張鵬，高敏，馮斐斐，李夢圓，劉金燕，黃玲玲

0 引言

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,LncRNA）是廣泛存在于哺乳動物細胞中的一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的非編碼RNA分子[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)LncRNAs參與調(diào)控細胞的多個階段，影響著癌癥的發(fā)生發(fā)展[2]，包括腫瘤轉(zhuǎn)移[3]。此外越來越多研究探討血清LncRNAs作為腫瘤生物標志物的價值[4-5]，但其在肺癌骨轉(zhuǎn)移（lung cancer with bone metastasis,LCWBM）診斷中的作用仍未見報道。

本研究通過文獻查閱，篩選出與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的4種LncRNAs。HOTAIR是Homebox C基因位點表達產(chǎn)物，以反式沉默的方式發(fā)揮作用。研究顯示HOTAIR與人類同源盒基因和癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，參與多種癌癥進展，可作為預(yù)后不良的標志物[6]。HOTTIP是HOXA基因遠端轉(zhuǎn)錄生成的一類LncRNA，已有文獻顯示HOTTIP可促進常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，抑制癌細胞的凋亡，其高表達與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和總體生存時間密切相關(guān)[7]。CRNDE是結(jié)直腸癌差異表達的LncRNA，在許多癌組織和癌細胞中表達出現(xiàn)異常，與疾病分期、遠處轉(zhuǎn)移、病理類型及生存狀態(tài)明顯相關(guān)[8]。AFAP1-AS1是新發(fā)現(xiàn)的一種LncRNA，近年研究發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1與惡性腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[9]。本研究檢測HOTAIR、HOTTIP、CRNDE、AFAP1-AS1這4種血清LncRNAs在LCWBM和未發(fā)生骨轉(zhuǎn)移肺癌（lung cancer without bone metastasis,LCWOBM）患者中的表達水平，并分析其對LCWBM的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2016年1月—2018年8月河南省腫瘤醫(yī)院LCWBM和LCWOBM患者各38例。肺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移均經(jīng)核素骨掃描或PET掃描確診。LCWOBM肺癌未發(fā)生骨轉(zhuǎn)移患者為原發(fā)肺癌患者，未發(fā)生其他任何轉(zhuǎn)移。所有患者都為未經(jīng)化療、放療或免疫治療的新發(fā)病例。兩組研究對象均排除肝功能（包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶）異常和腎功能不全（腎小球濾過率≤60 ml/min）的患者，排除妊娠、腦血管疾病等合并癥的患者。該研究經(jīng)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

LCWBM組平均年齡為63.92±8.70歲，LCWOBM組平均年齡為57.06±11.44歲，兩組患者年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-1.79,P=0.08）。LCWBM患者中男14例、女24例，肺鱗癌15例，肺腺癌23例。LCWOBM患者中男性21例、女性17例，肺鱗癌13例，肺腺癌25例，兩組患者性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.56,P=0.11)。兩組肺癌的病理類型比較，差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.23,P=0.63）。

1.2 血液采集與血清制備

采用EDTA抗凝真空采血管采集LCWBM和LCWOBM患者晨起空腹靜脈血5 ml，全血離體6 h內(nèi)進行血清分離。將采血管3000 r/min離心10 min，收集上清液；之后將上清液12000 r/min再次離心10 min，收集血清，放于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑和設(shè)備

TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和熒光定量試劑盒TB Green?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）均來自日本Takara公司。PCR儀器使用Illumina公司的PCRmax Eco 48實時熒光定量PCR儀。由尚亞公司合成的GAPDH為內(nèi)參，LncRNA HOTAIR、HOTTIP、CRNDE和AFAP1-AS1的引物由銳博生物公司設(shè)計合成，見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primers sequences for qRT-PCR

