呂湘琳，齊紅莉，王 茜

(天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中存在很多危害性問題，在眾多問題中纖毛蟲原生動物引起的危害成為了影響水產(chǎn)養(yǎng)殖的首要因素[1]。目前我國防治此類纖毛蟲病害主要采用化學(xué)藥物以及抗生素類藥物等對危害性纖毛蟲進(jìn)行殺滅[2-3]，其大量使用會帶來藥物殘留風(fēng)險、環(huán)境污染等問題，甚至對人類的健康造成威脅[4-5]，因此某些化學(xué)藥物已被禁用。尋找化學(xué)藥物及抗生素藥物以外的其他安全高效替代控制方法已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖健康發(fā)展的關(guān)鍵。大量研究表明，中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中不僅可以有效地抑制各種病原微生物[6-7]，還可以提高魚體免疫力[8-10]，并且具有高效、天然、環(huán)保、價廉、低殘留、易于制備等優(yōu)點[11-12]。因此，使用中草藥殺滅病害性纖毛蟲符合水產(chǎn)養(yǎng)殖健康、無公害的要求。

懸游雙眉蟲Diophrys appendiculata隸屬于多膜綱，游仆目，游仆蟲科，雙眉屬[13]，是廣泛存在于養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢種[14]。目前對于雙眉蟲病害多使用高錳酸鉀，福爾馬林及魯哥氏液進(jìn)行殺滅[15]。而關(guān)于中草藥對懸游雙眉蟲的殺滅效果未見報道。當(dāng)生物體在受到外界干擾時，生物體內(nèi)產(chǎn)生活性氧(ROS)，活性氧的積累會導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步對生物體造成損傷[16]。因此，機體會啟動抗氧化酶防御系統(tǒng)來抵御毒性損傷。其中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可起到自由基清除劑的作用。由于抗氧化酶活性的變化是由于活性氧的產(chǎn)生而誘導(dǎo)的，其可作為氧化應(yīng)激毒性的生物標(biāo)志物。

本試驗以養(yǎng)殖中常見的危害種懸游雙眉蟲為試驗動物，研究了檳榔、土槿皮、仙鶴草3 種中草藥對懸游雙眉蟲抗氧化酶活性的影響，分析了SOD、CAT、GPx 的劑量-效應(yīng)關(guān)系和時間-效應(yīng)關(guān)系，利用整合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)(IBR)評價3 種中草藥對懸游雙眉蟲的毒性效應(yīng)，旨在為水產(chǎn)養(yǎng)殖中危害性纖毛蟲的防治及控制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及應(yīng)用推廣。

1 材料及方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

試驗用懸游雙眉蟲由中國海洋大學(xué)原生動物學(xué)實驗室種庫惠贈。試驗前將懸游雙眉蟲置于鹽度30 滅菌的人工海水中培養(yǎng)，以商業(yè)干酵母為食，在28 ℃恒溫、光照強度為2 000 lx、光照周期14 L：10 D(即白晝14 h，黑夜10 h)條件下進(jìn)行擴大培養(yǎng)。

1.1.2 試驗用藥

試驗所用中草藥均采購自天津市南開區(qū)華瑞大藥房。中草藥的制備根據(jù)聶江力等[17]的方法進(jìn)行?？偟鞍?A045-2-2)、超氧化物歧化酶SOD(A001-1-2)、過氧化氫酶CAT(A007-1-1)和谷胱甘肽過氧化氫酶GSH-Px(A005-1-2)的試劑盒均采購于南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶樣的制備

