張 韜，陳啟航，韋海秋，李 苓，方旭波，陳小娥

(1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江國際海運職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316021)

加拿大一枝黃花Solidago canadensisL.是原產(chǎn)北美的一枝黃花屬多年生草本植物，又稱麒麟草、黃鶯。原作為庭院觀賞植物引進，因缺乏天敵逸生至野外，成為外來入侵物種[1]。近年來，在上海、南京、浙江、江蘇等省迅速繁殖并迅速蔓延，對我國生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴重的環(huán)境破壞與經(jīng)濟損失[2]。舟山海洋性氣候非常適合加拿大一枝黃花的生長，2019 年全市共發(fā)生面積979.7 hm2，總體處于輕發(fā)狀態(tài)[3]，但是也需要引起足夠重視，若不采取積極有效的措施，將對舟山的生態(tài)環(huán)境造成嚴重的破壞。

目前國內(nèi)外專家學(xué)者致力于如何控制加拿大一枝黃花蔓延方法的研究，同時也考察了該植物本身的利用價值。研究表明該植物含有多種有用物質(zhì)，其中的多糖蛋白具有免疫、延遲衰老、抵抗病毒、抗腫瘤等生理功能[4]。加拿大一枝黃花中已鑒定出的成分包含有多炔、二萜、三萜以及三萜皂苷等類，此外還有酚、黃酮等類以及植物精油等主要成分[5-6]，但關(guān)于加拿大一枝黃花多糖的提取及生物活性的研究尚未見報道。提取多糖的方法主要有：熱水、酸、堿以及超聲等[7-8]，其中熱水浸提法溶劑易得，操作方便，便于重復(fù)試驗，故本研究采用傳統(tǒng)熱水浸提法[9]提取加拿大一枝黃花多糖。本文運用響應(yīng)面法確定其最佳提取工藝[10]，同時對加拿大一枝黃花多糖抗氧化活性進行初步研究，旨在為今后大規(guī)模開發(fā)利用加拿大一枝黃花自然資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

加拿大一枝黃花，采摘于舟山市定海區(qū)長崗山。采摘后曬干，用中草藥粉碎機將其磨成50 目粉末備用。

抗壞血酸(Vc)，過氧化氫，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)，氯化鈉，無水乙醇，無水葡萄糖，濃硫酸，硫酸亞鐵，鄰苯三酚等，購于南京試劑公司，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DEF-6021 真空干燥箱，上海秋佐儀器公司；DJ-04 粉碎機，北京鑫骉騰達公司；東京理化N-101 蒸發(fā)儀，上海亞榮儀器廠；LGJ-10 冷凍干燥機，上海豫明公司；DL-5 離心機，北京華瑞公司；Gold S54 紫外可見分光光度計，上海棱光公司；SHT-3 水浴振蕩器，常州億能儀器廠；HHS 恒溫水浴鍋，常州億能儀器廠；DR-3518 酶標儀，無錫華文默克儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 加拿大一枝黃花多糖提取及含量測定

采用熱水提取法[11]，取一定量加拿大一枝黃花粉末，置于250 mL 三角錐瓶中，以超純水為溶劑，按不同的料液比、浸提溫度和浸提時間進行水浴浸提。浸提完成后，過濾取上清，收集濾液，得到加拿大一枝黃花多糖提取液。

采用硫酸-苯酚法[12]檢測加拿大一枝黃花粗多糖中多糖含量，繪制得葡萄糖標準曲線為Y=0.978 x+0.028(其中Y/A 為吸光度，x/(mg·mL-1)為葡萄糖濃度)，R2=0.997 9。由標準曲線回歸方程計算出加拿大一枝黃花多糖提取物的濃度，代入式(1)計算加拿大一枝黃花多糖的提取率。

式中：R 為加拿大一枝黃花多糖提取率，mg·g-1；ρ 為提取液中加拿大一枝黃花多糖濃度，μg·mL-1；v 為加拿大一枝黃花多糖提取液體積，mL；n 為稀釋倍數(shù)；m 為加拿大一枝黃花粉末質(zhì)量，g。

