李孝龍 李玲玲

摘要：糖類分子在許多生理和病理過程中作為識別決定因素發(fā)揮著關(guān)鍵作用。由于糖類分子普遍存在順式二醇結(jié)構(gòu)，因此利用基于硼酸的親和材料用于選擇性分離和富集含順式二醇的生物分子，近年來越來越受到關(guān)注。本文綜述了影響硼酸鹽親和材料性能的主要因素、新型硼酸鹽親和材料的性能改進、基于硼酸的熒光糖傳感器，并討論了硼酸鹽親和材料在唾液酸診斷方面的進展。

關(guān)鍵詞：糖類、硼酸、硼酸鹽親和材料、唾液酸

1 簡介

糖類（碳水化合物）在自然界中無處不在，從簡單的單糖、雙糖到由數(shù)個、十、百、甚至數(shù)千、數(shù)萬個單糖組成的復(fù)雜多糖、聚糖，這些糖分子具有各式各樣的結(jié)構(gòu)，發(fā)揮了各種各樣的作用。例如，用于維持細胞正常生理功能的血糖;作為遺傳信息RNA和DNA骨架成分的五元核糖、五元脫氧核糖;用于治療各種細菌感染的一類抗生素氨基糖苷，是氨基修飾糖;而多糖、聚糖通常作為許多生理和病理過程的識別決定因素和調(diào)節(jié)劑發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括細胞信號、細胞生長、細胞分化和腫瘤發(fā)生等[1]。

2 硼酸鹽親和材料

糖類中普遍存在順式-1，2-和-1，3-二醇結(jié)構(gòu)，都可被硼酸可逆的結(jié)合，此思路常被用于設(shè)計和實現(xiàn)多種糖類的生物傳感器。此外，含順式二醇的糖類分子在生物系統(tǒng)中常以低豐度存在，通常伴有高豐度的其它干擾組分。因此，硼酸鹽親和材料，可選擇性分離和富集含順式二醇的生物分子，近年來越來越受到關(guān)注。

2.1影響硼酸鹽親和材料結(jié)合特性的關(guān)鍵因素

影響硼酸鹽親和材料對目標分子的識別、分離的關(guān)鍵因素有結(jié)合pH值、親和性、選擇性[2]。

2.1.1結(jié)合pH值

雖然硼酸及其衍生物的總數(shù)超過1500種，但適用于硼酸鹽親和材料的只有少數(shù)，其中3-氨基苯基硼酸（APBA， pKa = 8.8）和4-乙烯基苯基硼酸 （VPBA， pKa = 8.2）的使用最廣泛。傳統(tǒng)的硼酸親和材料只能在堿性pH下正常工作。而血液、淚液、尿液、唾液等常見生物樣品的pH值范圍為4.5～8.0，應(yīng)用于這類樣品時需要調(diào)整樣品溶液為堿性pH，這不僅帶來不便，還有不穩(wěn)定的生物分子降解的風險。

2.1.2 親和力

與目標分子的結(jié)合常數(shù)，決定了親和材料可有效捕獲的樣品中目標分子的最低濃度。硼酸與糖或糖蛋白之間的解離常數(shù)Kd范圍為10-1至10-3 M。由于含順式二醇的生物分子的濃度通常較低，傳統(tǒng)的硼酸鹽親和材料有效捕獲它們較為困難。

2.1.3選擇性

使用傳統(tǒng)硼酸鹽親和材料，在良好選擇性的捕獲目標糖蛋白方面尤其具有挑戰(zhàn)性。一個主要原因是在傳統(tǒng)硼酸鹽親和材料的設(shè)計和應(yīng)用中，很難考慮到控制選擇性的多種力的協(xié)同作用。為了使親和材料具有良好的選擇性，對各種力的共同作用的充分理解是必不可少的。

為了解決上述關(guān)鍵問題，人們設(shè)計、制備了一系列新型硼酸鹽親和材料，從而實現(xiàn)了生物樣品有效捕獲的實際應(yīng)用，具有很好的前景。

2.2 新型硼酸鹽親和材料

2.2.1 低結(jié)合pH的硼酸鹽親和材料

四種類型的硼酸可以提供低結(jié)合pH值，包括：（I）苯環(huán)上帶有吸電子基團的苯基硼酸，如磺?；⒎汪驶?。攜帶吸電子基團的硼酸具有增加的酸度和降低的pKa值，硼酸配體的pKa值越低，其結(jié)合pH值越低，結(jié)合親和力越高。（II）含有分子內(nèi)四配位B?N或B?O鍵的硼酸（Wulff型）。Wulff型硼酸含有分子內(nèi)四配位B?N或B?O鍵，可促進四方硼酸鹽陰離子（sp3）的形成，sp3雜交狀態(tài)即使在中性或中度酸性條件下也保持穩(wěn)定，有利于硼酸鹽與順式二醇的酯化反應(yīng)。（III）含有分子內(nèi)三配位B?O鍵的硼酸（改良的Wulff型）。例如苯丙硼酸鹽是改良的Wulff型硼酸，它具有優(yōu)異的水溶性和更好的糖結(jié)合能力。（IV）雜環(huán)硼酸。雜環(huán)硼酸由于環(huán)中存在雜原子，表現(xiàn)出明顯低的結(jié)合pH值。例如3-吡啶基硼酸的pKa值為4.4，它允許在低至4.5的pH值下選擇性結(jié)合含順式二醇結(jié)構(gòu)的化合物，這樣的結(jié)合pH值能夠在不調(diào)整樣品pH值的情況下從尿液樣本中富集含有順式二醇的生物分子，例如核苷。

