何振華，李永成，朱高勇

（賀州市人民醫(yī)院，廣西 賀州 542800）

膿毒癥是人體對感染反應(yīng)失調(diào)所導(dǎo)致的一種全身炎癥反應(yīng)綜合征。此病可引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，是導(dǎo)致人類死亡的重要疾病之一[1]。在臨床ICU，腹腔感染所致膿毒癥的發(fā)生率較高，達(dá)到40% 左右，其致死率約為36%[2-3]。近年來隨著我國醫(yī)療技術(shù)的提高，臨床上對于膿毒癥的治療取得了一定進(jìn)展，但其發(fā)病率和致死率仍較高[4]。腹腔感染是腹部外科的常見病，多繼發(fā)于消化道穿孔、闌尾炎、腸梗阻、腸壞死等腹部疾病或腹部手術(shù)后并發(fā)癥（如胃腸道瘺）[5]。腹腔感染若處理不及時，易發(fā)展為膿毒癥。膿毒癥發(fā)病十分迅速，且病情兇險(xiǎn)，臨床治療的難度較大，患者的預(yù)后差。人類膿毒癥的發(fā)病過程首先是急性促炎因子的爆發(fā)，然后是代償性抗炎階段，最后是免疫抑制階段[6-7]。膿毒癥動物模型的建立有利于本病的研究，能夠?yàn)槟摱景Y發(fā)生機(jī)制的研究提供新思路。但實(shí)際上，由于膿毒癥動物模型存在引發(fā)劑性質(zhì)不同、疾病發(fā)展時間不同、膿毒癥發(fā)展過程中有無合并癥及缺乏在人類膿毒癥治療中常用的支持治療（如液體復(fù)蘇、使用血管活性藥物、呼吸機(jī)等）等問題，導(dǎo)致膿毒癥動物模型受到部分研究者的質(zhì)疑[8]。未來膿毒癥動物模型的研究可集中在減少這些變異因素方面，以便更接近人類膿毒癥模型。腹腔感染模型是目前最常采用的膿毒癥動物模型，近年來受到許多研究者的關(guān)注。本文主要是對腹腔感染致膿毒癥實(shí)驗(yàn)動物模型建立方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 膿毒癥實(shí)驗(yàn)動物模型的選擇

實(shí)驗(yàn)動物模型的應(yīng)用克服了在人身上研究的限制，避免了對人體進(jìn)行臨床試驗(yàn)所帶來的風(fēng)險(xiǎn)及倫理學(xué)問題。通常來說，臨床上的膿毒癥是十分復(fù)雜的，許多膿毒癥患者本身就伴有其他嚴(yán)重的非相關(guān)性疾病（如心臟病、呼吸系統(tǒng)疾病等），這會對膿毒癥的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生較大的影響，往往難以判斷患者的發(fā)病時間及具體病情[9]。應(yīng)用膿毒癥動物模型則排除了臨床研究過程中其他因素的干擾，且可以從性別、年齡、體重、遺傳等方面控制實(shí)驗(yàn)動物，能更客觀地反應(yīng)膿毒癥的發(fā)病過程[10]。當(dāng)前可用于建立膿毒癥模型的動物品種較多，各類動物又有其不同的特點(diǎn)，可用于不同目的的研究[11]。到目前為止，小型哺乳動物如大鼠、小鼠仍然是最好的動物模型，應(yīng)用最為廣泛，原因是可以建立大量性別、年齡相同、遺傳相似度高的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，且其價格低，易于管理。Sato[12]等利用特定基因敲除小鼠研究其在膿毒癥期間發(fā)生的免疫功能變化，從而對膿毒癥的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了研究。在選擇膿毒癥動物模型時，需結(jié)合其年齡、性別、品系等因素。Zellweger 等[13]首次報(bào)道不同性別膿毒癥小鼠模型的差異，他們建模后發(fā)現(xiàn)雄性小鼠的10 d 存活率低于雌性小鼠，其脾細(xì)胞增殖能力及白細(xì)胞介素-2（interleukin，IL-2）、IL-3 的釋放量明顯降低，但與雌性膿毒癥小鼠無明顯差異。有研究報(bào)道，與年輕膿毒癥小鼠相比，老齡膿毒癥小鼠的死亡率更高，且建模后24 h 其血IL-6 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factoralpha，TNF-α）的水平均較高，對抗生素治療更為敏感[14]。宋景春等[15]選用BALB/c 小鼠和昆明（KM）小鼠建立膿毒癥模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)BALB/c 小鼠對膿毒癥盲腸結(jié)扎模型的敏感度更高，說明不同品系的動物能夠?qū)δ摱景Y模型造成影響。因此，研究者可結(jié)合自己的研究目的，選擇適宜的實(shí)驗(yàn)動物。

