曾志浩　袁宗勝　黃曉南　劉芳

摘要 選取紅樹植物秋茄（Kandelia candel）、桐花樹（ Aegiceras corniculatum ）、白骨壤（Avicennia marina）為研究對象，分別采集紅樹植物的根、莖、葉部組織，分離各組織的內生真菌，提取DNA，通過PCR擴增后進行ITS鑒定。結果顯示：從紅樹植物樣本中共分離出139株內生真菌，分屬于7綱15目17科32屬。從秋茄、桐花樹、白骨壤中分離的內生真菌分別占據了總菌數的34.53%、28.78%、36.69%，其中以青霉屬、芽枝孢屬、擬莖點霉屬、間座殼屬為優(yōu)勢菌屬。在不同組織樣本中，以莖部分離出的內生真菌數量最多，并且鑒定出的種屬數量也最多，其次為根部，葉部最少。分布在不同植物及不同組織中內生真菌存在著顯著差異性和多樣性。

關鍵詞 紅樹植物;內生真菌;分離;鑒定;多樣性

中圖分類號：Q939.5文獻標識碼：Adoi：10.13601/j.issn.1005-5215.2022.04.011

Isolation and Diversity of Mangrove Endophytic Fungi

Zeng Zhihao Yuan Zongsheng Huang Xiaonan Liu Fang

（1. College of Life Sciences，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，Fujian;2. Institute of Oceanography，Minjiang University，Fuzhou 350108，Fujian;3. Fuzhou Ocean and Fisheries Technology Center，Fuzhou 350007，Fujian）

Abstract Mangrove plants incorporating Kandelia candel，Aegiceras corniculatum and Avicennia marina were selected. The roots，stems and leaf tissues of three species trees were collected to isolate the endophytic fungi from tissues in this trial. The endophytic fungi DNA was extracted and then PCR amplification was performed to identify ITS region. The results showed that 139 endophytic fungi were isolated from mangrove plant samples，which belonged to 7 classes，15 orders，17 families and 32 genera. The number of endophytic fungal strains isolated from K. candel，A. corniculatum and A. marina accounted for 34.53%，28.78%，and 36.69% of the total fungi number，respectively. Among them，Penicillium，Cladosporium，Phomopsis，Diaporthe were the dominant genus. Among different tissue samples，the identified species and genera number of endophytic fungi isolated from stems was the largest，followed by roots，and leaves were the least. This study fully demonstrated that there are significant differences and diversity of endophytic fungi distributed in different plants and different plant tissues.

Key wordsMangrove plants;endophytic fungi;isolation;identification;diversity

紅樹林以紅樹植物為主體，同時有著半紅樹植物及其伴生植物，生境具有強酸性、高還原性等特征[1]。福建省是中國紅樹林目前分布最北的省份，有著10余種真紅樹植物及多種半紅樹植物。紅樹林的微生物資源豐富，從其中分離鑒定的真菌超過280種，是海洋真菌的第二大類群[2]。內生真菌指能和植物體和諧共生，在植物中不會引起明顯疾病的一類真菌[3]。紅樹林植物內生真菌因為生境特殊，而具有特殊的遺傳背景;在種類和代謝產物上具有豐富多樣性，并形成特有的代謝路徑[4]。

通過對內生真菌的研究可以探尋其與植物宿體生長發(fā)育間存在的聯(lián)系規(guī)律，內生真菌從植物中獲取養(yǎng)分，同時分泌代謝產物影響著植物體的生長發(fā)育。部分真菌可以分泌能夠提高植物體抵抗力、增強植物體抗逆性的次生代謝物[5]，有的真菌還具有生態(tài)功能，可對宿主植物產生對生境適應性以及物質與能量應用上的影響[6]。本研究以福建漳州和泉州紅樹植物品種秋茄（Kandelia candel）、桐花樹（ Aegiceras corniculatum ）、白骨壤（Avicennia marina）為樣本，分離其內生真菌，并對其多樣性進行了分析，為紅樹林內生真菌的進一步研究以及實踐應用奠定基礎。837341F5-7F5A-42C1-A2C7-DB01FB127365

1 材料與方法

1.1 材料

分離樣本來源 ：紅樹植物秋茄、桐花樹、白骨壤的根、莖、葉，采自福建省漳州市和泉州市。選擇健康的植物組織，將采集樣品迅速裝入無菌密封樣品袋中，避免受到外來污染，標記時間、地點等信息，12 h內帶回實驗室進行分離。

培養(yǎng)基：海水馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（Seawater-PDA，SPDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，采樣地海水1 000 mL。

