鄭建洲，白煜，戚春建

0 引言

在非小細胞肺癌（NSCLC）中，肺鱗狀細胞癌（LUSC）是第二大常見的肺癌類型，占NSCLC的30%，吸煙患者占90%[1]。最新的分子病理學檢測和靶向治療能夠顯著延長肺腺癌患者的總生存。目前還沒有特異生物標志物或靶向藥物，可用于早期檢測或治療LUSC患者。許多研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA）作為重要的生物學和基因調節(jié)因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，人們嘗試以lncRNA作為疾病特異生物標志物或治療靶點。

胎兒致死非編碼發(fā)育調節(jié)RNA（feta llethal non-coding developmental regulatory RNA,FENDRR）是一種新的lncRNA，研究表明它在骨肉瘤、乳腺癌、胃癌、非小細胞肺癌等多種腫瘤中異常表達[2-5]。Li等[3]研究發(fā)現(xiàn)FENDRR在乳腺癌細胞系和癌組織中的表達低于相鄰正常組織，過表達FENDRR能抑制乳腺癌細胞增殖，促進細胞凋亡。最近，多個全基因測序結果研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA FENDRR在肺腺癌細胞中低表達[5-7]。對TNMⅠ期肺腺癌組織和鄰近癌旁組織的RNA測序結果顯示，肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA FENDRR的表達明顯降低[7]，另一項研究對肺腺癌組織和鄰近肺正常組織的差異轉錄組分析，也證實肺腺癌中FENDRR明顯下降[5]。Zhang等[8]進一步研究表明，F(xiàn)ENDRR能夠通過海綿吸附miR-761，釋放金屬蛋白酶組織抑制劑2（TIMP2）的抑癌功能，降低肺腺癌細胞的侵襲能力。然而，F(xiàn)ENDRR在肺鱗狀細胞癌中的生物學和機制方面的研究知之甚少。因此，本研究分析lncRNA FENDRR對肺鱗癌H226細胞進展進程的影響，探討FENDRR影響肺鱗癌H226細胞發(fā)生發(fā)展的潛在機制，為治療肺鱗癌提供新的臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

正常肺上皮細胞BEAS-2B 購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫，肺腺癌細胞（A549、NCI-H1299）、肺鱗癌細胞（NCI-H226）購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫；胎牛血清（四季青公司）、RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；Lipofectamine 2000、RNA提取試劑（美國Invitrogen公司）；lncRNA FENDRR小干擾RNA（FENDRR-siRNA）及其陰性對照（FENDRR-siNC）（上海吉瑪公司）；Realtime PCR引物（上海捷瑞公司）；CCK-8試劑盒、結晶紫染色液（上海碧云天生物公司）；Matrigel、Transwell板（美國Corning公司）；絲裂原活化蛋白激酶（MEK）、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶（p-MEK）、細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK）、磷酸化細胞外調節(jié)蛋白激酶（p-ERK）和β-actin單克隆抗體（美國CST公司）、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（英國Abcam公司）；反轉錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒（南京Vazyme公司）；酶標儀（英國BioTek公司）；Real-time PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；熒光顯微鏡（美國Alpha公司）；流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 非小細胞肺癌A549、NCI-H1299、NCI-H226細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，正常肺上皮細胞BEAS-2B用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液，3～5天用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細胞轉染及分組 取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)消化后，接種至6孔板或96孔板，過夜待細胞生長密度約50%～60%時，將Lipofectamine2000與FENDRR-siRNA或FENDRR-siNC混合，室溫孵育20 min后轉染細胞。轉染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 RNA提取和實時定量聚合酶鏈式反應檢測 收集的細胞加入1 ml TRIzol試劑，充分混勻，用氯仿抽提總RNA，酶標儀測定RNA純度和濃度。按照反轉錄試劑盒說明書配制第一鏈cDNA混合液（5×HiScriptⅡqRT SuperMix 4 μl、RNA模板2 μl、去離子水補齊至20 μl）合成cDNA，反應程序：50℃ 15 min；85℃ 5 s。cDNA為模板配制qRTPCR混合液（2×AceQ qPCR SYBR Green 10 μl、正向引物和反向引物各1 μl、cDNA 1 μl、去離子水補齊至20 μl）進行qRT-PCR檢測，反應程序：95℃5 min；95℃ 15 s；60℃ 30 s，共40個循環(huán)。引物序列：lncRNA FENDRR:F:5’-GAGCACATGATG GCACAATAG-3’，R:5’-CCAACAGATATTCGCA GTCC-3’；GAPDH:F:5’-AGAGGCAGGGATGAT GTTCTG-3’，R:5’-GACTCATGACCACAGTCCAT GC-3’。轉染效率用2-ΔΔCT計算。