1.3.2 單因素實驗

稱取20 g 加拿大一枝黃花粉末，設(shè)定3 個自變量條件：提取溫度為60、70、80、90、100 ℃，提取時間為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，料液比為1：15、1：20、1：25、1：30、1：35，進行單因素實驗，考察提取溫度、提取時間、料液比對加拿大一枝黃花多糖提取率的影響，從而確定最佳提取溫度、提取時間、料液比。其中固定因素水平為提取溫度80 ℃，提取時間2 h，料液比1：20。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上采用Box-Benhnken 的中心組合設(shè)計對熱水浸提加拿大一枝黃花多糖工藝進行優(yōu)化，響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素和水平表如表1 所示。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計試驗結(jié)果進行驗證實驗，并比較預(yù)測多糖提取率與實際多糖提取率。

表1 響應(yīng)面分析實驗因素及水平表設(shè)計Tab.1 Independent variable and their levels of response surface methodology

1.3.4 加拿大一枝黃花粉多糖抗氧化活性研究

1.3.4.1 溶液配制

稱取25 g 加拿大一枝黃花粉末，按最佳提取工藝進行浸提，浸提結(jié)束后，通過抽濾等步驟，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)。旋蒸后提取到濃縮液100 mL，最后轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)皿中，60 ℃烘干得到加拿大一枝黃花多糖樣品，-20 ℃保存待用。

加拿大一枝黃花多糖溶液：取一定量的一枝黃花多糖粉末，加去離子水溶解，并依次稀釋到100、200、300、400、500 μg·mL-1。

Vc 溶液：稱取Vc 固體，加入H2O2進行溶解，并依次稀釋到100、200、300、400、500 μg·mL-1。

1.3.4.2 加拿大一枝黃花多糖清除O2-·的能力

取0.5 mL 加拿大一枝黃花多糖溶液，加入2 mL 50 mmol·L-1的Tris-HCl 溶液和0.5 mL 25 mmol·L-1的鄰苯三酚，混勻后靜置5 min，加0.1 mL HCl 溶液終止反應(yīng)，然后在560 nm 的位置測量混合液的吸光值，用Vc 做對照，而去離子水作空白對照。根據(jù)式(2)對O2-·自由基的清除率進行計算[13]：

式中：A0是空白對照的OD 值；A 是一枝花的粗多糖OD 值。

1.3.4.3 加拿大一枝黃花多糖清除·OH 的能力

取0.4 mL 不同濃度(100、200、300、400、500 μg·mL-1)的加拿大一枝黃花多糖溶液，與0.4 mL 5 mmol·mL-1FeSO4溶液充分混合后，再加入0.4 mL 1% H2O2，并在室溫環(huán)境中放置1 h 進行反應(yīng)，等反應(yīng)完成以后，加入1 mL H2O2，混勻后在510 nm 下測量吸光度[14]，Vc 作陽性的對照組。根據(jù)式(3)計算清除率：

式中：A0是空白對照組的OD 值；A 是加拿大一枝黃花粗多糖樣品的OD 值。

1.3.4.4 加拿大一枝黃花多糖清除DPPH·的能力

通過酶標儀在517 nm 波長處顯示吸光度值，進而計算出樣品清除DPPH·自由基的能力[15]，取5 mL濃度值為5 mmol·L-1的DPPH·無水酒精溶液，并將其分別添加到各種濃度值的多糖溶液中(100、200、300、400、500 μg·mL-1)，在室溫下震動搖勻，進行30 min 的遮光反應(yīng)，在517 nm 下測量OD 值，以Vc 濃度(100、200、300、400、500 μg·mL-1)作為陽性對照組，通過公式(4)計算清除率：

式中：A0為空白對照組的OD 值；A1為加拿大一枝黃花粗多糖樣品和DPPH·的OD 值；A2為加拿大一枝黃花多糖樣品和去離子水的OD 值[14]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

本實驗使用Design Expert 8.05 軟件以及Origin 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析和處理并繪制作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取溫度對多糖提取率影響

如圖1 所示，當溫度在60～90 ℃之間，多糖提取率上升較快，在90～100℃之間，上升緩慢，并且有一定的下降。可以看出，隨著提取溫度增高，多糖在水中溶解度上升，說明該多糖易溶解在熱水中；90 ℃以上溶液溫度過高，破壞物質(zhì)結(jié)構(gòu)，多糖有一定程度降解。結(jié)合實際情況，選擇浸提溫度在90 ℃，此時多糖提取率最高。

