趙曉軍，李智，吳曉亮，魏小軍

（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司液態(tài)奶事業(yè)部奶?？茖W(xué)研究院，呼和浩特 010010）

牛結(jié)節(jié)性皮膚病（LSD）是由牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒引起的牛全身性感染的疫病。2019年8月10日，牛結(jié)節(jié)性皮膚病首次在我國(guó)新疆伊犁哈薩克自治州確診[1]，2020年已經(jīng)在福建、浙江、廣東、安徽、江西等11個(gè)省市出現(xiàn)LSD感染病例。我國(guó)將LSD規(guī)定為二類疫病，一旦確診，對(duì)疫點(diǎn)內(nèi)的患病牛只進(jìn)行撲殺并無害化處理[2]。不同品種牛均容易感染LSDV，自然感染后潛伏期為1～4周[3]，嚴(yán)重危害牛的健康。LSD發(fā)病率2%～45%，死亡率低于10%，各種年齡的牛均易感，產(chǎn)奶量高的奶牛感染最嚴(yán)重[4,5]?；疾∨Ｖ惑w溫升高（40℃），伴有角膜炎、肺炎及流產(chǎn)[6～8]，皮膚結(jié)節(jié)可以持續(xù)數(shù)月，通過蚊蠅叮咬和接觸口鼻、痂皮排出的病毒互相傳播。同群?？梢酝ㄟ^污染的飼草料和水傳播該病[5]。發(fā)病牛只生產(chǎn)性能下降，產(chǎn)奶量降低30%～50%，對(duì)奶牛養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為分析使用山羊痘疫苗免疫奶牛的效果及副反應(yīng)情況，伊利奶?？茖W(xué)院自2020年起對(duì)近30萬頭奶牛進(jìn)行牛結(jié)節(jié)性皮膚病山羊痘疫苗的免疫，并將數(shù)據(jù)匯總分析，以期為國(guó)內(nèi)奶牛場(chǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 山羊痘疫苗

山羊痘疫苗，50頭份規(guī)格（羊免疫劑量），該疫苗為凍干粉，-15℃冷凍保存，有效期為24個(gè)月，采購(gòu)于國(guó)內(nèi)疫苗企業(yè)。

1.2 材料

生理鹽水、過敏搶救藥（腎上腺素）、一次性注射器（5mL1支，1mL若干）、蠟筆、75%酒精、脫脂棉、人員防護(hù)用品及垃圾箱等物資。

1.3 試驗(yàn)牛群

3月齡以上牛群。分布于內(nèi)蒙古、寧夏、河南、河北、黑龍江、遼寧、湖北、安徽、云南、四川、甘肅、陜西等地共計(jì)30余萬頭。

1.4 疫苗稀釋和抽取

用5mL0.9%生理鹽水稀釋疫苗，用1mL一次性注射器按0.3mL劑量進(jìn)行抽取，然后蓋上針頭整齊放入保溫箱內(nèi)（保溫箱內(nèi)置冰袋）。

1.5 免疫操作

用牛頸夾或免疫通道保定牛只。操作人員位于牛后安全位置，單手將牛尾舉至與水平線成45°，用酒精棉球?qū)ξ哺欛薏课幌?，在離尾根5cm左右處持注射器平行進(jìn)針，將0.3mL疫苗注入皮內(nèi)，深約1～2mm，形成一個(gè)直徑10mm的鼓包。

1.6 免疫副反應(yīng)

免疫后2h內(nèi)觀察免疫牛群有無過敏反應(yīng)，連續(xù)監(jiān)控體溫變化，監(jiān)控泌乳牛群的采食量和奶量變化。

1.7 免疫效果分析

選擇云南1座規(guī)模奶牛場(chǎng)，采用山羊痘疫苗進(jìn)行皮內(nèi)和皮下注射，在免疫前和免疫后7d、14d、30d各采集60頭泌乳牛血清，檢測(cè)抗體效價(jià)，采用LSD競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)陽(yáng)性為存在一定水平的抗體。

2 結(jié)果

2.1 免疫技術(shù)集成

通過小群試驗(yàn)，對(duì)免疫注射操作進(jìn)行反復(fù)試驗(yàn)，總結(jié)出0.3mL注射劑量，尾根皮內(nèi)注射的免疫技術(shù)。

2.1.1 免疫程序優(yōu)化

大群免疫：每年3～4月份免疫1次。3月齡以上牛群全部免疫，免疫劑量為（山羊5倍劑量）每頭牛0.3mL，尾根皺褶皮內(nèi)注射。

犢牛免疫：每月對(duì)達(dá)到3月齡未免疫的犢牛免疫1次，免疫劑量為（山羊5倍劑量）每頭牛0.3mL，尾根皺褶皮內(nèi)注射。

2.1.2 免疫操作標(biāo)準(zhǔn)化

3mL0.9%生理鹽水稀釋疫苗，用1mL一次性注射器抽取0.3mL/頭份，采取尾根皮內(nèi)注射，用酒精棉球?qū)ξ哺欛薏课幌?，?.3mL疫苗注入皮內(nèi)，每注射1頭記錄1頭耳號(hào)，并用蠟筆標(biāo)記防止漏免。發(fā)現(xiàn)過敏牛只，立即注射0.1%鹽酸腎上腺素5mL救治。

