；30%制膠液、甘氨酸、RIPA 組織/細(xì)胞快速裂解液,北京索萊寶科技有限公司；TEMED,上海阿拉丁股份有限公司；牛血清白蛋白(BSA),上海源葉科技有限公司；T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、PVDF 膜,美國(guó)Thermo 公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)板、96 孔板、6 孔板,美國(guó)Corning 公司；濾紙,美國(guó)BIO-RAD 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

800C 型磨粉機(jī),上海久品實(shí)業(yè)科技有限公司；BILON-1000CT 型超聲波提取機(jī),上海比朗儀器制造有限公司；JK-MSH-Pro-6A 型六聯(lián)磁力攪拌器,鄭州科達(dá)機(jī)械儀器有限公司；R-300 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)系統(tǒng),瑞士步琦有限公司；Freezone 12plus 型冷凍干燥機(jī),美國(guó)Labconco 公司；Synergy H1M 型多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)Bio Tek 公司；3K15 型高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Sigma Laborzentrifugen GmbH 公司；LC-20A 型高效液相色譜儀,日本島津公司；TD6 型臺(tái)式低速離心機(jī),湖南赫西儀器裝備有限公司；伯樂(lè)Trans-Blot Turbo 型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng),美國(guó)BIO-RAD 公司；YXQLS-50A 型立式壓力蒸汽滅菌器,浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；IX73P1F 型活細(xì)胞成像倒置顯微鏡,日本奧林巴斯公司；ChemiDoc MP 型電泳凝膠成像分體系統(tǒng),美國(guó)BIO-RAD 公司；CytoFLEX S 型流式細(xì)胞儀,美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 燕麥米前處理

對(duì)燕麥米進(jìn)行篩選,去除破碎籽粒,用去離子水沖洗兩遍,紗布蓋好后放入16 ℃生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)。 分別在第3 天、第6 天收取發(fā)芽后的燕麥米,并保存在-80 ℃冷凍24 h。 冷凍干燥后,將干燥的發(fā)芽燕麥米在磨粉機(jī)中磨碎并過(guò)60 目篩。將過(guò)篩后的燕麥粉放入燒杯中,加入燕麥粉2 倍體積的正己烷,磁力攪拌1 h,8000 r/min 離心10 min,倒掉上清液加入新的正己烷,重復(fù)以上操作至上清液為無(wú)色。 脫脂后的燕麥粉放在通風(fēng)柜中過(guò)夜干燥,干燥后的燕麥粉放在自封袋中,4 ℃保存待用。

1.3.2 燕麥蒽酰胺的提取

精確稱取1.00 g 脫脂后的燕麥粉于50 mL 離心管中,按照料液比(g/mL)為1∶20 加入體積分?jǐn)?shù)為80%的無(wú)水乙醇,渦旋混勻后將離心管置于設(shè)置功率為80 W 的恒溫超聲波提取機(jī)中超聲10 min,然后置于50 ℃六聯(lián)磁力攪拌器中攪拌2 h,常溫下離心,得到上清液。 重復(fù)操作3 次,并將得到的上清液合并置于旋蒸瓶中,旋蒸至干,用色譜級(jí)甲醇復(fù)溶并定容至5 mL,4 ℃保存待測(cè)。

1.3.3 燕麥蒽酰胺含量檢測(cè)

采用分析型HPLC(C18 色譜柱150 mm ×3.0 mm,5 μm)對(duì)燕麥蒽酰胺進(jìn)行定性和定量檢測(cè),檢測(cè)條件為流動(dòng)相A:0.1%乙酸水,流動(dòng)相B:乙腈,流速0.8 mL/min,柱溫箱30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm,進(jìn)樣量設(shè)置10 μL,梯度洗脫程序:0 ～4 min(體積分?jǐn)?shù)為20%的乙腈),4 ～14 min(體積分?jǐn)?shù)為20% ～60%的乙腈),14 ～15 min(體積分?jǐn)?shù)為60%的乙腈),15 ～21 min(體積分?jǐn)?shù)為60% ～20%的乙腈),21 ～25 min(20%的乙腈)。

