陳 鈺，曾廣婷，劉 梅，汪佳歡，劉行平，竺柏康，陳慶國(guó)

(1.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)石油化工與環(huán)境學(xué)院，浙江舟山 316022；3.舟山市污水處理有限公司，浙江舟山 316000)

伴隨著海上石油的開(kāi)發(fā)與運(yùn)輸，海上溢油事故時(shí)有發(fā)生，海洋石油污染問(wèn)題一直是亟待解決的重大環(huán)境問(wèn)題[1]。目前，海洋溢油污染治理方法主要分為物理、化學(xué)和生物修復(fù)技術(shù)。生物修復(fù)技術(shù)由于是實(shí)現(xiàn)石油無(wú)害化及實(shí)現(xiàn)生態(tài)恢復(fù)的唯一途徑，在處理海洋溢油方面發(fā)揮了巨大作用[2]。其中，固定化微生物技術(shù)因其經(jīng)濟(jì)效益好、污染物去除效率高、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)已在溢油污染修復(fù)工程得到應(yīng)用[3-4]。固定化微生物技術(shù)是指通過(guò)物理或化學(xué)方式將所需要的游離態(tài)微生物集中固定在某一特定載體內(nèi)，使其在適宜的環(huán)境條件下保持生物活性并迅速增殖的方法[5]。相比于傳統(tǒng)的微生物處理方法，該技術(shù)有效提高了特定菌種對(duì)環(huán)境中原油等污染物質(zhì)的處理效率[6]。目前研究的熱點(diǎn)和應(yīng)用前景廣泛的一種載體是生物炭，由于其優(yōu)良的吸附性能和生物兼容性，在固定化微生物應(yīng)用領(lǐng)域越來(lái)越得到重視[7]。生物炭來(lái)源廣泛，可由各種廢棄的有機(jī)生物質(zhì)高溫碳化獲得。其中，污泥基生物炭，來(lái)源于常見(jiàn)的固廢城市污泥，因具有高的比表面積和豐富的孔隙結(jié)構(gòu)以及大量的官能團(tuán)等特點(diǎn)，是污泥資源化利用的有效途徑，已被應(yīng)用于土壤和水污染治理與修復(fù)中[8-9]，包含重金屬、氨氮和多環(huán)芳烴等多種污染物的去除[10-12]。因此，將污泥基生物炭固定化微生物應(yīng)用于海洋溢油修復(fù)有望成為助力解決海洋石油污染的有力手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

城市污水廠脫水污泥，干燥、粉碎后保存?zhèn)溆?；菌種為實(shí)驗(yàn)室保存的海洋石油烴降解菌Alcanivoraxsp.ASW-2；磷酸、無(wú)水硫酸鈉等所用藥劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10 g,牛肉膏3 g，NaCl 10 g,去離子水1 000 mL。

原油培養(yǎng)基：培養(yǎng)基配方按照文獻(xiàn)[13]，原油添加量為0.1～5 g·L-1。

所有培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min 后使用，接種后的培養(yǎng)基置于振蕩培養(yǎng)箱中120 r·min-1培養(yǎng)，除溫度條件優(yōu)化外，其余均為25 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 生物炭載體制備

采用常用的生物炭活化劑磷酸對(duì)污泥進(jìn)行活化[14]。以不同濃度的磷酸溶液(30%～60%)對(duì)經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的干燥污泥進(jìn)行活化，將活化后污泥置于管式爐中(氮?dú)獗Ｗo(hù))，進(jìn)行單因素單水平實(shí)驗(yàn)，參考文獻(xiàn)[15]生物炭制備條件，設(shè)定不同碳化溫度(300～800 ℃)與碳化時(shí)間(0.5～2.5 h)，優(yōu)化制備生物炭，獲得制備污泥基生物炭的最優(yōu)條件，同時(shí)根據(jù)掃描電鏡與紅外光譜分析制備的污泥基生物炭特性。

1.3.2 生物炭固定化微生物效果評(píng)價(jià)

將石油烴降解菌ASW-2 在肉湯培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)3 d，對(duì)該菌進(jìn)行離心制備菌懸濁液。該菌菌濃在5×108～5×1011CFU·mL-1之間OD600吸光度呈線(xiàn)性，獲得線(xiàn)性方程菌濃y=8×1011x(OD600)-7×1010。根據(jù)吸光度調(diào)節(jié)配制菌濃為5×1011CFU·mL-1菌懸濁液，用1 g 制備的生物炭對(duì)50 mL 菌懸濁液吸附固定10 h，以吸附前后菌懸濁液的OD600值為評(píng)價(jià)指標(biāo)[16]，考察不同條件下制備的生物炭對(duì)石油烴降解菌ASW-2 的吸附固定能力，進(jìn)而優(yōu)化生物炭制備條件。也通過(guò)單因素單水平實(shí)驗(yàn)考察不同菌濃的菌懸液(5×1010～5×1011CFU·mL-1)與不同吸附時(shí)間(2～30 h)對(duì)生物炭吸附固定降解菌效果的影響，優(yōu)化降解菌ASW-2 固定化條件。