圖1 免疫操作標(biāo)準(zhǔn)化流程

2.2 免疫副反應(yīng)

筆者團(tuán)隊(duì)連續(xù)兩年監(jiān)測(cè)了30萬余頭牛山羊痘疫苗免疫情況，監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，該疫苗免疫副反應(yīng)較小，免疫期對(duì)產(chǎn)奶量影響比較小，平均單產(chǎn)下降0.25～0.5kg/d，持續(xù)時(shí)間約為3～5d；各牛群的采食量在免疫當(dāng)天下降較多，免疫后的其他時(shí)間段采食量下降不明顯。過敏率為0%～0.38%，過敏牛只采用注射0.1%鹽酸腎上腺素5～10mL進(jìn)行救治，未發(fā)生牛只過敏死亡的事件。

以云南一座規(guī)模化奶牛場(chǎng)為例，該奶牛場(chǎng)2020年6月25-27日進(jìn)行全群羊痘疫苗免疫，免疫頭數(shù)為1 050頭。免疫奶牛場(chǎng)無發(fā)病情況出現(xiàn)，免疫期牛只體溫?zé)o明顯變化（圖2），干物質(zhì)采食量下降幅度小，平均下降2.3%（圖3），該奶牛場(chǎng)未發(fā)生牛只過敏事件。

圖2 云南某規(guī)模奶牛場(chǎng)免疫前后奶牛體溫監(jiān)測(cè)

圖3 云南某規(guī)模奶牛場(chǎng)免疫前后牛群干物后采食量變化

對(duì)南方4座奶牛場(chǎng)免疫前后產(chǎn)奶量數(shù)據(jù)進(jìn)行監(jiān)控，奶量下降幅度2.5%（圖4），CQ、HY、SH、YH 4座奶牛場(chǎng)免疫頭數(shù)分別為4 240頭、2 784頭、3 775頭、5 270頭，均在2020年7月實(shí)施免疫。

圖4 南方4座奶牛場(chǎng)免疫前7天、免疫期間和免疫后7d日均產(chǎn)奶量

2.3 免疫效果分析

對(duì)云南某規(guī)模奶牛場(chǎng)60頭牛免疫后抗體水平監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，免疫后7d抗體水平未升高，免疫后14d抗體水平升高，免疫后30d抗體水平開始下降。其中皮下注射免疫后抗體水平上升較快，陽(yáng)性率為80%，但下降也較快，免疫后30d就下降到20%。皮內(nèi)注射免疫后抗體水平上升緩慢，免疫14d后和30d后的陽(yáng)性率均為53%。

圖5 云南某規(guī)模奶牛場(chǎng)皮內(nèi)和皮下兩種注射方法抗體的消減情況

3 討論

3.1 LSD的防控策略

LSD目前已在我國(guó)開始流行，結(jié)合LSD依靠蚊蠅、蜱蟲叮咬短距離傳播和牛只調(diào)運(yùn)長(zhǎng)距離傳播的特點(diǎn)，以及近幾年我國(guó)跨區(qū)域頻繁調(diào)運(yùn)牛只的現(xiàn)狀，短期內(nèi)LSD很難凈化，在今后很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)LSD防控將呈現(xiàn)常態(tài)化趨勢(shì)。對(duì)于任何疫病，我們都應(yīng)該遵循“防大于治”的原則，免疫預(yù)防是重要的措施，同時(shí)奶牛場(chǎng)應(yīng)堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，開展日常消毒和滅蚊蠅工作。

3.2 選用山羊痘疫苗免疫預(yù)防LSD的依據(jù)

目前國(guó)內(nèi)沒有LSD疫苗，因LSDV與山羊痘病毒同屬，有交叉保護(hù)性。國(guó)外通過免疫山羊痘疫苗成功控制了LSD，參照《牛結(jié)節(jié)性皮膚病防治技術(shù)規(guī)范》要求，對(duì)受疫情威脅區(qū)縣采用山羊痘疫苗免疫（按山羊5倍劑量）。國(guó)外有報(bào)道，接種已感染動(dòng)物的結(jié)節(jié)病弱毒疫苗可能會(huì)增加疫苗和毒株重組的風(fēng)險(xiǎn)[9]，對(duì)于我國(guó)開展LSD的防控造成一定的困難，從疫情傳播的速度和擴(kuò)散的區(qū)域看，不能排除長(zhǎng)距離運(yùn)輸和境外輸入導(dǎo)致的疫情傳播，僅僅實(shí)施綜合性防控措施很難控制LSD。目前無針對(duì)LSDV的同源疫苗，我們只能采用山羊痘疫苗開展免疫，且對(duì)有發(fā)病牛只存在的區(qū)域中其他健康群體實(shí)施免疫，該項(xiàng)措施是最有效的方法。