1.2.4 Western blot檢測MEK、p-MEK、ERK、p-ERK蛋白表達 轉染48 h后收集細胞，加入0.2 ml RIPA細胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12000 r/min離心15 min取上清液。BCA法測定上清蛋白含量，加入5×上樣緩沖液混勻，100℃煮沸5 min，-20℃保存?zhèn)溆?。樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，PBST洗滌3次、5 分鐘/次，分別加入一抗MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、β-actin（1:1000），4℃孵育過夜，PBST洗滌3次、5分鐘/次，加入二抗（1:5000），室溫孵育1.5～2 h，PBST洗滌3次、10分鐘/次，于暗室掃描拍照。采用Image-pro plus軟件分析各條帶灰度值，與內參β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達量。

1.2.5 CCK-8法測定細胞活力 取對數(shù)生長期的細胞，用含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調整濃度至每毫升3×104個，每孔100 μl的量接種至96孔板，每組3個重復，過夜后進行轉染，分別在24、48和96 h加入每孔10 μl的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標儀測定450 nm處吸光度（A），細胞活力（%）=A實驗組/A對照組×100%。

1.2.6 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 遷移：轉染48 h后收集的各組細胞用無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調整濃度至每毫升2×105個，Transwell小室置于24孔板，加入100 μl細胞懸液，下室加入600 μl含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h取出小室，棉簽擦去上層小室細胞，甲醇固定30 min，結晶紫染色20 min后，顯微鏡觀察。隨機選取5個視野進行計數(shù)。侵襲：轉染48 h后收集的各組細胞用無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調整濃度至每毫升2×105個，4℃過夜的Matrigel膠與無血清培養(yǎng)基1:20混合，加至Transwell小室，37℃、1 h后吸掉剩余液體，加入200 μl細胞懸液，下室加入600 μl含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h取出小室，棉簽擦去上層基質膠和小室細胞，后續(xù)操作與遷移實驗一致。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 轉染48 h后收集各組細胞，用PBS洗滌2次，4℃、1000 r/min離心5 min取沉淀，1×Annexin V-FITC結合液重懸細胞。分別加入Annexin V-FITC抗體5 μl和PI（100 mg/ml）2 μl，室溫避光15 min。加入400 μl PBS，流式細胞術檢測細胞凋亡情況。使用擬合軟件Flow J分析細胞凋亡，凋亡率為早期凋亡率和晚期凋亡率的總和。

1.2.8 生物信息學分析工具 利用RNAInter數(shù)據(jù)庫（http://www.rnainter.org/）篩選出與FENDRR相互作用的基因，DAVID數(shù)據(jù)庫在線分析工具（https://david.ncifcrf.gov/）用于互作基因的KEGG信號通路富集分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均以（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。每個實驗組設置3個重復，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA FENDRR在非小細胞肺癌細胞中的表達

qRT-PCR結果顯示，與正常肺上皮細胞BEAS-2B相比，肺腺癌細胞A549、H1299、肺鱗癌細胞H226中FENDRR相對表達量均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖1A。肺鱗癌細胞H226用于后續(xù)體外實驗。與陰性對照組相比，沉默H226細胞中FENDRR后，F(xiàn)ENDRR-siRNA組中FENDRR相對表達量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖1B。

2.2 下調lncRNA FENDRR對肺鱗癌NCI-H226細胞增殖、凋亡的影響

C C K-8 結果顯示，與陰性對照組相比，F(xiàn)ENDRR-siRNA組在48、72 h下檢測OD值顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），表明下調FENDRR促進H226細胞增殖活力，見圖2A。與陰性對照組相比，F(xiàn)ENDRR-siRNA組H226細胞凋亡率明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖2B、C。

2.3 下調lncRNA FENDRR對肺鱗癌H226細胞遷移、侵襲的影響

Transwell小室結果顯示，與陰性對照組相比，F(xiàn)ENDRR-siRNA組中H226遷移細胞數(shù)顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），見圖3A，F(xiàn)ENDRR-siRNA組中H226侵襲細胞數(shù)顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），圖3B。