根據(jù)HONG Yazhen，et al[18]和LI Jiqiu，et al[19]的研究方法，將處于指數(shù)生長期的懸游雙眉蟲進(jìn)行暴露試驗、樣品制備。將懸游雙眉蟲經(jīng)毛細(xì)玻璃管吸取到含有設(shè)置好的藥物質(zhì)量濃度的處理組中，中草藥的濃度根據(jù)鄭曉楠等[20]的研究設(shè)置，各中草藥原藥液經(jīng)稀釋后得到的具體藥物質(zhì)量濃度分別為：檳榔為0、5.44、10.87、21.74 mg·L-1；土槿皮為0、5.64、11.29、22.57 mg·L-1；仙鶴草為0、11.12、33.35、100.06 mg·L-1。暴露試驗在50 mL 的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行，每個細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的終體積是40 mL，懸游雙眉蟲的密度為106ind.·L-1，每個處理組設(shè)3 個重復(fù)，試驗持續(xù)48 h 每12 h 測定1 次。

暴露于不同中草藥后，在每個間隔時間點(12、24、36、48 h)從每個處理組中收集懸游雙眉蟲細(xì)胞，使用隔膜真空泵進(jìn)行抽濾，收獲樣品。在粗酶提取的預(yù)處理過程中，樣品被保存在冰浴中。

1.2.2 抗氧化酶活性測定

超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用細(xì)胞色素C 還原法[21]，SOD 酶活力單位定義：每毫克組織蛋白在1 mL 反應(yīng)液中SOD 抑制率達(dá)50%時對應(yīng)的SOD 量為1 個酶活力單位。過氧化氫酶(CAT)活性測定采用鉬酸銨法[22]，CAT 酶活力單位定義：每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol 的H2O2的量為1 個酶活力單位。谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性通過NADPH 氧化率測定[23]，GPx 酶活力單位定義：每毫克蛋白質(zhì)，每分鐘扣除非酶反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中GSH 濃度降低1 μmol·L-1為1 個酶活力單位?？偟鞍踪|(zhì)含量根據(jù)BRADFORD M M[24]的方法測定。具體操作方法參照南京建成試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

抗氧化酶活性數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)用Sigmaplot 12.5 作圖，使用SPSS 24.0 進(jìn)行重復(fù)測量方差分析(rANOVA)確定藥物劑量，處理時間以及劑量-時間相互作用的顯著性分析[25]；使用單因素方差分析(One-way ANOVA)確定抗氧化酶活性之間是否存在顯著差異(P＜0.05 表示差異顯著)。IBR 值的計算根據(jù)BROEG K，et al[26]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 檳榔、土槿皮和仙鶴草對懸游雙眉蟲SOD 酶活性的影響

rANOVA 結(jié)果表明，除檳榔作用下劑量與時間的相互作用外，其他中草藥的濃度以及處理時間對懸游雙眉蟲SOD 酶活性的影響差異顯著(P＜0.05，表1)；懸游雙眉蟲的SOD 活性劑量-效應(yīng)反應(yīng)，總體呈上升至峰值后下降的趨勢(倒U 型曲線，圖1 A，B，C)。檳榔作用下SOD 酶活性峰值大部分出現(xiàn)在較低濃度組(5.44 mg·L-1)，土槿皮作用下SOD 酶活性峰值在12～24 h 出現(xiàn)在較低濃度組(5.64 mg·L-1)，24～48 h 出現(xiàn)在較高濃度組(11.29 mg·L-1)，仙鶴草作用下SOD 酶活性峰值則出現(xiàn)在較高濃度組(33.35 mg·L-1)。箱型圖分析表明(圖2 A，B，C)，隨著中草藥暴露時間的延長，懸游雙眉蟲SOD 活性的變化均呈先升高后降低的趨勢，檳榔、土槿皮作用下的懸游雙眉蟲SOD 酶活性在24 h 達(dá)到峰值，仙鶴草作用下懸游雙眉蟲SOD 酶活性在36 h 達(dá)到峰值。

圖1 不同濃度中草藥作用下懸游雙眉蟲的抗氧化物歧化酶(SOD)活性Fig.1 SOD activities in D.appendiculate exposed to different concentrations of Chinese herbal medicines

圖2 不同中草藥暴露時間下懸游雙眉蟲的抗氧化物歧化酶(SOD)活性的箱形圖分析Fig.2 Box-chart analyses of SOD activities in D.appendiculate exposed to different durations of Chinese herbal medicines