主要試劑：75%乙醇、2%次氯酸鈉溶液、無菌海水等，PCR引物及常規(guī)操作所用試劑。

1.2 紅樹內生真菌的分離與純化

將采集到的根、莖、葉用流水沖洗干凈后放入超聲水浴鍋內超聲清洗3次，每次超聲10～15 s，并用無菌粗濾紙吸干水分并晾干，接著用75%的乙醇浸泡60 s，2%次氯酸鈉溶液浸泡5 min進行表面消毒，隨后用無菌水漂洗5次，無菌粗濾紙吸干水分。接著在無菌條件下，將樣品切成5 mm×5 mm的小塊，放置于SPDA培養(yǎng)基平板，置25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時觀察。長出菌落后，取不同特征邊緣菌絲接種于新的SPDA培養(yǎng)基，逐步純化，得到純化菌株[7]。

1.3 ITS序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析

將內生真菌菌株置于SPDA培養(yǎng)基培養(yǎng)大約5 d后，通過真菌基因組提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）提取內生真菌的DNA，再使用ITS1和ITS4引物（序列ITS1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3;ITS4： 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）對其進行PCR擴增。

（1）反應體系：反應液總體積 25 μL，上下游引物各 1 μL，Premix Taq 12.5 μL，模板（提取的真菌 DNA）3 μL，dd H₂O 7.5 μL。

（2）反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40次循環(huán);最后，將其在72 ℃下延伸5 min[8]。

PCR產物經1% （W/V）瓊脂凝膠電泳檢測后送至上海生工生物工程有限公司。依據測序結果，登錄數據庫http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/對所得的ITS基因序列進行相似度比對及同源性分析，并以此構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定內生真菌的分類地位。

2 結果與分析

2.1 紅樹植物內生真菌的分離

2.1.1 秋茄、桐花樹、白骨壤內生真菌的多樣性

采集來自漳州、泉州的紅樹植物秋茄、白骨壤、桐花樹的根、莖、葉，通過分離和純化得到可培養(yǎng)真菌139株，通過基因測序結果分析共獲得真菌，分屬于7綱15目17科32屬，結果如表1。

其中青霉屬、芽枝孢屬、擬莖點霉屬、間座殼屬分布較為多樣化，不集中出現在特定植物、特定部位，所以其為主要優(yōu)勢菌屬?？偣?2屬真菌中，有18屬真菌僅出現一株或兩株，分布具有特殊性和局限性，分別為枝頂孢霉屬、擬青霉屬、絲衣霉屬、刺盤孢屬、黑孢屬、葉點霉屬、半殼霉屬、輪層炭殼菌屬、糞殼菌屬、瓶霉菌屬、毛殼菌屬、叢赤殼屬、籃狀菌屬、栗疫屬、路霉屬、Thyridariella mahakoshae、Neodevriesia strelitziicola、Leptosillia。鐮孢霉屬和新梭球菌雖然分離得到的菌數較多，但是集中出現在相同植物或相同部位，分布具有宿主專一性或組織專一性，不能算作優(yōu)勢菌屬。莢孢腔屬的菌株大多序列相似性較低，屬于未知菌屬。

2.1.2 紅樹植物不同組織分離結果

不考慮紅樹植物品種，僅分析紅樹植物不同組織分離得到的內生真菌的種屬數量和菌株數量（圖1），從紅樹植物莖部分離得到105株內生真菌，與其他組織相比數量最多;從根部分離得到21株內生真菌;葉部最少，分離內生真菌為13株。但是分離的菌株數量和真菌種屬數量不呈正相關關系，莖部分離內生真菌種屬數量僅為25屬，根部分離內生真菌種屬數量為11屬，葉部分離內生真菌種屬數量為7屬，原因是莖部分離的內生真菌存在很多重復相似種屬，根部和葉部分離的內生真菌數量雖然遠小于莖部，但是多樣性更強。同時可以看出一株植物的根、枝、葉等組織中所存在的內生真菌數量和種類并不相同。

2.1.3 不同紅樹植物的不同組織部位分離的內生真菌的多樣性

根據分離出的真菌的核酸序列，可確定從漳州和泉州的秋茄、白骨壤、桐花樹的根、莖、葉中共計分離出139株可培養(yǎng)內生真菌。在組織水平上，秋茄樣品分離出48株真菌分屬18屬：根部8株分屬4屬，莖部39株分屬15屬，葉部1株1屬;白骨壤樣品分離出51株真菌分屬20屬：根部8株分屬5屬，莖部36株分屬14屬，葉部7株分屬5屬;桐花樹樣品分離出40株真菌分屬18屬：根部5株分屬4屬，莖部30株分屬13屬，葉部5株分屬4屬，如表2。