1.3.3 微生物降解原油實(shí)驗(yàn)

采用單因素單水平實(shí)驗(yàn)，考察固定化菌與游離菌在相同條件下對(duì)不同濃度的原油(0.1～5 g·L-1)的降解效率，探究降解效率隨降解時(shí)間(0～15 d)的變化。設(shè)定不同鹽度(10～40)、pH(6～9)、溫度(5～35 ℃)條件下降解原油。初始實(shí)驗(yàn)條件為溫度25 ℃、鹽度30、pH 8，原油濃度為1 g·L-1降解7 d。實(shí)驗(yàn)按順序進(jìn)行，上一步實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件作為下一步實(shí)驗(yàn)的設(shè)定條件。參考文獻(xiàn)[17]方法，用紫外分光光度法(254 nm 波長(zhǎng))測(cè)定微生物降解前后培養(yǎng)基原油濃度變化，優(yōu)化固定化菌的降解條件，并與游離菌的降解效果作對(duì)比。通過(guò)氣相色譜儀(GC-FID)和氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)測(cè)定固定化微生物和游離微生物降解前后石油中主要的烴組分的變化[18]，以考察生物炭固定化微生物對(duì)石油各組分的降解特性。

2 結(jié)果與討論

2.1 污泥基生物炭制備與微生物固定化條件優(yōu)化

2.1.1 活化劑濃度與活化時(shí)間對(duì)生物炭吸附效果的影響

制備生物炭的碳化溫度為600 ℃，碳化時(shí)間30 min，考察了活化劑磷酸的濃度及活化時(shí)間對(duì)生物炭吸附固定石油降解菌效果的影響，結(jié)果如圖1 所示。由圖1(a)可知，隨磷酸濃度的升高，生物炭對(duì)石油降解菌的吸附量呈上升趨勢(shì)，磷酸濃度由45%提升至50%時(shí)，生物炭的吸附效果得到顯著提升，因?yàn)楦邼舛攘姿釋?duì)污泥的潤(rùn)漲作用增強(qiáng)，加速了造孔速度。其中，磷酸濃度達(dá)到55%時(shí)生物炭的吸附能力最強(qiáng)，對(duì)石油降解菌的吸附量達(dá)到1.64×1011CFU·g-1。而磷酸進(jìn)入污泥內(nèi)部對(duì)污泥進(jìn)行活化需要一定時(shí)間[19]，圖1(b)表明活化時(shí)間與生物炭的吸附能力隨活化時(shí)間增長(zhǎng)先增加后減少。活化時(shí)間為2 h 時(shí)生物炭對(duì)石油降解菌的吸附量達(dá)到最大，吸附量為1.77×1011CFU·g-1。

圖1 活化劑使用條件優(yōu)化Fig.1 Optimization of activator conditions

2.1.2 碳化溫度與碳化時(shí)間對(duì)生物炭吸附效果的影響

制備生物炭的活化劑濃度為55%，活化時(shí)間為2 h，考察了碳化溫度及碳化時(shí)間對(duì)生物炭吸附固定石油降解菌效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2(a)可見(jiàn)，碳化溫度為300～500 ℃時(shí)生物炭對(duì)石油降解菌的吸附效果呈上升趨勢(shì)，碳化溫度為550 ℃時(shí)，由于有機(jī)物大量揮發(fā)，生物炭表面逐漸形成比較完善的孔隙結(jié)構(gòu)，比表面積增大，生物炭的吸附能力最強(qiáng)。碳化溫度上升至600 ℃時(shí)，可能是由于生物炭孔隙結(jié)構(gòu)由微孔變?yōu)橹锌谆虼罂祝瑢?dǎo)致比表面積減小，生物炭的吸附能力有所下降[20]。隨著溫度繼續(xù)提高，污泥中少量無(wú)機(jī)物的分解和有機(jī)物之間的縮合使生物炭孔隙結(jié)構(gòu)重新形成，使生物炭吸附效果有所提升。此結(jié)果與楊艷琴等[21]、王格格等[22]研究結(jié)果一致。由圖2(b)可知，隨著碳化時(shí)間的增長(zhǎng)，生物炭對(duì)石油降解菌的吸附量先增后降，碳化時(shí)間為1 h 時(shí)生物炭的吸附效果最佳。因?yàn)槲勰嘈枰欢〞r(shí)間才能完全碳化，碳化不完全時(shí)生物炭孔隙結(jié)構(gòu)不發(fā)達(dá)，吸附效果較差。1 h 后生物炭碳化完全，碳化時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，原本較完善的孔隙結(jié)構(gòu)被破壞，生物炭吸附效果變差。