圖1 提取溫度對加拿大一枝黃花多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction yield of polysaccharides from S.canadensis

2.1.2 提取時間對加拿大一枝黃花多糖提取率的影響

由圖2 可知，提取時間在1.5～2.5 h 之間，隨著提取時間的增加，提取率呈持續(xù)上升的趨勢，在2.5 h后，則呈下降趨勢。表明多糖含量不能在較短的提取時間內(nèi)完全溶解在水中，但時間過長，則物質(zhì)可能長時間在高溫環(huán)境中，其本身結(jié)構(gòu)遭破壞，多糖有一定程度降解，導(dǎo)致提取率下降。結(jié)合實際情況，選擇提取時間為2.5h，多糖提取率最高。

圖2 提取時間對加拿大一枝黃花多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharides from S.canadensis

2.1.3 料液比對加拿大一枝黃花提取率的影響

由圖3 可知，料液比處于1：15～1：25 之間時，隨著料液比增大，多糖提取率也不斷提高，料液比大于1：25 之后，提取率趨于穩(wěn)定，可知在比例大于1：25 后，對提取率沒有明顯的影響?？赡苁且驗榱弦罕炔桓邥r，樣品內(nèi)多糖沒有完全溶解，在料液比到達一定程度時，樣品所含多糖完全溶解，提取率趨穩(wěn)。結(jié)合實際情況，選擇從料液比為1：25 左右時，多糖提取率最高。

圖3 料液比對加拿大一枝黃花多糖提取率的影響Fig.3 Effect of solvent to material ratio on extraction yield of polysaccharides from S.canadensis

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 的中心組合原理設(shè)計了17 組實驗，結(jié)果如表2 所示。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.2 Response surface method design and test results

根據(jù)本次響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)，粗多糖的提取率用Y 值表示，對變量進行編碼分別為X1提取的溫度、X2提取時間、X3料液比做回歸分析并且建立模型，得到Y(jié) 因素的二元回歸方程：

根據(jù)表3 回歸模型方差對結(jié)果進行分析?；貧w分析P 小于0.000 1，為極顯著，失擬項P 大于0.05，不顯著，這說明實驗?zāi)Ｐ偷臄M合度較好，說明實驗的二次模型擬合度較高，可正確反映各因素與響應(yīng)值之間的變化關(guān)系。極差R2的值為99.8%＞85%，說明該模型有著良好的擬合程度且試驗較為準確，數(shù)據(jù)無嚴重誤差。分析結(jié)果顯示用該模型分析和預(yù)測加拿大一枝黃花多糖的提取工藝具有可行性。從試驗數(shù)據(jù)看出，X1(提取溫度)、X2(提取時間)，X3(料液比)對于多糖的提取率影響程度依次為X1＞X2＞X3。

表3 回歸模型及方差分析Tab.3 Analysis of variance of regression equation

2.3 響應(yīng)面法分析兩因素的交互影響

圖4～6 顯示了提取溫度、提取時間和料液比這3 個要素的交互影響。

圖4 提取溫度(X1)和提取時間(X2)的交互作用Fig.4 Interaction effects of extraction temperature (X1) and extraction time (X2)

通過數(shù)據(jù)分析可知，圖5 和圖6 與圖4 進行比較，響應(yīng)面斜率較陡，表明提取溫度(X1)和料液比(X3)、提取時間(X2)和料液比(X3)的交互作用效果明顯，而曲面圖4 中的坡面則較緩，說明提取溫度(X1)、提取時間(X2)交互的影響不明顯。

圖5 提取溫度(X1)與料液比(X3)的交互作用Fig.5 Interaction effects of extraction temperature (X1) and solvent to material ratio (X3)

圖6 提取時間(X2)和料液比(X3)的交互作用Fig.6 Interaction effects of extraction time (X2) and solvent to material ratio (X3)

2.4 驗證性試驗

在提取溫度為90 ℃，提取時間為2.5 h 和料液比為1：25 的情況下，重復(fù)了3 次平行試驗。測出它的提取率是6.95%，和預(yù)測的值（6.806%）相近，說明該回歸模型可靠，用響應(yīng)面方法優(yōu)化加拿大一枝黃花多糖提取條件具有良好的可操作性。