由表2可看出，不同紅樹植物分離內生真菌數量占比不同，相同紅樹植物不同組織中分離內生真菌數量也各不相同。白骨壤中分離出的內生真菌數量占比最高，秋茄其次，桐花樹最低。從兩地紅樹植物的莖部分離出的菌株數量最多，遠多于根部和葉部，根部的菌株數量略多于葉部。

從紅樹植物分離出的內生真菌種屬數量來看，我們擬定標準：占植物分離內生真菌總數的10%及以上的真菌種屬為該植物的優(yōu)勢菌屬。按照這個標準，則可以分析得到不同紅樹植物的優(yōu)勢菌屬各不相同。秋茄樣品的優(yōu)勢菌屬為擬莖點霉屬（分離得到9株）、新梭球菌（分離得到7株）、短梗霉屬（分離得到6株），前2種優(yōu)勢菌屬僅在莖部分離得到，而短梗霉屬菌株出現在根和莖的樣品中。白骨壤樣品的優(yōu)勢菌屬為鉤端螺旋藻（分離得到5株），僅出現在莖部;鐮孢霉屬（分離得到14株），出現在根和莖的樣品中。桐花樹樣品的優(yōu)勢菌屬為鉤端螺旋藻（分離得到4株）和莢孢腔屬（分離得到9株），前者在根和莖的樣品中有出現，后者僅出現在莖的樣品中。837341F5-7F5A-42C1-A2C7-DB01FB127365

可以看出，白骨壤和桐花樹的優(yōu)勢菌屬有一定相似性，都包括了鉤端螺旋藻。白骨壤分離出的內生真菌數量最多，種屬數量也最多，但和桐花樹一樣菌屬優(yōu)勢不明顯，秋茄分離出的優(yōu)勢菌屬多樣，三者總體具有豐富性。

2.1.4 紅樹植物不同地理位置分離結果

從位置水平上看，從采自泉州的桐花樹中分離得到21株內生真菌（根部2株，莖部17株，葉部2株），而從采自漳州的桐花樹中分離得到19株內生真菌（根部3株，莖部13株，葉部3株）;從采自泉州的白骨壤中分離得到22株內生真菌（莖部16株，葉部6株），而漳州白骨壤分離得到29株內生真菌（根部8株，莖部20株，葉部1株）;泉州的秋茄共分離出17株內生真菌，全部為莖部分離得到，而從采自漳州的秋茄中分離得到31株內生真菌（根部8株，莖部22株，葉部1株）。

不難看出，漳州的紅樹林植物所能分離出的內生真菌群落的豐富性要高于泉州的紅樹林植物。而采自漳州和泉州的桐花樹的內生真菌群落豐富性和多樣性大體相似，采自漳州的白骨壤的內生真菌群落在組織分布上的多樣性要高于采自泉州的白骨壤，采自漳州的秋茄的內生真菌群落在豐富性和組織分布多樣性上都高于采自泉州的秋茄。

2.2 紅樹植物內生真菌的ITS序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2.1 紅樹植物內生真菌的ITS序列比對分析

對所分離的139株紅樹植物內生真菌菌株進行ITS序列分析后，為了鑒別出對應的真菌種類，將所得到的ITS序列通過http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/ 網站中的Blast功能進行相似性比對，由于真菌序列比對目前沒有明確判斷標準，所以采用16S rRNA序列比對標準，與某種系的代表參照序列相比，未知菌株序列的相似性≥98.6%，未知菌株 鑒定為該屬;如未知菌株序列相似性<98.6%，未知菌株不能鑒定為該種或屬[9]。

通過比對得到的數據顯示（圖2），在分離得到的139株紅樹植物內生真菌中，115株菌株序列相似性≥98.6%，可鑒定為其相對應的屬;而有24株菌株序列相似性<98.6%（表3），則說明未知菌株可能屬于其他種屬。

2.2.2 內生真菌ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育分析

將上述紅樹植物中分離的內生真菌的ITS序列構建成系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），確定內生真菌的分類地位。從圖3中可以看到，構建出的系統(tǒng)發(fā)育樹主要分為2個支系，其中一個較小的支系以青霉屬、曲霉屬為主，另一個大支系包括了其余的大部分菌株。從圖3中的bootstrap值可以看出，分離的內生真菌菌株中有許多親緣關系十分接近，隸屬于相同種屬。

3 結論

本試驗研究了福建泉州和漳州的紅樹植物秋茄、白骨壤、桐花樹的組織根、莖、葉中內生真菌的豐富性和多樣性。試驗共計分離出內生真菌139株，通過分子生物學的方法，將這些真菌鑒定到7綱15目17科32屬。其中秋茄48株18屬，白骨壤51株20屬，桐花樹40株18屬。在內生真菌多樣性和豐富性上，秋茄和白骨壤要大于桐花樹，這和繆莉在對分布于福建省南部沿海的主要紅樹植物內生真菌資源進行初步調查的結論相似[10]。分離得到的139株內生真菌中，青霉屬、芽枝孢屬、擬莖點霉屬、間座殼屬為優(yōu)勢菌屬，這點與徐瑩對福建省紅樹林區(qū)采樣后分離得到內生真菌的分析結果[11]及張艷等對廣西北部灣紅樹植物內生真菌多樣性的研究結果[12]有一定的相似性。