1.4 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR實驗

采用TRIzol試劑從血清樣本中提取總RNA，Thermo Scientific NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測RNA濃度和純度。將RNA濃度調(diào)整至200～300 ng/μl。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量PCR試劑盒TB Green?Premix Ex Taq?檢測LncRNA HOTAIR、HOTTIP、CRNDE、AFAP1-AS1的表達水平。在冰上配制25 μl反應(yīng)體系：cDNA 2 μl，上、下游引物各1.0 μl，SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5 μl，dH2O 8.5 μl。實時定量PCR反應(yīng)條件：首先95℃ 30 s預(yù)變性，其次95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)，最后繪制熔化曲線。采用2-??Ct法計算LncRNA在肺癌骨轉(zhuǎn)移患者血清中表達量相對于未發(fā)生骨轉(zhuǎn)移肺癌患者血清中表達量的倍數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料比較采用卡方檢驗，不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（M）和四分位數(shù)間距（P25,P75）表示，非正態(tài)分布的計量資料兩組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗。采用MedCalc醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件15.2繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristics curve,ROC），計算曲線下面積（area under curve,AUC），得出敏感度、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。敏感度（試驗正確檢出陽性患者的率）=真陽性人數(shù)/（真陽性人數(shù)+假陰性人數(shù)）×100%。特異性（試驗正確檢出陰性患者的率）=真陰性人數(shù)/（真陰性人數(shù)+假陽性人數(shù)）×100%。陽性預(yù)測值（試驗檢出真陽性數(shù)在試驗方法檢出總陽性數(shù)中的比例）=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%；陰性預(yù)測值（試驗檢出真陰性數(shù)在試驗方法檢出總陰性數(shù)中的比例）=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%。采用二分類Logistic回歸分析兩個血清LncRNA診斷肺癌骨轉(zhuǎn)移的效果。檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 LCWBM和LCWOBM患者血清中4種LncRNA的表達水平比較

LCWBM患者血清中HOTAIR的表達水平明顯低于LCWOBM患者（P<0.05），LCWBM患者血清中HOTTIP的表達水平明顯高于LCWOBM患者（P<0.05），血清CRNDE、AFAP1-AS1表達水平在LCWBM組和LCWOBM組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

表2 LCWBM和LCWOBM患者血清中四種LncRNA的表達水平比較Table 2 Comparison of four serum LncRNA levels between LCWBM group and LCWOBM group

2.2 年齡、性別、病理類型和血清4種LncRNA表達量的關(guān)系

根據(jù)LCWBM患者年齡中位數(shù)（58歲）將兩組患者分為兩個部分。年齡分層后，LCWBM組<58歲的低年齡層患者血清HOTTIP表達水平顯著高于LCWOBM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其余3種血清LncRNAs在兩組患者不同年齡層的表達量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表3。

表3 LCWBM和LCWOBM組年齡與血清中4種lncRNA表達量的關(guān)系Table 3 Association between age and four serum lncRNA levels in LCWBM and LCWOBM groups

性別和病理類型分層結(jié)果顯示：性別分層后，LCWBM組女性患者血清HOTAIR表達量明顯低于LCWOBM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；LCWBM組肺腺癌患者血清HOTTIP表達水平明顯高于LCWOBM組肺腺癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其余3種血清LncRNAs在兩組患者不同性別、不同病理類型分層的表達量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表4～5。

表4 LCWBM和LCWOBM組性別與血清中4種LncRNA表達量的關(guān)系Table 4 Association between gender and four serum LncRNA levels in LCWBM and LCWOBM groups

表5 LCWBM和LCWOBM組病理類型與血清中4種LncRNA表達量的關(guān)系Table 5 Association between pathological types and four serum LncRNA levels in LCWBM and LCWOBM groups

2.3 ROC曲線分析

采用ROC曲線評估四種血清LncRNAs對LCWBM的診斷價值，結(jié)果顯示：血清HOTAIR診斷LCWBM的ROC曲線下面積（AUC）為0.722（95%CI:0.562～0.849）；敏感度和特異性分別為70.0%和81.3%，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值為53.8%和89.7%。血清HOTTIP診斷LCWBM的ROC曲線下面積為0.784（95%CI:0.538～0.936）；敏感度和特異性分別為100.0%和45.5%，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值為57.1%和100.0%。血清CRNDE和AFAP1-AS1的ROC曲線下面積分別為0.630和0.558。血清HOTAIR和HOTTIP對LCWBM的診斷效力較好（P=0.027,P=0.008），血清CRNDE和AFAP1-AS1對LCWBM診斷效力較差（P=0.345,P=0.658）。

由于血清HOTAIR和HOTTIP表達水平在兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，將血清HOTAIR和HOTTIP聯(lián)合，分析其聯(lián)合診斷LCWBM的效果，結(jié)果顯示ROC曲線下面積為0.818（95%CI:0.577～0.955）（P=0.002）；敏感度和特異性為87.5%和72.7%，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值為70.0%和88.9%，見圖1。

3 討論

HOTAIR能夠調(diào)控其靶基因參與多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。研究報道非小細胞肺癌患者血清中HOTAIR水平明顯高于健康對照者[10]；食管鱗癌患者血清中HOTAIR的表達水平亦明顯高于健康對照者，采用血清HOTAIR診斷食管鱗癌的ROC曲線下面積為0.793，提示其可能可以作為診斷食管鱗癌的潛在生物標志物[11]。本研究結(jié)果顯示LCWBM患者血清HOTAIR表達水平明顯低于LCWOBM患者，性別分層后發(fā)現(xiàn)，女性LCWBM組患者血清HOTAIR表達量明顯低于LCWOBM組女性患者，分析其原因，可能是兩組研究對象均為肺癌患者，只是發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的情況不同，而之前報道的研究對象是癌癥患者和健康人群；此外LCWBM患者血液中免疫細胞可能因腫瘤細胞的攻擊而受到抑制，導(dǎo)致其分泌入血的HOTAIR減少，且在女性患者中更為明顯。本研究血清HOTAIR診斷LCWBM的ROC曲線下面積（AUC）為0.722，敏感度和特異性分別為70.0%和81.3%，曲線下面積大于0.7，敏感度和特異性均較高，提示其診斷效力較好。