3.3 免疫程序

參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部下發(fā)的《牛結(jié)節(jié)性皮膚病防控技術(shù)規(guī)范》推薦的緊急免疫措施，使用山羊痘疫苗5倍劑量進(jìn)行免疫預(yù)防牛結(jié)節(jié)性皮膚病。從筆者團(tuán)隊(duì)對(duì)30萬余頭奶牛免疫的經(jīng)驗(yàn)看，應(yīng)用山羊痘疫苗免疫奶牛及肉牛，推薦的免疫程序?yàn)椋簩?duì)于3月齡以上牛群，每年在蚊蠅孳生的季節(jié)前進(jìn)行免疫，1年免疫1次，南方奶牛場(chǎng)選擇在3月份免疫，北方奶牛場(chǎng)可以選擇在4月份免疫。

3.4 免疫成功的關(guān)鍵點(diǎn)

使用山羊痘疫苗進(jìn)行皮內(nèi)注射時(shí)，首選的部位是頸部。但是在實(shí)際操作過程中，由于注射的劑量小（0.3mL），在頸部皮內(nèi)注射對(duì)牛只造成的應(yīng)激大，同時(shí)操作人員很難判斷是否注射到皮內(nèi)。在牛頭擺動(dòng)時(shí)，很難將疫苗注射到皮內(nèi)，容易注射到皮下或漏免，很難保證免疫效果，因此筆者建議在尾根皮內(nèi)注射。

經(jīng)過2年的LSD免疫管理經(jīng)驗(yàn)積累，筆者認(rèn)為免疫成功的關(guān)鍵點(diǎn)有以下3點(diǎn)：第一，疫苗稀釋劑量和抽取的劑量應(yīng)準(zhǔn)確，以50頭份的疫苗為例，用5mL注射器抽取3mL生理鹽水，注射到疫苗瓶中，充分搖勻，使其充分溶解后，用1mL一次性注射器按0.3mL劑量進(jìn)行抽?。ㄅ趴兆⑸淦鲀?nèi)的氣泡）。避免因增加稀釋的生理鹽水而降低有效抗原量，避免注射器中有氣泡而導(dǎo)致免疫劑量不準(zhǔn)確。第二，正確的皮內(nèi)注射操作是免疫成功的重要因素，操作人員必須熟練掌握皮內(nèi)操作的技術(shù)，將疫苗準(zhǔn)確注入到真皮層內(nèi)。第三，免疫劑量合理且準(zhǔn)確，筆者通過在奶牛場(chǎng)反復(fù)試驗(yàn)，認(rèn)為免疫0.3mL的疫苗劑量既可以保證免疫到皮內(nèi)足夠的抗原，又能保證免疫操作人員在向皮內(nèi)注射疫苗時(shí)阻力小，比較順利地注射到皮內(nèi)且減少牛只應(yīng)激。

3.5 免疫抗體效價(jià)低

通過抽檢免疫后部分牛只抗體效價(jià)，發(fā)現(xiàn)免疫后30d抗體陽(yáng)性率較低，可能與山羊痘疫苗免疫主要產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)有關(guān)，僅產(chǎn)生低水平的中和抗體[10]，由于缺少攻毒保護(hù)試驗(yàn)和中和抗體監(jiān)測(cè)的數(shù)據(jù)，未能準(zhǔn)確制定動(dòng)態(tài)免疫程序。國(guó)外最近的研究和疫情防控中獲得的數(shù)據(jù)、經(jīng)驗(yàn)表明，弱毒羊痘疫苗對(duì)LSDV野毒株提供部分交叉保護(hù)[11,12]。在試驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)皮下注射產(chǎn)生抗體水平高，免疫后14d抗體陽(yáng)性率較皮內(nèi)注射時(shí)高，但是抗體水平下降較快。所以免疫時(shí)，如果操作不正確誤注射到皮下時(shí)，也可以產(chǎn)生抗體，但是由于對(duì)每頭奶牛的免疫劑量小，產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫是否能產(chǎn)生同皮內(nèi)注射相同的效果，仍需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。

4 總結(jié)

天氣漸暖，蚊蠅開始孳生，為L(zhǎng)SDV傳播創(chuàng)造了條件，同時(shí)夏季是發(fā)病高峰。提前開展免疫預(yù)防LSD，保證在夏季牛群免疫保護(hù)水平維持在高點(diǎn)，可以降低發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。另外必須保證免疫方法正確，皮內(nèi)注射是保證免疫效果的前提，因?yàn)槠?nèi)注射疫苗吸收慢，但是抗原反應(yīng)強(qiáng)，免疫前應(yīng)對(duì)免疫注射人員進(jìn)行培訓(xùn)，以掌握正確的操作方法保證免疫質(zhì)量。