1.3.4 燕麥蒽酰胺提取單因素實(shí)驗(yàn)

以Avns 含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),分別考察超聲功率(60、70、80、90 W)、料液比(g/mL)(1 ∶5、1 ∶10、1∶20、1 ∶30、1 ∶40)、乙醇體積 分 數(shù)(50%、60%、70%、80%、90%)等不同提取條件對(duì)Avns 含量的影響。

1.3.5 燕麥蒽酰胺提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取超聲功率(F1)、料液比(F2)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(F3)為3 個(gè)考察因素,以Avns 含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),因素水平編碼如表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Tab.1 Design factors and level of response surface test

1.3.6 肺癌細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

無(wú)菌條件下將H1299 細(xì)胞或A549 細(xì)胞分別培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)為10% 的FBS、1% 雙抗的DMEM 培養(yǎng)基和RPMI 1640 培養(yǎng)基中,置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。 采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時(shí)經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.7 實(shí)驗(yàn)分組方法

設(shè)置對(duì)照組、燕麥蒽酰胺C 標(biāo)準(zhǔn)品(Avn C)組和燕麥蒽酰胺混合物(Avns)組。 對(duì)照組:正常培養(yǎng)。 Avn C 組:標(biāo)準(zhǔn)品Avn C 經(jīng)DMSO 溶解后,采用DMEM 作為溶媒介將Avn C 稀釋成終質(zhì)量濃度為20、40 mg/mL 的溶液。 Avns 組:Avns 經(jīng)DMSO 溶解后,采用DMEM 作為溶媒介將提取的Avns 稀釋成終質(zhì)量濃度為20、40 mg/mL 的溶液。 所配制的溶液在后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析中稀釋使用。

1.3.8 CCK-8 分析

將生長(zhǎng)密度和活力適宜的H1299 細(xì)胞或A549細(xì)胞用0.25%胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度至5 ×104個(gè)/mL,接種于96 孔板培養(yǎng)24 h,分別加入3 種燕麥蒽酰胺標(biāo)準(zhǔn)品Avn A、Avn B 和Avn C,使終質(zhì)量濃度為5、10、20、40 μg/mL。 每個(gè)濃度設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)置空白組和對(duì)照組。 繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后,每孔中加入10 μL CCK-8 試劑培養(yǎng)1 ～4 h,最后用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)量吸光度值,用公式計(jì)算各組細(xì)胞的增殖情況。

1.3.9 Annexin V-FITC/PI 流式細(xì)胞檢測(cè)

對(duì)H1299 和A549 細(xì)胞處理24 h 后,不同處理組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,1000 r/min離心5 min 收集細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS 洗滌并1000 r/min 離心5 min 收集細(xì)胞后,加入1 ×Binding Buffer 重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至1 ×106個(gè)/mL。取100 μL 細(xì)胞懸液,加入5 μL Annexin V-FITC 溶液,輕輕混勻,室溫避光孵育10 min。 然后加入5 μL PI 染液室溫避光孵育5 min,預(yù)冷的PBS 補(bǔ)足500 μL 后輕輕混勻,并在1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀完成檢測(cè)。

1.3.10 Western blot 檢測(cè)

對(duì)H1299 和A549 細(xì)胞干預(yù)24 h 后,收集不同處理組細(xì)胞,使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白。 采用BCA 蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量,依次進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)膜質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉封閉,1∶1000 稀釋的p-p65、p65、XIAP 或β-actin 等一抗4 ℃孵育過(guò)夜,二抗(1∶10000)室溫孵育90 min,最后用ECL 顯影液顯色并置于凝膠成像系統(tǒng)中獲取圖像。 以βactin 為內(nèi)參,采用Image J 軟件進(jìn)行定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行方差分析,對(duì)差異顯著的進(jìn)行鄧肯氏多重比較,P＜0.05 表示組間存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Avns 制備條件的優(yōu)化分析