HOTTIP可以通過廣泛的結(jié)構(gòu)域激活組蛋白H3賴氨酸27三甲基化（H3K4me3）轉(zhuǎn)錄，提示HOTTIP在協(xié)調(diào)和激活HOXA簇基因中發(fā)揮著重要作用。HOTTIP通過結(jié)合WD-repeat-containing protein 5（WDR5），增加β-catenin基因表達水平，增強成骨分化，最終激活下游Wnt/catenin信號通路，因此HOTTIP可以促進骨肉瘤細胞的生長和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]。HOTTIP在大多數(shù)癌癥中過表達[13]，HOTTIP可能通過靶向調(diào)控miR-516b-5p/SPIN1參與食管癌凋亡、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸[14]。胃癌患者血清外泌體HOTTIP表達明顯升高，且與順鉑化療耐藥有關(guān)[15]。本研究中，LCWBM組患者血清HOTTIP表達顯著上調(diào)，特別是在LCWBM組<58歲的低年齡層和肺腺癌患者中，血清HOTTIP表達量均明顯高于LCWOBM組相應(yīng)亞型組，說明在<58歲且肺癌病理類型為肺腺癌的患者中判斷其是否可能發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，應(yīng)重點考慮該指標。血清HOTTIP診斷LCWBM的ROC曲線下面積（AUC）為0.784，敏感度和特異性分別為100.0%和45.5%。結(jié)果表明血清HOTTIP對肺癌骨轉(zhuǎn)移有較好的診斷潛力，但特異性較低，即血清HOTTIP把實際沒有發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的肺癌患者正確判斷為未發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的能力較低，最終可能導(dǎo)致假陽性增多。然而將血清HOTAIR與HOTTIP兩指標聯(lián)合，其聯(lián)合診斷肺癌骨轉(zhuǎn)移的ROC曲線下面積為0.818，敏感度和特異性分別為87.5%和72.7%，顯示兩指標聯(lián)合診斷效果要明顯優(yōu)于單一指標的診斷效果，即聯(lián)合血清HOTAIR與HOTTIP有助于提高診斷LCWBM的效力。

血清外泌體CRNDE水平在胰腺導(dǎo)管內(nèi)黏液腺瘤（IPMN）患者和惡性程度較高的胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）患者中顯著高于健康對照，且其在PDAC患者血清中表達水平高于IPMN患者，提示血清CRNDE表達水平與胰腺癌惡性程度有關(guān)[15]。AFAP1-AS1可通過介導(dǎo)miR-423-5p調(diào)節(jié)Rho/Rac信號通路，促進鼻咽癌細胞的遷移和侵襲；裸鼠轉(zhuǎn)染AFAP1-AS1后鼻咽癌細胞的肺轉(zhuǎn)移率明顯高于對照組[16]。本研究中，血清CRNDE和AFAP1-AS1表達水平在兩組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），且對LCWBM診斷效力較低（0.50.05），尚不能作為診斷LCWBM的生物標志物。

本研究探討了血清LncRNA HOTAIR、HOTTIP、CRNDE、AFAP1-AS1對LCWBM的診斷價值。血清檢測因其無創(chuàng)、方便、可重復(fù)性等特點，更適合作為生物標志物[17]。本研究也存在一些局限：首先，樣本數(shù)量較少；其次，除了年齡、性別和病理類型，未收集患者的其他基本信息，無法深層次探討肺癌骨轉(zhuǎn)移患者臨床特征與血清LncRNAs表達的關(guān)系。今后，將擴大樣本量，進一步驗證血清LncRNA HOTAIR、HOTTIP在肺癌骨轉(zhuǎn)移診斷中的價值，并探索其生物學(xué)效應(yīng)，揭示其內(nèi)在的分子機制。

綜上所述，血清HOTAIR和HOTTIP對肺癌骨轉(zhuǎn)移有一定的診斷價值，兩者聯(lián)合診斷效果優(yōu)于單一指標，可能成為診斷肺癌骨轉(zhuǎn)移的新的生物標志物，為肺癌骨轉(zhuǎn)移臨床診斷提供新的思路。