表1 中草藥作用下懸游雙眉蟲抗氧化酶的rANOVA 反應(yīng)結(jié)果Tab.1 Results of rANOVA for responses of D.appendiculate antioxidant enzymes following exposure to Chinese herbal medicines

2.2 檳榔、土槿皮和仙鶴草對懸游雙眉蟲CAT 酶活性的影響

rANOVA 結(jié)果表明，3 種中草藥濃度、暴露時間和時間劑量相互作用對懸游雙眉蟲CAT 活性均有顯著影響(P＜0.05，表1)；隨著中草藥暴露劑量的增加，CAT 活性呈現(xiàn)了顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖3 A，B，C)，其中土槿皮作用下，24 h 組間CAT 活性持續(xù)下降，48 h 組間CAT 活性差異不顯著(P＞0.05)。仙鶴草作用下，CAT 活性達(dá)到峰值的暴露濃度隨暴露時間的增加而升高，在12 h 和48 h 時高濃度組(100.06 mg·L-1)的CAT 活性顯著低于對照組。箱型圖分析表明(圖4 A，B，C)，隨著檳榔暴露時間的延長，懸游雙眉蟲CAT活性呈先上升后下降的趨勢，在36 h 達(dá)到峰值(P＜0.05)；在土槿皮作用下，隨暴露時間的延長，懸游雙眉蟲CAT 活性下降，峰值出現(xiàn)在12 h(P＜0.05)；仙鶴草作用下，懸游雙眉蟲CAT 活性隨時間無明顯變化(P＞0.05)。

圖3 不同濃度中草藥作用下懸游雙眉蟲的過氧化氫酶(CAT)活性Fig.3 CAT activities in D.appendiculate exposed to different concentrations of Chinese herbal medicines

圖4 不同中草藥暴露時間下懸游雙眉蟲的過氧化氫酶(CAT)活性的箱形圖分析Fig.4 Box-chart analyses of CAT activities in D.appendiculate exposed to different durations of Chinese herbal medicines

2.3 檳榔、土槿皮和仙鶴草對懸游雙眉蟲GPx 酶活性的影響

rANOVA 結(jié)果表明，三種中草藥濃度、暴露時間和時間劑量相互作用對懸游雙眉蟲GPx 活性均有顯著影響(P＜0.05，表1)。隨著中草藥暴露劑量的變化，懸游雙眉蟲GPx 活性總體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖5 A，B，C)。在檳榔、土槿皮高濃度組懸游雙眉蟲GPx 活性顯著低于對照組(P＜0.05)。箱型圖分析表明(圖6 A，B，C)隨中草藥作用時間變化，檳榔、土槿皮作用下懸游雙眉蟲的GPx 呈現(xiàn)倒U 型曲線，在12 h 達(dá)到峰值(P＜0.05)，仙鶴草作用下蟲體GPx 活性逐漸下降，在48 h 達(dá)到最低值(P＜0.05)。

圖5 不同濃度中草藥作用下懸游雙眉蟲的谷胱甘肽過氧化氫酶(GPx)活性Fig.5 GPx activities in D.appendiculate exposed to different concentrations of Chinese herbal medicines

圖6 不同中草藥暴露時間下懸游雙眉蟲的谷胱甘肽過氧化氫酶(GPx)活性的箱形圖分析Fig.6 Box-chart analyses of GPx activities in D.appendiculate exposed to different durations of Chinese herbal medicines