2.1.1 發(fā)芽前后Avns 定性和定量分析

天然燕麥中Avns 含量較低,而發(fā)芽是生物轉(zhuǎn)化Avns 的有效方式,經(jīng)發(fā)芽處理后燕麥中Avns 合成相關(guān)HHT 活性明顯增強(qiáng),而HHT 可利用游離前體鄰氨基苯甲酸和肉桂酸及其衍生物作為底物,進(jìn)一步催化合成Avns[8,27-29]。 本研究采用高效液相色譜法分析了未發(fā)芽、發(fā)芽3 d、發(fā)芽6 d 燕麥中Avns含量變化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 和圖1。 由表2 可知,Avn C 的保留時(shí)間在12.8 min 左右,Avn A 和Avn B的保留時(shí)間稍靠后且較接近,分別在14.4 min 和14.8 min 左右。 由圖1 可知,未發(fā)芽燕麥中Avns 含量較低,3 種含量較高Avn A、Avn B 和Avn C 的提取總量約為12 μg/g,但經(jīng)過(guò)發(fā)芽處理后3 種Avns含量明顯升高,發(fā)芽3 d 和6 d 后其總量分別為513 μg/g和694 μg/g。 因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用發(fā)芽6 d的燕麥進(jìn)行Avns 提取的單因素實(shí)驗(yàn)。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品Avn A、Avn B 和Avn C 的保留時(shí)間Tab.2 Retention time of standard Avns A, B and C

圖1 發(fā)芽對(duì)燕麥中3 種主要Avns 含量的影響Fig.1 Effect of germination on content of three main types of Avns in oat

2.1.2 Avns 提取單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

2.1.2.1 料液比對(duì)Avns 提取量的影響

料液比可能會(huì)改變目標(biāo)物分子間的作用力從而影響提取量,料液比對(duì)3 種主要Avns 及其提取總量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。 由圖2 可見(jiàn),本實(shí)驗(yàn)中料液比(g/mL)在1∶5 ～1∶20,Avn A、Avn B 和Avn C 三種主要成分及其總提取量有明顯增加,繼續(xù)增加料液比,Avn A、Avn B 和Avn C 提取量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。 可能是當(dāng)料液比(g/mL)為1∶20 時(shí),Avns的提取已較為充分,繼續(xù)增加料液比會(huì)延長(zhǎng)濃縮時(shí)間,降低Avns 的穩(wěn)定性,從而造成提取量的損失。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Avns 提取較為適宜的料液比(g/mL)為1∶20。

圖2 料液比對(duì)3 種主要Avns 及其提取總量的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction amount of three main types of Avns

2.1.2.2 超聲功率對(duì)Avns 提取量的影響

超聲的空化效應(yīng)和熱效應(yīng)等會(huì)影響樣品中目標(biāo)物的釋放與溶出,超聲功率對(duì)3 種主要Avns 及其提取總量的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3 。 由圖3 可知,超聲功率在60 ～80 W 時(shí),Avn A、Avn B 和Avn C 及三者總提取量均有所提高,并在超聲功率為80 W 時(shí)達(dá)到最高,這可能是超聲波的剪切效應(yīng)和熱效應(yīng),加速了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放,從而促進(jìn)樣品中Avns 的浸出。 當(dāng)超聲功率超過(guò)80 W,Avns 提取量逐漸降低,其原因可能是超聲功率過(guò)大會(huì)破壞Avns 內(nèi)部結(jié)構(gòu),從而不利于其提取。 本部分結(jié)果表明,提取Avns 較適宜的超聲功率為80 W。

圖3 超聲功率對(duì)3 種主要Avns 及其提取總量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction amount of three main types of Avns

