周蓓燁，李明才，劉 銀

（1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315211 ；2. 上海市肺科醫(yī)院檢驗科，上海200003）

細胞凋亡是指由基因控制的細胞自主有序的死亡。細胞凋亡與增殖之間的動態(tài)平衡可保持多細胞動物生長發(fā)育的穩(wěn)定，維持組織器官結(jié)構(gòu)與功能的正常[1]。細胞凋亡的過程受到抑制，導(dǎo)致突變的細胞不能被及時清除是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的主要原因。Livin 蛋白是IAP 家族中的一種新的獨立于Bcl-2 蛋白的抗凋亡蛋白[2]。正常組織中Livin蛋白的表達水平較低，甚至?xí)z測不到。而在一些腫瘤組織中可存在高水平的Livin 蛋白表達。在細胞凋亡的過程中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）在執(zhí)行最終的凋亡效應(yīng)中起到非常重要的作用[3]。Bcl-2 家族中的Bcl-2 是一種編碼分子量為24800 的蛋白質(zhì)原癌基因，具有抑制細胞凋亡的作用[4]。目前關(guān)于Livin 蛋白在非小細胞肺癌（NSCLC）中的表達臨床上已有大量的報道，但對于Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白這三種蛋白之間的相關(guān)性臨床上鮮有報道。本文對我院接診的110 例NSCLC 患者進行研究，旨在探討Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白在NSCLC 中的表達及意義。

1 資料和方法

1.1 研究資料

本次研究選取的研究對象均為我院接診的NSCLC 患者（共110 例）。這些患者均經(jīng)手術(shù)病理檢查被證實患有NSCLC。其中有男性45 例，女性65 例；其年齡為42 ～73 歲，平均年齡（65.28±5.15）歲。其中有肺鱗癌患者51 例，肺腺癌患者59 例；有高分化肺鱗癌患者17 例，中分化肺鱗癌患者22 例，低分化肺鱗癌患者12 例；有高分化肺腺癌患者32 例，低分化肺腺癌患者27 例（根據(jù)WHO《肺腫瘤組織學(xué)分型》（2000年版）[5]進行分型）。其中TNM 分期為Ⅰ期或Ⅱ期的患者有57 例，為Ⅲ期或Ⅳ期的患者有53 例（依據(jù)1997 年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）規(guī)定的TNM 分期方法[6]進行分期）；其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者有50 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者有60 例。

1.2 方法

取上述患者中60 例患者的癌組織、35 例患者的癌旁組織和15 例患者的正常肺組織進行Livin蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白表達水平的檢測（采用免疫組織化學(xué)法），具體的檢測方法是：用10% 甲醛溶液固定樣本組織，采用石蠟包埋法將其制成3 ～4μm 厚的切片，然后對切片進行Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白的免疫組織化學(xué)染色和HE 染色[7]。所用試劑包括兔抗人Livin 多克隆抗體、兔抗人Caspase-3 多克隆抗體和兔抗人Bcl-2 多克隆抗體（美國SantaCruz公司），超敏SP 試劑盒和DAB 顯色劑（北京中山生物有限公司）。根據(jù)試劑盒說明書進行實驗操作，以陽性切片作為陽性對照，以正常兔IgG 代替一抗作為陰性對照。上述三種多克隆抗體以1:75 的比例進行稀釋，依次進行石蠟包埋、切片、脫蠟、水化處理，孵育前置檸檬酸緩沖液進行高壓修復(fù)約90 s。用3%H2O2去離子水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，切片孵育10min。觀察組一抗孵箱內(nèi)放置90min，對照組則用PBS 替代。進行DAB 顯色和蘇木素復(fù)染，然后進行光鏡觀察。

1.3 觀察指標(biāo)

上述三種蛋白的陽性反應(yīng)均表現(xiàn)為胞漿內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕黃色顆粒，未見核表達。每張切片計數(shù)1000 個細胞，以染色強度和陽性細胞百分率為依據(jù)對三種蛋白的染色情況進行評價。首先按細胞染色強度進行評分：無著色為0 分，淺黃色（弱陽性）為1 分，棕黃色（中度陽性）為2分，棕褐色（強陽性）為3 分。然后按陽性細胞百分率進行評分：無陽性細胞為0 分，陽性細胞占比＜25% 為1 分，陽性細胞占25% ～50% 為2 分，陽性細胞占51% ～75% 為3 分，陽性細胞占76%～100%為4 分。上述2 項評分的乘積＞3分則判為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

運用SPSS 10.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，n ≥40 且T ≥5 時兩樣本率比較采用χ2 檢驗，n ＜40 或T ＜5 時兩樣本率比較采用Finisher 確切概率法，采用Spearman 等級相關(guān)分析法進行相關(guān)性分析，以α=0.05 為檢驗標(biāo)準。用COX 比例風(fēng)險模型分析Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白的表達與腫瘤組織類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白在癌組織、癌旁組織和正常肺組織中的表達