2 常用腹腔感染致膿毒癥動物模型的建立方法

目前，腹腔感染致膿毒癥動物模型的建立方法有注射法和外科手術(shù)法，其中注射法包括腹腔注射內(nèi)毒素、細(xì)菌或糞便顆粒等，而通過外科手術(shù)建立的腹腔感染致膿毒癥動物模型則多為盲腸結(jié)扎穿孔模型（cecal Ligation and Puncture，CLP）和腹腔持續(xù)置管引流模型（colon Ascendens Stent Peritonitis，CASP）。

2.1 注射法

2.1.1 內(nèi)毒素注射模型 內(nèi)毒素廣泛存在于革蘭陰性菌細(xì)胞壁的外膜中，屬于一種脂多糖成分，其廣泛用于臨床研究中，如通過內(nèi)毒素血癥模型研究炎癥相關(guān)機(jī)制和細(xì)胞因子譜。相關(guān)的研究指出，通過給志愿者注射少量的內(nèi)毒素，可引起較多的輕微癥狀，如體溫升高、頭痛等，但以上癥狀在數(shù)小時后均可消退[16]。在人體實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)毒素所致敗血癥的特點(diǎn)是通過增加循環(huán)血漿中宿主炎性反應(yīng)介質(zhì)（如TNF-α、IL-6、IL-10 等）的濃度，使炎性細(xì)胞因子的表達(dá)逐漸及長期升高[17]。通過腹腔注射內(nèi)毒素能引起小鼠膿毒癥樣癥狀，將類似于某些爆發(fā)的人類革蘭陰性菌感染的病理生理變化充分表現(xiàn)出來，而大劑量注射內(nèi)毒素通常會引起促炎細(xì)胞因子急性且短暫的升高[18]。有研究報(bào)道，內(nèi)毒素可損害心肌的收縮能力，并增加循環(huán)中TNF-α、IL-6 的濃度[19]。與人類相比，小鼠對脂多糖毒性或致死效應(yīng)的敏感性要低得多，因此，它們需要更高劑量的脂多糖來顯示這種效應(yīng)。由此可見，脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型不能準(zhǔn)確反映人類膿毒癥的特點(diǎn)，有一定的局限性。

2.1.2 特定的細(xì)菌接種模型 特定的細(xì)菌接種模型是指將已知數(shù)量的細(xì)菌及輔助物質(zhì)混合接種于腹腔內(nèi)所建立的腹腔感染致膿毒癥動物模型[20]。此類動物模型的死亡率取決于注射細(xì)菌的數(shù)量及所使用的液體和抗生素[7]。雖然此類動物模型是可控、可復(fù)制的，但如果注射劑量掌握不好，就會導(dǎo)致細(xì)菌不會在宿主體內(nèi)定植，也不能繁殖，反而會立即被機(jī)體的補(bǔ)體系統(tǒng)裂解，使其被包裹，進(jìn)而形成局部膿腫，難以引起腹腔感染及膿毒癥[19]。故細(xì)菌接種模型的應(yīng)用受到一定限制。