2.1.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)Avns 提取量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)的大小會(huì)影響溶劑的滲透能力,乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)3 種主要Avns 及其提取總量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。 由圖4 可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)為50% ～90%時(shí),Avn A、Avn B 和Avn C 三種主要成分及其總提取量隨著體積分?jǐn)?shù)升高而顯著提高,但Avn A 的提取量在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%后開(kāi)始降低,原因可能是適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)可充分溶解Avns。 在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí)提取量的增加趨于穩(wěn)定,因此確定較為適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)3 種主要Avns 及其提取總量的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fractions on extraction amount of three main types of Avns

2.1.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

單因素實(shí)驗(yàn)后進(jìn)一步選取較為適宜的超聲功率、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)三因素的三水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Response surface experiment design and results

采用軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合。 得到回歸方程:

對(duì)此回歸模型進(jìn)行各自變量因素的方差分析,結(jié)果如表4。

表4 自變量的方差分析Tab.4 Analysis of variance for each independent variable

由表4 可知,3 個(gè)因素對(duì)提取量的影響由大到小順序?yàn)?體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲功率。 該模型P值小于0.001 表明模型極顯著并具有可靠性,失擬項(xiàng)為P=0.3069(P＞0.05)不顯著,說(shuō)明該模型與實(shí)驗(yàn)真實(shí)值接近,適合Avns 提取量的分析和預(yù)測(cè),表明可以用此模擬方程來(lái)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 響應(yīng)面分析結(jié)果見(jiàn)圖5,由圖5(a)可知,響應(yīng)面圖曲面陡峭,說(shuō)明料液比和超聲功率的交互作用顯著,Avns 的提取量隨料液比和超聲功率的遞增先增大后減??；由圖5(b)可知,在同一超聲功率條件下,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,Avns 的提取量逐漸提高；如圖5(c)所示,在同一料液比條件下,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,Avns 的提取量也逐漸增大。根據(jù)回歸方程可得,最適提取條件為料液比(g/mL)1∶22.2,超聲功率87.6 W,乙醇體積分?jǐn)?shù)84.2%,在此條件下響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果顯示,Avns 提取量可達(dá)850.864 μg/g。

圖5 不同因素對(duì)Avns 提取量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour diagram of different factors on extraction amount of Avns

利用優(yōu)化后的最適條件對(duì)Avns 進(jìn)行提取,以驗(yàn)證試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃?實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。 如表5 所示,在料液比(g/mL)1∶22.2,超聲功率87.6 W,乙醇體積分?jǐn)?shù)84.2%的條件下,進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn),所得燕麥中Avn A、Avn B 和Avn C 三種主要蒽酰胺成分總量的平均值為849.251 μg/g,與模型結(jié)果相近,符合預(yù)期提取量值,證明該模型可以用來(lái)較好地預(yù)測(cè)Avns 的提取量。 本研究結(jié)果表明,燕麥發(fā)芽6 d 后,Avns 最優(yōu)提取條件為料液比1∶22.2,超聲功率87.6 W,乙醇體積分?jǐn)?shù)84.2%,且在此條件下,Avn A、Avn B 和Avn C 的提取總量約為850 μg/g,其提取效果顯著優(yōu)于已報(bào)道的采用單純超聲波降解法制備發(fā)芽燕麥中的天然Avns[30]。

表5 3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中Avns 總提取量Tab.5 Avns extraction amount in three validatory experiments