圖2 碳化條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of carbonization conditions

2.1.3 生物炭固定化微生物條件優(yōu)化

將優(yōu)化條件下制備的生物炭進(jìn)行微生物固定化條件優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3(a)表明，生物炭對(duì)石油降解菌的固定量整體隨初始菌液濃度的提高而增長(zhǎng)，當(dāng)初始菌濃超過(guò)3×1011CFU·mL-1時(shí)生物炭固定量的提升速率有所下降。初始菌濃較低時(shí)菌懸液中的石油降解菌幾乎都被生物炭所吸附，石油降解菌量限制了生物炭的吸附能力[23]。當(dāng)初始菌濃增加時(shí)，生物炭的吸附能力得到快速提升，當(dāng)初始菌濃為5×1011CFU·mL-1時(shí)生物炭對(duì)石油降解菌的吸附量最大，為1.94×1011CFU·g-1。

圖3(b)可以看出，當(dāng)初始菌濃為5×1011CFU·g-1時(shí)，0～12 h 時(shí)生物炭對(duì)石油降解菌的固定量隨時(shí)間變化增長(zhǎng)迅速，因生物炭的吸附能力有一定限度，12 h 后生物炭對(duì)石油降解菌的吸附基本達(dá)到飽和，固定化菌量達(dá)到2.06×1011CFU·g-1，隨時(shí)間繼續(xù)增長(zhǎng)，生物炭吸附的菌量基本保持恒定，甚至略有下降。此趨勢(shì)與秦麗姣[24]在探究不同時(shí)間下載體材料對(duì)石油降解菌吸附量的研究結(jié)果一致。

圖3 生物炭吸附固定化菌條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of conditions for biochar adsorbed immobilization of bacteria

2.2 制備的生物炭的性能表征

2.2.1 SEM 表征

污泥樣品處理前后的掃描電鏡圖如圖4 所示：磷酸活化后，污泥呈現(xiàn)明顯的層狀結(jié)構(gòu)，增大了比表面積，提供大量吸附位點(diǎn)，使其吸附性能增強(qiáng)[25]。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，細(xì)菌在污泥基生物炭?jī)?nèi)部生長(zhǎng)，并分泌出較多的如多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子代謝產(chǎn)物分布在污泥基生物炭表面使其表面變得很光滑。制備的磷酸活化改性的生物炭比表面積為29.13 m2·g-1，總孔體積為0.043 m2·g-1，平均孔徑為12.32 nm，與文獻(xiàn)[21]制備的生物炭性能相當(dāng)。

圖4 樣品SEMFig.4 SEM image of samples

2.2.2 紅外光譜表征

如圖5 所示，污泥高溫碳化后，1 424 cm-1(締合態(tài)的酰胺基吸收峰)、870 cm-1(伯胺的NH 面外彎曲振動(dòng)峰)，相對(duì)于未碳化樣品吸收峰顯著增強(qiáng)，說(shuō)明含氮有機(jī)質(zhì)在高溫下發(fā)生聚合。3 744 cm-1、710 cm-1也出現(xiàn)了較為明顯的吸收峰，為-OH的振動(dòng)峰，是氫鍵締合產(chǎn)生的吸收峰，特別是預(yù)處理中使用H3PO4活化污泥引入-OH 后吸收峰較為明顯增強(qiáng)。H3PO4活化后生物炭樣品中吸收峰(1 034 cm-1，C-O-C 伸縮振動(dòng)峰；560 cm-1，芳香酮類(lèi)羰基振動(dòng)峰)相對(duì)于直接高溫碳化的吸收峰顯著增強(qiáng)[26]，說(shuō)明磷酸活化后使制備的生物炭活性官能團(tuán)明顯增多。

圖5 污泥樣品與不同處理制備的生物炭的FTIR圖譜Fig.5 FTIR spectra of sludge samples and biochar prepared by different treatments

2.3 固定化微生物降解原油的特性與環(huán)境條件優(yōu)化

2.3.1 固定化載體對(duì)原油的吸附貢獻(xiàn)