2.4 下調lncRNA FENDRR促進ERK/MAPK通路

Western blot結果顯示，與陰性對照組相比，F(xiàn)ENDRR-siRNA組中p-MEK、p-ERK蛋白表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖4。

2.5 抑制ERK對肺鱗癌H226細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

與FENDRR-siRNA組相比，F(xiàn)ENDR RsiRNA+5 μmol/L U0126組中H226細胞活力明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖5A，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05、P<0.01），見圖5B，凋亡的細胞比例顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖5C。

2.6 FENDRR相互作用的基因預測及富集分析

通過RNAInter工具篩選出2671個可能與FENDRR相互作用的基因，有2623個基因在DAVID數(shù)據(jù)庫中有信號通路信息。對這些基因進行KEGG富集分析顯示，主要富集于Metabolic pathways、Pathways in cancer、MAPK signaling pathway等，見表1。

表1 與FENDRR相互作用基因的KEGG通路富集分析結果Table 1 KEGG pathway enrichment analysis of the genes interacting with FENDRR

3 討論

長鏈非編碼RNA（lncRNA）并不具備編碼蛋白的潛力，但在許多疾病中存在異常表達[9-11]，提示lncRNA可能參與腫瘤發(fā)生、化療耐藥、纖維化和炎性疾病等發(fā)病過程。最近，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA FENDRR在多種腫瘤類型中出現(xiàn)異常表達[3-4]，尤其NSCLC[6,12]，并在腫瘤進展過程中扮演重要角色，展現(xiàn)出其作為新的分子生物標志物用于腫瘤診斷、預后和治療的潛力。

肺鱗狀細胞癌是肺癌中第二大常見的組織學亞型。與肺腺癌相比，其基因組異質性特征更為復雜，目前尚無特異性的驅動基因和靶向藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ENDRR在肺鱗癌H226細胞中的表達顯著下調，F(xiàn)ENDRR對肺鱗癌細胞的影響尚不明確。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ENDRR作為抑癌或促癌基因，通過多種機制對細胞功能和基因表達發(fā)揮重要的調節(jié)作用。Zhou等[13]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ENDRR在胃癌細胞Kato Ⅲ中高表達，其作為促癌基因，與富含絲氨酸/精氨酸剪接因子1（serine/arginine rich splicing factor 1,SRSF1）相互作用，從而釋放巨噬細胞刺激1受體（macrophage stimulating 1 receptor,MST1R）信號通路促進胃癌的進展。而大部分FENDRR作為抑癌基因，調節(jié)腫瘤細胞生物學特性和基因表達。一項研究證實在肝癌細胞中過表達FENDRR，能夠抑制肝癌細胞活力，促進細胞凋亡[14]，而另一項研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ENDRR還可以通過抑制Treg介導的肝癌細胞免疫逃逸，降低肝癌細胞的增殖[15]。為了探討FENDRR在肺鱗癌H226細胞中的作用，本研究發(fā)現(xiàn)下調FENDRR表達，能夠顯著增強肺鱗癌H226細胞的增殖活力、遷移和侵襲能力，并抑制H226細胞凋亡。結果表明FENDRR在肺鱗癌H226細胞中作為抑癌基因，在H226細胞發(fā)展進程中發(fā)揮調節(jié)作用。

過度活化ERK/MAPK信號通路會促進腫瘤增殖、侵襲和轉移的能力[16]。本研究通過RNAInter在線工具提取了FENDRR相互作用的基因，對這些基因進行富集分析結果提示，F(xiàn)ENDRR可能與MAPK通路相關。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，下調FENDRR激活了肺鱗癌H226細胞的ERK/MAPK信號級聯(lián)，明顯促進H226細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并抑制細胞凋亡，而加入ERK抑制劑U0126后發(fā)現(xiàn)，能夠顯著抑制H226細胞的增殖活力、遷移和侵襲能力，并誘導細胞凋亡。證實FENDRR可能通過調控ERK/MAPK通路，調節(jié)肺鱗癌H226細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡。

綜上所述，F(xiàn)ENDRR在肺鱗癌H226細胞中低表達，下調FENDRR可以調控ERK/MAPK促進細胞增殖、轉移、侵襲并抑制細胞凋亡。ERK抑制劑U0126能夠逆轉這一現(xiàn)象，為肺鱗癌臨床治療提供依據(jù)，但FENDRR在肺鱗癌中的靶基因及調節(jié)機制尚不清楚，仍需進一步深入研究。