Livin 蛋白和Bcl-2 蛋白在癌組織中表達的陽性率分別為84.59%、69.64%，在癌旁組織中表達的陽性率分別為2.87%、2.26%，在正常肺組織中表達的陽性率分別為0.00%、0.00%。Livin蛋白和Bcl-2 蛋白在癌組織中表達的陽性率均顯著高于癌旁組織和正常肺組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Caspase-3 蛋白在癌組織中表達的陽性率為42.57%，在癌旁組織中表達的陽性率為68.32%，在正常肺組織中表達的陽性率為83.19%。Caspase-3 蛋白在癌組織中表達的陽性率顯著低于癌旁組織和正常肺組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 110 例NSCLC 患者Livin 蛋白、Caspase-3蛋白和Bcl-2 蛋白的陽性表達情況與其臨床病理特征的關(guān)系

110 例NSCLC 患 者Livin 蛋 白 的 陽 性 表達情況與其腫瘤的分化程度、組織學(xué)類型無關(guān)（P＞0.05），與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)（P＜0.05）。110 例NSCLC 患者Caspase-3 蛋白的陽性表達情況和Bcl-2 蛋白的陽性表達情況與其腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)（P＜0.05），與其腫瘤的組織學(xué)類型無關(guān)（P＞0.05）。詳見表2。

表1Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白在癌組織、癌旁組織和正常肺組織中的表達[ 例（%）]

表2 110 例NSCLC 患者Livin 蛋白、Caspase-3 蛋白和Bcl-2 蛋白的陽性表達情況與其臨床病理特征的關(guān)系（例）

2.3 110 例NSCLC 患者Bcl-2 蛋白、Livin 蛋白與Caspase-3 蛋白表達水平的相關(guān)性

進行Spearman 相關(guān)性分析的結(jié)果顯示，110例NSCLC 患者Bcl-2 蛋白的表達水平與其Livin蛋白的表達水平呈正相關(guān)，其Caspase-3 蛋白的表達水平與其Livin 蛋白的表達水平呈負相關(guān)。

3 討論

細胞凋亡（apoptosis）是一種由凋亡相關(guān)基因調(diào)控的為維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而出現(xiàn)的細胞自身程序化死亡[1]。機體通過細胞凋亡這一途徑可保持細胞數(shù)量的穩(wěn)定、維持組織器官中凋亡與增殖細胞之間的動態(tài)平衡。細胞內(nèi)源性基因、酶類都可以對細胞凋亡過程進行調(diào)控[8]。有研究表明，惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅與原癌基因失活和癌基因激活有關(guān)，也與細胞凋亡和細胞增殖的異常有密切關(guān)系。細胞凋亡功能的損害是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵原因之一[9]。Livin 蛋白是IAP 家族中一類新的獨立于Bcl-2 蛋白的抗凋亡蛋白。Losis Miller等首次在桿狀病毒CpGV 和OP MNV 中發(fā)現(xiàn)了Livin 蛋白[10]。有研究指出，Livin 蛋白可通過多種途徑抗細胞凋亡[11]。相關(guān)的研究顯示，Bcl-2蛋白可抑制細胞凋亡[12]，延長細胞的生存時間，增加基因突變細胞的數(shù)量，并協(xié)助細胞逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，從而可促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)Bcl-2 蛋白在NSCLC 癌組織中的表達水平明顯高于正常肺組織。這可能是由于Bcl-2蛋白通過抑制細胞凋亡促進了NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展[14]。Caspase-3 屬于半胱氨酸蛋白酶Caspase家族，Caspase-3 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑可觸發(fā)細胞凋亡。本研究中發(fā)現(xiàn)Caspase-3 蛋白在NSCLC癌組織中的表達水平明顯低于正常肺組織。這提示，NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展可能與Caspase-3 蛋白的表達水平密切相關(guān)[15]。本研究的結(jié)果顯示，110 例NSCLC 患者Livin 蛋白的陽性表達情況與其腫瘤的分化程度、組織學(xué)類型無關(guān)（P＞0.05），與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)（P＜0.05）。110 例NSCLC 患者Caspase-3 蛋白的陽性表達情況和Bcl-2 蛋白的陽性表達情況與其腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)（P＜0.05），與其腫瘤的組織學(xué)類型無關(guān)（P＞0.05）。進行Spearman 相關(guān)性分析的結(jié)果顯示，110 例NSCLC 患者Bcl-2 蛋白的表達水平與其Livin 蛋白的表達水平呈正相關(guān)，其Caspase-3 蛋白的表達水平與其Livin 蛋白的表達水平呈負相關(guān)。

綜上所述，Livin 蛋白、Bcl-2 蛋白在NSCLC癌組織中存在表達上調(diào)的情況，Livin 蛋白的表達與Caspase-3 蛋白、Bcl-2 蛋白的表達密切相關(guān)，三者在NSCLC 的發(fā)生發(fā)展中可能起協(xié)同作用。本研究的研究指標(biāo)和樣本量有限，上述研究結(jié)論仍需通過進行大樣本的臨床研究加以證實。