設(shè)定初始固定化載體添加量為1 g·L-1，原油濃度為1 g·L-1，考察固定化載體添加量及原油濃度對(duì)生物炭載體去除原油影響，結(jié)果如圖6 所示。由圖6 可以看出，隨著載體添加量的增加，載體對(duì)原油的吸附率有所提升，但整體吸附效果不佳，而原油濃度與載體吸附率之間未呈現(xiàn)明顯相關(guān)性。固定化載體對(duì)油吸附的貢獻(xiàn)較小，對(duì)原油的吸附率均在5%以下，結(jié)合固定化菌對(duì)原油降解率數(shù)據(jù)可以看出，固定化菌對(duì)原油的去除主要是生物降解貢獻(xiàn)。在不同原油濃度條件下，微生物對(duì)原油的降解率可達(dá)32%～90%。而且，扣除吸附貢獻(xiàn)，固定化載體的添加也顯著促進(jìn)了生物降解，載體固定化后微生物對(duì)不同濃度原油的降解效果可提升8%～17%。

圖6 生物炭載體對(duì)原油去除影響Fig.6 Effect of biochar carrier on crude oil removal

2.3.2 原油濃度與降解時(shí)間對(duì)固定化微生物降解原油的影響

考察了原油濃度與降解時(shí)間對(duì)固定化微生物降解原油的影響，結(jié)果如圖7 所示。如圖7(a)所示，固定化菌與游離菌對(duì)原油的降解率均隨原油濃度的升高而下降，高濃度原油對(duì)石油降解菌有一定抑制作用。原油濃度為0.1 g·L-1時(shí)，降解7 d，固定化菌與游離菌對(duì)原油的降解效果最佳，降解率分別為97.78%與90.24%。而隨著濃度增加，原油的抑制效果逐漸增強(qiáng)，5 g·L-1的高濃度原油條件下降解率分別降至50%和35%以下。陳曦等[27]研究也表明石油濃度過(guò)高，限制微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，甚至對(duì)石油降解菌產(chǎn)生毒害作用。與游離菌相比，固定化提升了微生物對(duì)原油的降解效率，在原油濃度為1 g·L-1，固定化對(duì)微生物降解的促進(jìn)作用最為顯著，提升降解率可達(dá)17.23%；設(shè)定原油濃度為1 g·L-1時(shí)，考察了微生物對(duì)原油的降解率隨降解時(shí)間的變化，結(jié)果如圖7(b)所示。如圖7(b)所示，微生物對(duì)原油的降解率隨降解時(shí)間的增長(zhǎng)先增加后趨于平穩(wěn)。第7 天時(shí)固定化菌對(duì)原油的降解率趨于穩(wěn)定，為75.87%，比游離菌高23.98%。游離菌對(duì)原油的降解在第9 天趨于穩(wěn)定，降解率為56.67%。與游離菌相比，固定化加快了微生物對(duì)原油的降解速率，提高了石油烴降解菌對(duì)原油的降解效果。已有文獻(xiàn)已報(bào)道利用各種材料吸附固定化降解菌提高對(duì)石油的生物降解效率。宋佳宇等[28]利用改性聚丙烯工業(yè)吸油棉吸附固定化石油降解菌，相比游離菌，18 d 降解后固定化菌對(duì)1 g·L-1的原油去除率為70.01%，比游離菌提高20%左右；韓志勇等[29]利用核桃殼吸附固定石油烴降解菌，在原油濃度為3.9 g·L-1、固定化菌7 d 對(duì)原油降解率達(dá)到66.8%。ZHOU Hanghai,et al[30]利用玉米秸稈生物炭固定化石油烴降解菌降解燃料油，對(duì)1%的燃料油7 d 降解率可達(dá)94.7%，比游離菌提高40.3%。以上研究表明，生物炭在促進(jìn)原油生物降解方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。

圖7 原油濃度與降解時(shí)間對(duì)固定化菌降解原油的影響Fig.7 Effects of crude oil concentration and degradation time on crude oil degradation by immobilized bacteria