2.4 整合生物標(biāo)志物分析

不同劑量檳榔、土槿皮、仙鶴草脅迫下懸游雙眉蟲的整合生物標(biāo)志物水平變化如圖7 所示。從劑量效應(yīng)分析，檳榔作用下懸游雙眉蟲IBR 值總體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在5.44 mg·L-1濃度下達(dá)到峰值，土槿皮作用下懸游雙眉蟲IBR 響應(yīng)也呈現(xiàn)了相似的趨勢，在11.29 mg·L-1濃度下達(dá)到峰值，仙鶴草作用下除對照組外，其他濃度組呈現(xiàn)上升趨勢，在100.06 mg·L-1濃度時達(dá)到峰值。從時間效應(yīng)分析，檳榔作用下，對照組IBR 值無明顯趨勢，其他處理組IBR 值隨時間呈現(xiàn)先升后降的趨勢，均在24 h 達(dá)到峰值；土槿皮作用下，除5.64 mg·L-1組外，其他組IBR 值均在24 h 達(dá)到峰值，隨時間延長呈現(xiàn)下降趨勢；仙鶴草處理下，懸游雙眉蟲IBR 值隨時間變化趨勢不明顯。

圖7 不同中草藥暴露下懸游雙眉蟲整合生物標(biāo)志物響應(yīng)指標(biāo)(IBR)的變化Fig.7 Variation of IBR in D.appendiculate exposed to different durations of Chinese herbal medicines

3 討論

近年來，越來越多的學(xué)者使用抗氧化酶作為毒性評估的生物標(biāo)志物[27-28]，而中草藥對纖毛蟲抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響鮮有學(xué)者研究。目前常被用作生物標(biāo)志物的抗氧化酶有：超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)。SOD 可以催化過氧化物酶體和線粒體中產(chǎn)生的超氧陰離子，將其轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫[29]；CAT 是1 種具有強大催化功能的抗氧化酶，可以有效降解SOD 歧化生成的過氧化氫，分解過氧化氫并轉(zhuǎn)化為無毒的水和氧氣，從而進(jìn)一步避免機體受到損傷[30]。GPx 是另一種重要的內(nèi)源性抗氧化酶，用GSH 作為電子供體催化過氧化物，將其轉(zhuǎn)化為水和氧，并與SOD、CAT 一同避免機體受到氧化損傷[31-32]。

本研究中，懸游雙眉蟲的SOD 活性在3 種中草藥作用下總體上呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，這與HONG Yazhen，et al[33]研究的隨著呋喃西林濃度的增加，扇形游仆蟲Euplotes vannusSOD 的活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢相似；李邦平[34]研究的棘尾蟲Stylonychiasp.受到輕度Zn2+脅迫時，SOD 的活性升高，而當(dāng)Zn2+脅迫程度超出了棘尾蟲所能接受的范圍時，SOD 的活性則會受到抑制，產(chǎn)生細(xì)胞損傷，影響了棘尾蟲的分裂結(jié)果基本一致。上述現(xiàn)象說明，在低濃度中草藥作用于懸游雙眉蟲時，SOD 活性受到誘導(dǎo)升高，以快速清除活性氧來防止機體受到傷害，而高濃度下中草藥對懸游雙眉蟲產(chǎn)生了氧化壓力，對生物體產(chǎn)生了危害，從而影響了SOD 的合成。

本研究中，懸游雙眉蟲CAT 活性在3 種中草藥濃度、暴露時間和時間劑量相互作用下均呈現(xiàn)極顯著差異(P＜0.01)，因此可作為生物標(biāo)志物之一。在3 種中草藥作用下，懸游雙眉蟲CAT 活性的劑量-效應(yīng)關(guān)系與SOD 基本相似。檳榔作用下，CAT 活性的時間-效應(yīng)關(guān)系雖然也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但檳榔作用下的CAT 活性達(dá)到峰值的時間比檳榔作用下SOD 活性峰值的時間延后，這與韓現(xiàn)芹等[35]發(fā)現(xiàn)PCB153作用下半滑舌鰨Cynoglossus semilaevisCAT 活性誘導(dǎo)相較SOD 活性誘導(dǎo)呈現(xiàn)時間上的滯后性的研究相一致。造成此現(xiàn)象的原因是在中草藥脅迫下，蟲體SOD 酶將大量超氧陰離子轉(zhuǎn)化成H2O2，而大量H2O2在蟲體內(nèi)積累，進(jìn)而導(dǎo)致CAT 活性被大量誘導(dǎo)。在土槿皮、仙鶴草作用下，CAT 活性的時間-效應(yīng)關(guān)系總體上呈下降趨勢。推測土槿皮、仙鶴草對懸游雙眉蟲產(chǎn)生了損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)，高濃度組(22.57 mg·L-1)土槿皮作用下，蟲體CAT 活性無顯著差異，可能是高濃度的土槿皮破壞了蟲體的抗氧化酶系統(tǒng)所致，土槿皮的主要作用成分兒茶素可以增加細(xì)胞膜的通透性，造成胞內(nèi)蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)的滲漏，使機體代謝發(fā)生紊亂[36]。