2.2 Avns 促肺癌細(xì)胞凋亡機(jī)制分析

2.2.1 Avns 處理對(duì)NSCLC 細(xì)胞活力的影響

為進(jìn)一步探討Avns 對(duì)肺癌細(xì)胞的影響,本實(shí)驗(yàn)選取典型的NSCLC 細(xì)胞H1299 和A549,分析不同濃度蒽酰胺標(biāo)準(zhǔn)品Avn A、Avn B 和Avn C 對(duì)細(xì)胞活力的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。 由圖6 可知,隨著處理濃度的增加,H1299 和A549 細(xì)胞的存活率逐漸降低,Avn A 和Avn C 在處理前后的不同濃度下均有顯著性差異(P＜0.05),而Avn B 在質(zhì)量濃度達(dá)到40 μg/mL 時(shí)才呈現(xiàn)出顯著性差異。 與Avn A 和Avn B 處理組相比,Avn C 對(duì)H1299 和A549 細(xì)胞活力的影響更加明顯。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明Avn A、Avn B和Avn C 對(duì)NSCLC 細(xì)胞H1299 和A549 的活力均有一定的抑制效果,且Avn C 的活性明顯高于Avn A 和Avn B,這也與文獻(xiàn)報(bào)道的Avn C 具有更好的生物活性相一致[31]。 因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用Avn C 標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照,分析發(fā)芽燕麥中天然Avns 的抗癌活性。

2.2.2 Avns 處理對(duì)NSCLC 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

XIAP 是腫瘤細(xì)胞中重要的抗凋亡蛋白,通常在腫瘤組織中高表達(dá)且可通過(guò)多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,是腫瘤發(fā)生的主要誘因之一[32]。 已有報(bào)道顯示,NF-κB 通路在調(diào)控XIAP 蛋白表達(dá)方面發(fā)揮重要作用,進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞凋亡等[33]。 為進(jìn)一步探討發(fā)芽燕麥中天然Avns 對(duì)NSCLC 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響,采用不同濃度的蒽酰胺標(biāo)準(zhǔn)品Avn C 和天然Avns 分別處理NSCLC 細(xì)胞H1299 和A549,所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。 如圖7(a)所示,Western blot 分析結(jié)果表明,給予標(biāo)準(zhǔn)品Avn C 和天然Avns 處理后,H1299 細(xì)胞中NF-κB 通路p65 蛋白磷酸化及XIAP 蛋白表達(dá)均發(fā)生改變。 與對(duì)照組相比,標(biāo)準(zhǔn)品Avn C 和天然Avns 處理均可抑制NF-κB/p65 蛋白磷酸化并下調(diào)抗凋亡蛋白XIAP 表達(dá),且呈現(xiàn)出劑量依賴性。 Image J 軟件的量化分析結(jié)果也表明[圖7(b)],Avn C 和天然Avns 處理下調(diào)了p-p65和XIAP 蛋白表達(dá),高質(zhì)量濃度(40 μg/mL)處理組中p-p65 和XIAP 蛋白水平顯著降低(P＜0.05),且Avn C 作用效果優(yōu)于同濃度天然Avns。 這可能是因?yàn)樘烊籄vns 中成分復(fù)雜,生物活性較強(qiáng)的Avn C 含量相 對(duì) 不 足。 圖7(c)和圖7(d) 結(jié) 果 表 明, 與H1299 細(xì)胞類似,高濃度處理顯著下調(diào)A549 細(xì)胞中p65 蛋白磷酸化和XIAP 蛋白表達(dá)(P＜0.05),且Avn C 效果優(yōu)于天然Avns。 本部分結(jié)果說(shuō)明,高質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品Avn C 和天然Avns 均可抑制p65 蛋白磷酸化及凋亡相關(guān)XIAP 蛋白表達(dá),提示天然Avns 可潛在下調(diào)NF-κB/XIAP 通路活性而促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞凋亡。

圖7 不同Avns 干預(yù)處理對(duì)NSCLC 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Fig.7 Effect of different Avns treatment on expression of apoptosis related proteins in NSCLC