2.2.2 高親和力的硼酸鹽親和材料

對于某些硼酸配體，即使在最適pH值下，其對含順式二醇的生物分子的親和力仍然很低，因此親和力增強策略非常重要。通常地，利用多價結(jié)合策略，如使用樹枝狀硼酸功能化磁性納米粒子（MNP），能有效增強其與糖蛋白的結(jié)合。然而，對于只含有一個順式二醇的糖分子，如單糖和核苷，多價結(jié)合策略并不適用。因此，納米限制效應(yīng)作為一種親和力增強策略應(yīng)運而生。

通過對限制在硼酸鹽親和性介孔二氧化硅納米顆粒內(nèi)的分子相互作用進行定量研究，觀察到分子間的相互作用被限制和增強取決于被約束程度，在高限制條件下（1.5nm大小的糖蛋白RNase B限制在2.1nm硼酸鹽親和納米孔中），與非限制性條件相比，親和性增強了3個數(shù)量級。而在較少限制下（腺苷，一種只含一個順式二醇的小分子，限制在2.6nm的孔中），硼酸鹽親和力僅提高了7.5倍。這一發(fā)現(xiàn)意味著，當目標分子被限制在與其3D形狀互補的空間中時，納米限制效應(yīng)將最大限度地增強結(jié)合強度[3]。

將多價結(jié)合和納米限制效應(yīng)兩種策略聯(lián)合起來，納米限制親和材料應(yīng)運而生。納米限制親和材料依賴于多孔材料的限制效應(yīng)，為分子大小與孔徑相當?shù)牡鞍踪|(zhì)提供關(guān)鍵親和力，從而實現(xiàn)了高豐度血清蛋白質(zhì)的去除、手性分離和固定化酶反應(yīng)器等有前景的應(yīng)用。

2.2.3 良好選擇性的硼酸鹽親和材料

研究表明，硼酸鹽親和材料還可能發(fā)生多個次級相互作用，主要包括疏水作用、離子作用和氫鍵。因此，硼酸鹽親和材料獲得良好選擇性涉及兩個方面：一方面，強的硼酸鹽親和力相互作用是至關(guān)重要的，對于這一點，具有較高親和力和較低結(jié)合pH值的硼酸配體必不可少;同時，路易斯堿的參與可以增強親和力，從而提高選擇性。另一方面，應(yīng)該抑制不利的二次相互作用。

通過巧妙的設(shè)計，二次相互作用也可以成為有利因素，這使得硼酸鹽親和分離后的二次分離成為可能。利用氫鍵作用作為二次分離的主要驅(qū)動力，設(shè)計的高度親水性的硼酸鹽親和整體柱，使順式二醇化合物能夠在單個色譜柱中進行二維分離。第一個維度的分離是硼酸鹽親和分離，其中含有順式二醇的化合物在柱上被延遲，當延遲化合物用酸性溶液洗脫時，延遲部分中的組分根據(jù)它們與色譜柱的氫鍵作用進一步分離。

盡管結(jié)合性能大大提高的各類新型硼酸鹽親和材料已顯示出巨大的應(yīng)用前景，但它們?nèi)源嬖趦蓚€局限性：一是它們的類選擇性，使它們無法識別特定的含順式二醇的化合物。二是大多數(shù)材料的親和力仍然相對較差。因此，分子印跡自然成為一種有效的解決方案。

3 硼酸鹽親和分子印跡聚合物

分子印跡聚合物（MIPs）是在模板分子存在下通過聚合特定的功能單體后洗脫模板制備而得的高分子聚合物，是具有抗體樣結(jié)合特性或酶樣催化活性的重要功能材料，從傳感到分離再到催化都有廣泛的應(yīng)用。由于存在與模板分子高度互補的納米級印跡空腔結(jié)構(gòu)，MIPs對模板分子具有極好特異性和高親和力，這非常適用于在復(fù)雜樣品中對分析物的分子識別和分離。一般來說，有兩種分子印跡方法，Wulff提出的共價印跡和Mosbach提出的非共價印跡[2]。非共價印跡法在選擇功能單體和可能的模板分子方面更靈活;而且操作簡單，因為只需要混合功能單體和模板。然而，由于預(yù)聚復(fù)合物中存在平衡體系，非共價印跡可能產(chǎn)生一定的結(jié)合位點異質(zhì)性。相比之下，由于共價鍵更穩(wěn)定，共價印跡產(chǎn)生更均勻的結(jié)合位點分布。此外，在共價印跡中，模板分子結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)更清晰。由于硼酸的易開/關(guān)反應(yīng)性有利于模板的印跡和去除，因此硼酸已成為用于共價印跡含順式二醇化合物的功能單體。