2.1.3 糞便顆粒模型 糞便顆粒模型一般是指通過向動物的腹腔內(nèi)注射含有糞便及輔助物顆粒所建立的腹腔感染致膿毒癥動物模型。建立此類動物模型的操作較為簡單，但首先需要初步制備樣品，并對其細(xì)菌的組成進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[21]。與經(jīng)典的膿毒癥動物模型不同的是，通過向腹腔注射糞便顆粒建立的膿毒癥動物模型可能會出現(xiàn)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致其早期死亡，難以再現(xiàn)膿毒癥的血流動力學(xué)和代謝的改變[22]。此類動物模型膿毒癥的動態(tài)變化是通過改變糞便顆粒內(nèi)容物的量來調(diào)控的，由于某些細(xì)菌在樣品制備過程中死亡，因此可在一定程度上影響實(shí)驗(yàn)效果。此外，糞便顆粒提供了腹膜炎后腹腔膿腫的模型，而不是腹腔敗血癥模型。因此，該模型是難以控制和復(fù)制的，現(xiàn)已逐漸被其他模型所取代。

2.2 外科手術(shù)法

2.2.1 盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）模型 建立CLP 模型的操作方法較多，經(jīng)典方法是[23]：首先對大鼠進(jìn)行麻醉，在無菌條件下用手術(shù)刀在其腹壁作一長約2 cm 的切口，經(jīng)切口進(jìn)入腹腔，尋找盲腸，采用無菌絲線將盲腸的遠(yuǎn)端結(jié)扎，并選擇相應(yīng)的無菌針頭在已經(jīng)結(jié)扎的盲腸端進(jìn)行貫通穿刺，將少量的盲腸內(nèi)容物擠出，以保證穿刺孔的通暢。之后將盲腸推回腹腔內(nèi)，將腹腔關(guān)閉，最后進(jìn)行逐層縫合操作。CLP 模型的建立主要是通過外科手術(shù)的方式，將一定量含有混合細(xì)菌的糞便漏入腹腔內(nèi)，且腹腔內(nèi)存在失活組織（結(jié)扎的盲腸），從而導(dǎo)致腹腔感染并引起腹膜炎，出現(xiàn)膿毒癥的臨床癥狀（如發(fā)熱、食欲不振、嗜睡等），最后導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物因膿毒癥休克而死亡，其病理生理變化過程與臨床情況十分接近，且能對臨床上的闌尾炎或憩室炎穿孔的特點(diǎn)進(jìn)行模擬。有學(xué)者通過對內(nèi)毒素攻擊模型和CLP 模型的病理生理反應(yīng)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者在細(xì)胞因子反應(yīng)的數(shù)量上存在明顯差異，從而可充分反映高代謝和晚期低動力循環(huán)的血流動力學(xué)變化過程及臨床膿毒癥患者的早期高動力循環(huán)情況[24]。近年來，許多學(xué)者利用CLP模型進(jìn)行抗感染、代謝、凋亡、細(xì)胞因子和免疫功能等方面的研究，均取得了一定成效[25]。CLP模型具有諸多優(yōu)勢，如易于標(biāo)準(zhǔn)、操作簡單，且具有較好的可重復(fù)性，能夠?qū)⒉煌淖兞恳蛩匾?，包括動物的性別、年齡、種類、盲腸結(jié)扎長度、穿刺孔數(shù)目、穿刺孔大小、術(shù)后液體復(fù)蘇及抗生素的應(yīng)用等[26]。在決定模型死亡率和炎癥反應(yīng)程度的重要因素中，盲腸結(jié)扎長度、穿刺孔大小及數(shù)目所占的比例較高。但該模型也有一定的缺點(diǎn)，如在建立模型后，難以估計(jì)流入腹腔內(nèi)腸內(nèi)容物的量，有時腸內(nèi)容物會被包裹，表現(xiàn)為局限性炎癥，難以發(fā)展為膿毒癥。因此，今后還需通過更深入的研究來改進(jìn)和完善CLP 模型，使之更加標(biāo)準(zhǔn)化。