2.2.3 Avns 處理對(duì)NSCLC 細(xì)胞凋亡的影響

為進(jìn)一步揭示Avns 對(duì)NSCLC 細(xì)胞凋亡的影響,采用流式細(xì)胞術(shù)分析不同處理組間細(xì)胞凋亡情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8 和圖9。 由圖8 可知,標(biāo)準(zhǔn)品Avn C 和天然Avns 處理均可促進(jìn)H1299 細(xì)胞凋亡,低質(zhì)量濃度(20 μg/mL)和高質(zhì)量濃度(40 μg/mL)理后細(xì)胞凋亡率分別約為20%和31%,顯著高于對(duì)照組；而相應(yīng)濃度天然Avns 處理后,細(xì)胞凋亡率分別約為16%和19%,雖略低于Avn C 處理組,但同樣明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。 與H1299 細(xì)胞結(jié)果相類似,如圖9 所示,干預(yù)處理后A549 細(xì)胞凋亡率均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。 給予低質(zhì)量濃度(20 μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)品Avn C 和天然Avns 干預(yù)時(shí),A549細(xì)胞的凋亡率相近；但高質(zhì)量濃度(40 μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)品Avn C 處理后,A549 細(xì)胞凋亡率約為42%,而高濃度天然Avns 處理后A549 凋亡率約為28%,雖低于同濃度標(biāo)準(zhǔn)品Avn C 處理組,但也明顯高于對(duì)照組。 說(shuō)明天然Avns 處理可劑量依賴性地促進(jìn)H1299 和A549 細(xì)胞凋亡,可作為NSCLC 防控的新型活性天然物質(zhì)。

圖8 不同Avns 處理對(duì)H1299 細(xì)胞凋亡的影響Fig.8 Effect of different Avns treatments on cell apoptosis of H1299

圖9 不同Avns 處理對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響Fig.9 Effect of different Avns treatments on cell apoptosis of A549

3 討 論

燕麥中Avns 的天然含量較低,且受種植環(huán)境及基因型等影響較大,難以達(dá)到發(fā)揮健康功效的有效劑量,也成為制約天然Avns 健康作用機(jī)制研究的一大障礙。 目前針對(duì)谷物活性成分生物轉(zhuǎn)化的研究較多,而谷物發(fā)芽是實(shí)現(xiàn)活性成分生物轉(zhuǎn)化的有效途徑。 發(fā)芽技術(shù)作為一種自然方式可顯著改善谷物食品品質(zhì),提升全谷物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及健康效益,且易于被消費(fèi)者所接受。 近年來(lái),有關(guān)發(fā)芽處理的糙米、小麥、大麥及燕麥等研究日漸興起,并廣泛應(yīng)用于谷物健康食品的生產(chǎn)[34-36],本課題組先前的報(bào)道也分析了發(fā)芽促進(jìn)燕麥中Avns 生成的潛在機(jī)制[7]。 在燕麥生長(zhǎng)過(guò)程中可通過(guò)莽草酸途徑合成L-苯丙氨酸,隨后在苯丙氨酸解氨酶(pheylalanine ammonialyas,PAL)的作用下生成反式肉桂酸,并進(jìn)一步在肉桂酸羧化酶和咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下先后生成p-香豆酸、咖啡酸和阿魏酸。 最后,以p-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和鄰氨基苯甲酸為底物,在HHT 催化下分別合成Avn A、Avn C 和Avn B[7]。 在燕麥發(fā)芽過(guò)程中,Avns 合成相關(guān)酶PAL 和HHT 活性與未發(fā)芽組相比均明顯增加,這可能是發(fā)芽可促進(jìn)Avns 生物轉(zhuǎn)化的重要原因。 本研究也表明,發(fā)芽有效促進(jìn)了Avns 的生物轉(zhuǎn)化,與天然燕麥相比,發(fā)芽燕麥中3 種主要蒽酰胺成分Avn A、Avn B 和Avn C 含量均顯著增加,發(fā)芽3 d 和6 d 其含量分別提升約50 倍和70 倍。 因此,發(fā)芽是實(shí)現(xiàn)Avns 生物轉(zhuǎn)化的有效途徑,可為天然Avns 富集提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 此外,Avns 提取條件優(yōu)化分析也表明,采用超聲輔助傳統(tǒng)有機(jī)溶劑法可有效實(shí)現(xiàn)發(fā)芽燕麥Avns 的提取,在料液比(g/mL)1∶22.2,超聲功率87.6 W,乙醇體積分?jǐn)?shù)84.2%的條件下,3 種主要蒽酰胺Avn A、Avn B和Avn C 的總提取量可達(dá)849.251 μg/g,可為后續(xù)天然Avns 癌癥防控作用機(jī)制的研究奠定良好基礎(chǔ)。