自從Wulff及其同事首次報道基于硼酸鹽親和力的小分子印跡以來，已經(jīng)制備了許多針對單糖和核苷酸等小分子的MIPs。生物大分子，尤其是蛋白質(zhì)的印跡更具挑戰(zhàn)性。這是因為蛋白質(zhì)的大尺寸使其難以從高度交聯(lián)的聚合物網(wǎng)絡(luò)中去除，同時因為用于印跡的苛刻聚合條件導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象變化。為了克服這些問題，人們提出了許多印跡策略，包括表面印跡、表位印跡、Pickering乳液、金屬配位、分層印跡等。

4 熒光硼酸糖傳感器

1994年，Shinkai及其同事用蒽報告基團增強了硼酸結(jié)合基序，從而產(chǎn)生了第一個熒光（鄰-（氨基甲基）苯基）硼酸糖傳感器，它可逆地與二醇結(jié)合形成硼酸酯。光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機制似乎最有可能解釋觀察到的熒光變化，在沒有分析物的情況下，N-B相互作用很弱，氮上的孤對電子可用于淬滅熒光團的熒光，然而，在結(jié)合糖類后，硼的酸度增加，與胺的孤對電子產(chǎn)生更強的路易斯相互作用，降低其猝滅效應(yīng)并顯示出蒽的固有熒光[4]。雖然一直以來，對含有（鄰-（氨基甲基）苯基）硼酸糖傳感器中的熒光開啟機制缺乏完整和統(tǒng)一的解釋，但這并不影響研究人員們開發(fā)具有硼受體的碳水化合物傳感器。

5 硼酸鹽親和材料在唾液酸診斷方面的應(yīng)用

唾液酸是一類帶負電荷的，含9個碳原子骨架的，被稱為神經(jīng)氨酸的酸性氨基單糖N-或O-衍生物的總稱。主要包括N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Gc）和脫氨神經(jīng)氨酸（KDN）3種核心結(jié)構(gòu)。唾液酸廣泛分布于真核細胞表面糖蛋白或糖脂的寡糖鏈的最末端，是細胞膜上糖蛋白、糖脂的重要組成成分[5]。

唾液酸在多種癌癥中過度表達，是癌癥診斷中使用的重要生物標志物。因此，硼酸的二醇識別能力使硼酸鹽親和材料能夠用于檢測唾液酸類的癌癥生物標記物。通過對苯硼酸的不同共軛和摻入，Ouchi等人開發(fā)了4種基于角鯊烯和菁的熒光傳感器分子。這4種熒光傳感分子的側(cè)鏈烷基均可與N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）相互作用，但由于側(cè)鏈烷基長度不同，所以形成具有不同排放曲線的結(jié)構(gòu)不同的聚集體。臨床上，含有不同濃度（0.3、2.0、6.0和20.0 mM）N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）的尿液，代表了人類從健康到嚴重疾病的狀態(tài)，因此這4種熒光傳感器分子可被用來做判別分析[4]。這是Neu5Ac 選擇性化學(xué)傳感器的第一個例子，雖然該方法限制了一些實際應(yīng)用，但研究結(jié)果已經(jīng)顯示了硼酸鹽親和材料在基于唾液酸分析應(yīng)用于腫瘤領(lǐng)域分子診斷方面的的巨大前景。

6 總結(jié)

硼酸因其能夠可逆的結(jié)合二醇，已被用于各種不同硼酸鹽親和材料的制備。硼酸鹽親和材料在親和分離、代謝組學(xué)、疾病診斷等方面有著成功的應(yīng)用，隨著進一步的研究，硼酸鹽親和材料將有更廣泛的應(yīng)用前景。如近年來興起的、用于糖類檢測的化學(xué)傳感器的開發(fā)，將硼酸鹽親和材料與信號報告等其他理想材料相結(jié)合，是未來的一個重要發(fā)展方向。

參考文獻：

[1]Tommasone S ， Allabush F ， Tagger YK ， Norman J ， K?pf M ， Tucker JHR ， Mendes PM . The challenges of glycan recognition with natural and artificial receptors. Chem Soc Rev. 2019 Nov 11;48（22）：5488-5505.

[2]Li D， Chen Y， Liu Z. Boronate affinity materials for separation and molecular recognition： structure， properties and applications. Chem Soc Rev. 2015 Nov 21;44（22）：8097-123.

[3]Liu Z， He H. Synthesis and Applications of Boronate Affinity Materials： From Class Selectivity to Biomimetic Specificity. Acc Chem Res. 2017 Sep 19;50（9）：2185-2193.

[4]Williams GT， Kedge JL， Fossey JS. Molecular Boronic Acid-Based Saccharide Sensors. ACS Sens. 2021 Apr 23;6（4）：1508-1528.

基金項目：湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究計劃指導(dǎo)性項目（B2018421）。

作者簡介：李孝龍（2000-），男，湖北，武漢文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)專業(yè)本科在讀學(xué)生。

通訊作者：李玲玲（1982-），女，陜西，講師，碩士，研究方向：高分子材料。