2.2.2 腹腔持續(xù)置管引流（CASP）模型 Traeger等[27]報(bào)道，CASP 模型的建立方法較多，其中經(jīng)典方法是：首先按照建立CLP 模型的方法將大鼠的腹腔打開，尋找盲腸，將用靜脈輸液BD 針制作的支架固定在距離回盲部1 ～1.5 cm 處的升結(jié)腸壁，使腸腔與腹腔相通，并采用棉簽進(jìn)行輕輕按壓，從而保證腸內(nèi)容物能夠從置管中溢出。完成上述操作后，將適量的生理鹽水置入腹腔內(nèi)，最后關(guān)閉腹腔，逐層縫合傷口。與CLP 模型相比，CASP 模型是一種新型的膿毒癥動物模型，其建模原理是：通過在升結(jié)腸壁置入用靜脈輸液BD針制作的支架，使腸腔與腹腔相通，導(dǎo)致腸內(nèi)容物持續(xù)滲漏至腹腔內(nèi)，從而引起腹腔感染，隨著病程的不斷進(jìn)展，最終可發(fā)展為膿毒癥和多器官衰竭。上述病理變化與腸瘺的病理變化十分相似。研究發(fā)現(xiàn)，建模成功后，CASP 模型炎性細(xì)胞因子的水平會逐漸升高。以往的研究表明，CASP 模型中不同管徑的支架與動物血清細(xì)胞因子水平的變化、生存率之間存在密切的相關(guān)性，即支架的管徑越大，動物的生存率越低，其變化幅度與CLP模型相比更加顯著[28-29]。用小支架建立的CASP模型適合長期研究和輕- 中度膿毒癥的研究[30]。由此可見，通過對置入支架管徑的大小進(jìn)行改變，可對膿毒癥動物模型的炎癥程度進(jìn)行控制。有學(xué)者通過對小鼠的體溫進(jìn)行研究，將CASP 小鼠模型分為兩組，即輕癥組（體溫＜32℃）和重癥組（體溫≥32℃），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠在血清細(xì)胞因子、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、生存率等方面存在明顯的差異性，提示通過監(jiān)測體溫能夠?qū)δ摱景Y動物模型的嚴(yán)重程度進(jìn)行早期預(yù)測[31]。有研究發(fā)現(xiàn)，CASP 大鼠模型在手術(shù)18 h 后其肝、腎、肺和心臟的代謝組學(xué)及病理生理變化均較大，說明建模后時間點(diǎn)的選擇對判斷膿毒癥很重要[32]。與CLP模型相比，CASP 模型的炎性細(xì)胞因子水平會持續(xù)升高，原因是隨著時間的推移，CASP 模型的腸內(nèi)容物會持續(xù)滲漏。而在CLP 模型中，由于早期腸粘連的形成，病灶被包裹，炎癥較為局限。CASP模型的缺點(diǎn)是建模相對復(fù)雜，存在差異性，另外糞便內(nèi)的細(xì)菌會持續(xù)進(jìn)入動物的腹腔，無法控制。對于CLP 模型而言，其研究的重點(diǎn)是局限性腹腔膿腫形成的病理變化；對于CASP 模型而言，其主要用于研究彌漫性腹膜炎的臨床病程。

3 小結(jié)

本研究中分析了腹腔感染致膿毒癥實(shí)驗(yàn)動物模型建立的幾種常用類型及常用方式。由于動物發(fā)生膿毒癥的病理生理過程與人類有所不同，因此需選擇適宜的動物模型用于實(shí)驗(yàn)研究，并保證研究具有可重復(fù)性，同時應(yīng)盡量與臨床的膿毒癥實(shí)驗(yàn)動物模型接近，以達(dá)到順利完成實(shí)驗(yàn)、提高實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的目的。