近年來(lái),已有較多研究證實(shí),Avns 具有較好的抗癌活性,且報(bào)道多集中于其在結(jié)腸癌防控中的作用[18,36-37]。 也有研究顯示,Avns 對(duì)肝癌、乳腺癌甚至是埃利希固體腫瘤等有預(yù)防作用[19-20,38],而肺癌作為全球發(fā)病率和死亡率居首的疾病,Avns,尤其是天然來(lái)源Avns 對(duì)肺癌尤其是NSCLC 的防控作用卻鮮有報(bào)道。 本研究探討了發(fā)芽后提取的天然Avns對(duì)NSCLC 細(xì)胞的凋亡調(diào)控作用,發(fā)現(xiàn)Avns 處理可劑量依賴性地促進(jìn)H1299 和A549 細(xì)胞凋亡。 說(shuō)明天然來(lái)源的Avns 可能通過(guò)調(diào)控NF-κB/XIAP 通路促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞凋亡而發(fā)揮肺癌防控功效。

在Avns 防控腫瘤機(jī)制方面,報(bào)道顯示,Avns 有助于下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase 2, COX-2)的表達(dá),抑制前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)的生成,從而預(yù)防胃腸道上皮發(fā)生癌變并降低癌變細(xì)胞的增殖活性[37]。Avns 也可激活結(jié)腸癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞內(nèi)源性和外源性凋亡途徑,下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和低氧誘導(dǎo)因子等蛋白表達(dá),進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[19,38]。 在癌癥尤其是肺癌發(fā)生過(guò)程中,NF-κB/XIAP 通路發(fā)揮重要的抗凋亡活性,肺癌組織中NF-κB 蛋白活性及XIAP 蛋白表達(dá)均明顯增加,抑制NF -κB/XIAP 通路活性有助于肺癌治療[39]。 本研究結(jié)果表明,Avns 處理可有效抑制H1299 和A549 細(xì)胞中NF-κB/p65 蛋白磷酸化,并下調(diào)抗凋亡蛋白XIAP表達(dá),進(jìn)而降低NSCLC 細(xì)胞的抗凋亡活性,提示Avns 可潛在下調(diào)NF -κB/XIAP 通路活性,促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞凋亡并發(fā)揮肺癌防控功效,進(jìn)一步完善Avns 參與腫瘤防控的潛在作用機(jī)制。

4 結(jié)論

Avns 作為燕麥特有的生物活性成分,在調(diào)控人體健康方面可發(fā)揮重要作用,且采用發(fā)芽方式可顯著促進(jìn)Avns 的生物轉(zhuǎn)化,有效提升燕麥中天然Avns 含量。 經(jīng)優(yōu)化提取后的天然Avns 可劑量依賴性地降低NF-κB/p65 蛋白磷酸化及XIAP 蛋白表達(dá),并促進(jìn)H1299 和A549 細(xì)胞凋亡,說(shuō)明NF-κB/XIAP 通路可能是Avns 的調(diào)控新靶點(diǎn),進(jìn)而有效下調(diào)NSCLC 細(xì)胞的抗凋亡活性。 本研究旨在為Avns應(yīng)用于肺癌防控提供理論依據(jù),為全谷物燕麥尤其是發(fā)芽燕麥相關(guān)健康產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供新思路。