本試驗結果發(fā)現，不論是同種植物不同組織間比較還是3種紅樹植物的不同組織總數間比較，莖部分離出的內生真菌菌株數和菌株種屬數量都要高于根部和葉部。同樣地，孫劍秋等在對北方藥用植物內生真菌多樣性及生態(tài)分布調查時發(fā)現，6種藥用植物的枝條內生真菌定殖率和分離率明顯高于葉片[13];高劍對高橋和東寨港紅樹林中3種常見樹種進行紅樹林內生真菌多樣性及生態(tài)分布的研究中指出，3種紅樹枝條中內生真菌的豐富性和多樣性要高于根部和葉部，而根部和葉部中內生真菌的多樣性和豐富性沒有顯著差異[14]。造成這種差異的原因可能是植物不同組織結構所含有的營養(yǎng)物質不完全相同，以及不同組織生長周期上存在差異，對內生真菌的侵染和分布造成了影響。

本試驗數據體現不同地理位置對紅樹植物內生真菌的多樣性有所影響?？傮w上看，采自漳州的紅樹林植物中的內生真菌群落的豐富性要高于采自泉州的同種紅樹林植物。推測是因為同種紅樹植物所處在不同生境中，其氣候、土壤等多種條件不相同，導致了內生真菌的多樣性也不相同，有待后續(xù)對不同土壤等影響開展進一步研究。本試驗初步證明了福建省紅樹植物秋茄、白骨壤、桐花樹中所含的內生真菌資源的豐富性與多樣性，并對內生真菌資源的進一步利用提供了可靠的數據支持，對其開發(fā)起到了一定作用。

參考文獻：

[1]? 但新球，廖寶文，吳照柏，等.中國紅樹林濕地資源、保護現狀和主要威脅[J].生態(tài)環(huán)境學報，2016，25（7）：1237-1243

[2] Sarma VV，Vittal BPR. Biodiversity of mangrove fungi on different substrata of Rhizophora apiculata and Avicennia spp.from Godavari and Krishna deltas，east coast of India[J].Fungal Diverdity，2000（5）：23-41

[3]鄧祖軍，曹理想，周世寧.紅樹林內生真菌的分離及代謝產物生物活性的初步研究[J].中山大學學報：自然科學版，2010，49（2）：100-104

[4]鄧祖軍，曹理想，楊國武，等.從紅樹林內生真菌篩選重組人DNA拓撲異構酶Ⅰ抑制劑的研究[J].海洋通報，2009，28（5）：91-96

[5]肖勝藍，雷曉凌，佘志剛，等.廣西山口8種紅樹林內生真菌的分離鑒定及抗菌活性菌株的篩選[J].熱帶作物學報，2011，32（12）：2259-2263

[6]龍寒，向偉，莊鐵城，等.紅樹林區(qū)微生物資源[J].生態(tài)學雜志，2005（6）：696-702

[7] Liu AR，Xu T，Guo LD. Molecular and morphological description of Pestalotiopsis hainanensis sp.nov.，a new endophyte from a tropical region of China [J]. Fung Diver，2007，24：23-36

[8]張偉錚，關文苑，李松，等.ITS序列分析與MALDI-TOF MS質譜技術在絲狀真菌鑒定中的應用[J].菌物學報，2019，38（8）：1298-1305

[9]耿佳靖，袁梁，魯辛辛.18S rRNA基因序列分析在臨床常見酵母樣真菌鑒定中的應用[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2009（6）：644-648

[10]繆莉.紅樹植物內生真菌抗菌抗腫瘤活性物質的初步研究[D].廈門：廈門大學，2002

[11]徐瑩.紅樹真菌的生物活性以及去乙酰真菌環(huán)氧乙酯的發(fā)酵和理化性質的研究[D].廈門：廈門大學，2009

[12]張艷，藍桃菊，廖仕同，等.廣西北部灣紅樹植物內生真菌多樣性[J].微生物學通報，2017，44（4）：783-794

[13]孫劍秋，郭良棟，臧威，等.藥用植物內生真菌多樣性及生態(tài)分布[J].中國科學（C輯：生命科學），2008（5）：475-484

[14]高劍.內生真菌多樣性及其生態(tài)分布[D].湛江：廣東海洋大學，2013837341F5-7F5A-42C1-A2C7-DB01FB127365