本研究中，懸游雙眉蟲GPx 活性在3 種中草藥濃度、暴露時間和時間劑量相互作用下均呈現(xiàn)極顯著差異(P＜0.01)，所以GPx 也可作為中草藥對懸游雙眉蟲的毒性的生物標(biāo)志物之一。在3 種中草藥作用下，懸游雙眉蟲GPx 的活性隨濃度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，也印證了SOD、CAT 活性變化的結(jié)果。RUAN Yuanyuan,et al[37]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于苯酚下，扇形游仆蟲和多小核草履蟲Paramecium multimicronucleatumGPx 活性的劑量響應(yīng)隨苯酚濃度的增加而呈倒U 型曲線，這與本研究結(jié)果基本一致。然而高濃度檳榔、土槿皮作用下48 h 懸游雙眉蟲的GPx 活性顯著低于對照組(P＜0.05)，是由于高濃度的檳榔、土槿皮對蟲體造成了損傷。多數(shù)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中對病害纖毛蟲有良好的殺滅作用的有效成分是檳榔的檳榔堿及檳榔次堿[38-40]。

由于不同抗氧化酶活性在中草藥作用下既出現(xiàn)誘導(dǎo)情況又存在抑制情況，且不同抗氧化酶對中草藥脅迫的響應(yīng)不同，因此將這幾種抗氧化酶指標(biāo)結(jié)合起來，即使用整合生物標(biāo)志物響應(yīng)指標(biāo)(IBR)來進(jìn)行分析可以更有效地評估藥物對纖毛蟲的毒性效應(yīng)[41]。IBR 指數(shù)在環(huán)境污染檢測以及魚類毒性作用的評估中廣泛應(yīng)用[42-43]。本試驗中，仙鶴草作用下懸游雙眉蟲的IBR 值最高，鄭曉楠等[20]研究證實中草藥對懸游雙眉蟲的毒性大小依次為：檳榔＞土槿皮＞仙鶴草，本研究在鄭曉楠等人研究的基礎(chǔ)上使用產(chǎn)生相同毒性效應(yīng)的中草藥劑量進(jìn)行試驗，發(fā)現(xiàn)毒性較低的仙鶴草對懸游雙眉蟲的抗氧化酶系統(tǒng)影響最顯著，孫希[44]也發(fā)現(xiàn)仙鶴草中鞣質(zhì)成分可顯著提高小鼠血液中SOD 活力達(dá)到抗氧化作用。胡梁及等[45]的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)中草藥作用于患有車輪蟲病的金鼓魚Scatophagus argus時，仙鶴草對車輪蟲Trichodinasp.的毒性低于土槿皮和檳榔，這可能是不同的纖毛蟲對藥物的耐受性不同，但仙鶴草在800 mg·L-1對金鼓魚仍無毒性，因此仙鶴草可作為最安全的中草藥。

4 結(jié)論

綜上所述，3 種中草藥作用下，懸游雙眉蟲SOD、CAT、GPx 活性變化趨勢相似，CAT、GPx 活性的重復(fù)測量方差分析均呈現(xiàn)極顯著差異，因此CAT、GPx 活性的變化可作為纖毛蟲對中草藥響應(yīng)的生物標(biāo)志物；仙鶴草的IBR 指數(shù)總體上高于土槿皮和檳榔的IBR 指數(shù)，因此仙鶴草對懸游雙眉蟲的抗氧化酶活性影響最明顯。