2.5 加拿大一枝黃花多糖抗氧化活性研究結(jié)果

2.5.1 對O2-·自由基的清除作用

超氧自由基是由基態(tài)氧接受電子產(chǎn)生的一種氧自由基，特定的自由基會導(dǎo)致人體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，從而加速人體從皮膚到內(nèi)臟器官的衰老，可導(dǎo)致皮膚損害、癌癥以及心血管疾病等，極大地影響了人們的健康。

由圖7 可知，加拿大一枝黃花多糖、VC 均能在一定程度上清除O2-·，且隨多糖含量濃度的提升，清除率也會增加，表現(xiàn)出劑量效應(yīng)的關(guān)系。當多糖濃度值達到250 μg·mL-1時，最大的清除率應(yīng)為61.10%。

圖7 加拿大一枝黃花多糖對O2-·清除率的影響Fig.7 O2-·free radical-scavenging activities of S.canadensis polysaccharide

2.5.2 對·OH 自由基的清除作用

羥基自由基是一種很關(guān)鍵的活性氧，它是由氫氧根離子(OH-)喪失了1 個電子后產(chǎn)生的。羥基自由基具有很強氧化能力，其氧化的電位能夠達到2.8 V。本質(zhì)上，其氧化性比氟略低。羥自由基是導(dǎo)致過氧化物破損傷的重要元素。促使它形成的關(guān)鍵要素是具有輻射作用的物理和化學(xué)的各種因子。CuCl 可和H2O2進行反應(yīng)從而產(chǎn)成·OH，而·OH 可與鄰菲羅啉發(fā)生反應(yīng)，從而在455～450 nm 下產(chǎn)生發(fā)光反應(yīng)[15]。

由圖8 可見，Vc 和多糖對于自由基的清除效果不同。在一定程度上，清除能力會隨著多糖含量濃度值的增加而增加，表現(xiàn)出較強的量效關(guān)系。當多糖的濃度值達到500 μg·mL-1時，最高的清除率為58.91%。

圖8 加拿大一枝黃花多糖對·OH 清除率的影響Fig.8 ·OH free radical-scavenging activity of S.canadensis polysaccharide

2.5.3 對DPPH·自由基的清除作用

DPPH·是較為穩(wěn)定的一種自由基，呈現(xiàn)為暗紫色的棱柱形狀晶體，它的熔點在127～129 ℃之間，吸收的最大波長是517 nm。向DPPH·溶液中添加自由基的去除劑后，溶液的顏色將會慢慢變淺，與單電子進行匹配，且在517 nm 處的OD 值最小，它的變化程度和清除程度呈線性關(guān)系，和氧自由基消除水平有關(guān)。該方法可用于定性分析一些物質(zhì)對自由基進行消除的能力。

應(yīng)用公式進行轉(zhuǎn)換以后，普遍使用清除率來表示，清除率越高，它的抗氧化能力就會越強[8]，如圖9 所示，VC 清除DPPH·的能力比加拿大一枝花多糖要稍強。在試驗的一定濃度內(nèi)，呈量效關(guān)系。在多糖質(zhì)量濃度為300 μg·mL-1時，清除率最大值為63.02%。

圖9 加拿大一枝黃花多糖對DPPH·的清除率的影響Fig.9 DPPH·free radical-scavenging activity of S.canadensis polysaccharide

3 結(jié)果與討論

本實驗通過響應(yīng)面試驗獲得加拿大一枝黃花多糖最佳提取工藝是：提取溫度90 ℃，2.5 h，液料比1：25。在提取標準下，經(jīng)過多次重復(fù)性實驗，得到加拿大一枝黃花多糖平均提取率為6.95%，與模型預(yù)測值最大提取率Y=6.806%基本相符合，說明通過響應(yīng)面來優(yōu)化加拿大一枝黃花多糖提取工藝具有良好的實際操作性。試驗還探究了3 個因素的交互作用對提取速率的影響。結(jié)果顯示，提取溫度和料液比、提取時間和料液比相交互的作用非常明顯。此外，實驗還證明加拿大一枝黃花多糖具有較好的抗氧化性，對O2-·、·OH、DPPH·的清除率最大值分別為61.10%、58.91%、63.02%，并且隨著濃度的增大而增強，呈明顯的劑量依賴性關(guān)系。本試驗為加拿大一枝黃花資源利用和基礎(chǔ)研究提供了理論依據(jù)。