2.3.3 環(huán)境條件對(duì)固定化微生物降解原油的影響

利用固定化菌和游離菌對(duì)1 g·L-1原油降解7 d，考察在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的環(huán)境條件(溫度、鹽度、pH)變化范圍內(nèi)，溫度、鹽度、pH 對(duì)固定化菌和游離菌降解原油效率的影響，結(jié)果如圖8 所示。如圖8 所示，隨著溫度、鹽度、pH 的增加，降解菌對(duì)原油的降解率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。微生物對(duì)這些環(huán)境因素有一定耐受范圍，超過(guò)耐受范圍后微生物對(duì)原油的降解效果明顯下降[31]。菌降解原油的最適溫度為25 ℃，高溫與低溫對(duì)微生物降解原油產(chǎn)生一定抑制作用，但固定化對(duì)溫度抑制作用有一定程度減弱；鹽度為30 時(shí)，菌對(duì)原油的降解效果最佳，鹽度為10～30 時(shí)固定化對(duì)菌原油降解率的提升效果較好，當(dāng)鹽度繼續(xù)上升時(shí)由于高鹽度的抑制作用，固定化的提升效果有所下降；固定化菌與游離菌的最適pH 分別為7.5 與8，pH 改變時(shí)固定化菌原油降解率的變化較小，說(shuō)明固定化顯著提升了菌對(duì)pH 的耐受性。田秀梅等[32]的研究也表明，pH為7～8 時(shí)固定化菌對(duì)石油的去除效果較佳，pH 過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)繁殖和酶的活性。固定化提升了石油降解菌對(duì)環(huán)境的耐受性，在相同環(huán)境條件下，經(jīng)過(guò)7 d 降解，固定化后菌對(duì)原油的降解率最大可達(dá)78.71%，與游離菌相比降解效率可提升約28%。

圖8 環(huán)境條件對(duì)固定化菌降解原油的影響Fig.8 Effects of environmental conditions on degradation of crude oil by immobilized bacteria

2.3.4 微生物對(duì)正構(gòu)烷烴與多環(huán)芳烴的降解

游離菌和固定化菌降解原油7 d 后的樣品(未接種的原油培養(yǎng)基做空白)，利用GC-FID 和GC-MS 測(cè)定油樣品中主要烷烴組分(C10-C32)和芳烴組分(16 種海洋中常見(jiàn)的多環(huán)芳烴)變化[33]如圖9 所示。如圖9所示看出，降解菌ASW-2 對(duì)正構(gòu)烷烴和多環(huán)芳烴均有一定降解去除。降解菌ASW-2 對(duì)正構(gòu)烷烴(C12-C32)的降解作用(37.4%)顯著高于多環(huán)芳烴(23.5%)。而污泥基生物炭固定化菌顯著提高了石油降解菌對(duì)正構(gòu)烷烴和多環(huán)芳烴的去除，污泥基生物炭固定化菌對(duì)正構(gòu)烷烴去除率可達(dá)51.3%，去除率提高13.9%；對(duì)多環(huán)芳烴去除率可達(dá)28.8%，去除率提高5.3%。污泥基生物炭固定化菌對(duì)于中短鏈烷烴特別是C28 以下烷烴去除效果提高顯著，而對(duì)于長(zhǎng)鏈烷烴去除效果(C28 以上)提高效果小于中短鏈烷烴，污泥基生物炭固定化菌對(duì)于多環(huán)芳烴中含量較高的三環(huán)和四環(huán)的多環(huán)芳烴，如苊、蒽、熒蒽去除具有較明顯的提高效果，這與KUMARI S,et al[34]的研究結(jié)果一致。

圖9 降解前后主要原油組分變化Fig.9 Changes of main components of crude oil before and after degradation

3 結(jié)論

本論文探究了污泥基生物炭制備、吸附固定化微生物與微生物降解原油條件的優(yōu)化，并考察了固定化微生物降解原油的特性，得出以下結(jié)論：

(1)55%磷酸活化2 h 并在500 ℃條件下碳化1 h 后制得的生物炭具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，吸附效果較好，對(duì)石油降解菌的吸附量最大可達(dá)1.77×1011CFU·g-1。

(2)生物炭固定化微生物的最優(yōu)初始游離菌濃為5×1011CFU·g-1，在此菌濃條件下吸附12 h 后，生物炭對(duì)微生物的吸附達(dá)到穩(wěn)定，吸附量可達(dá)2.06×1011CFU·g-1。

(3)在pH 為8，鹽度為30，溫度為25 ℃的環(huán)境條件下，固定化菌對(duì)原油的降解效果最佳。在最優(yōu)環(huán)境條件下降解7 d 后，固定化菌對(duì)1 g·L-1原油的最大降解率可達(dá)78.71%。

(4)與游離微生物相比，生物炭固定化后的微生物對(duì)原油的降解能力更強(qiáng)，且對(duì)環(huán)境有更強(qiáng)的耐受性。生物炭固定化顯著提高了石油降解菌對(duì)正構(gòu)烷烴和多環(huán)芳烴的去除，正構(gòu)烷烴去除率提高13.9%，多環(huán)芳烴去除率提高5.3%。