奚少勇，磨立達(dá)

〔南寧市第四人民醫(yī)院，廣西艾滋病臨床治療中心（南寧）檢驗(yàn)科，廣西 南寧 530023〕

結(jié)核病是全球范圍內(nèi)重要的傳染病。耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)給結(jié)核病的防治帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。世界衛(wèi)生組織（WHO）于2013 年重新修訂了耐藥結(jié)核病的分類(lèi)（主要分為以下五類(lèi)：?jiǎn)文退幗Y(jié)核病、多耐藥結(jié)核病、耐多藥結(jié)核病、廣泛耐藥結(jié)核病和利福平耐藥結(jié)核?。1]。2020 年，WHO就全球結(jié)核病(TB) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)顯示，2019 年全球新增結(jié)核病患者996 萬(wàn)例，約有3.3% 的新患者和18% 的復(fù)治患者對(duì)RFP 耐藥，估算利福平耐藥結(jié)核病患者數(shù)約有46.5 萬(wàn)，其中耐多藥結(jié)核病患者約占78%。我國(guó)的耐藥結(jié)核病（DR-TB）患者數(shù)約為6.5 萬(wàn)，占全球的14%，相關(guān)疾控形勢(shì)相當(dāng)嚴(yán)峻[2]。我國(guó)每年花費(fèi)大量的資金用于治療DR-TB，但效果不夠理想，患者的死亡率較高（死亡病例數(shù)幾乎是全球結(jié)核病死亡病例數(shù)的四分之一），近年來(lái)不少菌株對(duì)貝達(dá)喹啉（Bbq）、德拉馬尼（Dlm）等新藥逐漸發(fā)生耐藥，甚至達(dá)到了無(wú)藥可用的地步[3]。耐藥結(jié)核病的診斷主要以MTB DST 檢測(cè)結(jié)果為依據(jù)。在本文中，筆者主要是對(duì)各種MTB DST 檢測(cè)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 表型DST 檢測(cè)方法

當(dāng)前，業(yè)內(nèi)一致認(rèn)同MTB 耐藥性檢測(cè)必須依賴(lài)于MTB 培養(yǎng)。MTB 培養(yǎng)主要是利用絕對(duì)濃度法或比例法將菌株接種于含抗結(jié)核藥及不含藥的羅氏培養(yǎng)基上，根據(jù)培養(yǎng)基表面覆蓋菌落數(shù)量或無(wú)菌落情況判斷培養(yǎng)菌株是否產(chǎn)生耐藥性。另外，也可利用菌株在含藥和不含藥液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況來(lái)判斷其是否產(chǎn)生耐藥性。此方法可同時(shí)檢測(cè)其對(duì)多種藥物的耐藥性，包括一線及二線抗結(jié)核藥。然而，檢測(cè)表型DST 需使用MTB 純培養(yǎng)物，且MTB 存在生長(zhǎng)較慢、有生物安全危害性的特性，這決定了該檢測(cè)方法存在費(fèi)時(shí)、成本高、可比性差等缺點(diǎn)[4]。另外, 在培養(yǎng)異質(zhì)性耐藥菌株時(shí)，敏感菌比耐藥菌生長(zhǎng)快，這可能會(huì)引起耐藥漏判。

1.1 傳統(tǒng)的表型DST 檢測(cè)方法

目前臨床上常用的表型DST 檢測(cè)方法主要包括絕對(duì)濃度法和比例法，用這兩種方法檢測(cè)MTB耐藥性的相符性均達(dá)80% 以上，檢測(cè)RFP 耐藥性的相符性可高達(dá)90%。研究表明，在對(duì)MTB耐藥的檢出率方面，比例法優(yōu)于絕對(duì)濃度法。上述傳統(tǒng)DST 檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)是可同時(shí)檢測(cè)十幾種抗結(jié)核藥物的耐藥水平、有商業(yè)化的試劑、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)費(fèi)用低，適于在縣級(jí)疾控中心或縣級(jí)定點(diǎn)醫(yī)院開(kāi)展。但其同時(shí)存在較多缺點(diǎn)，包括檢測(cè)EMB、吡嗪酰胺(PZA)、Pto、PAS 和Cs 的結(jié)果不穩(wěn)定、耗時(shí)長(zhǎng)（培養(yǎng)時(shí)間通常在30 d 以上）、檢測(cè)結(jié)果易受含藥管中實(shí)際藥物濃度、MTB 懸液濃度、接種量和MTB 活力的影響等。

1.2 分枝桿菌液體培養(yǎng)DST 檢測(cè)法

采用分枝桿菌液體培養(yǎng)DST 檢測(cè)法檢測(cè)MTB耐藥性的結(jié)果與傳統(tǒng)表型DST 檢測(cè)方法具有較高的符合性，但檢測(cè)時(shí)間較短（通常需要8 ～10 d）[5]。WHO 已認(rèn)可應(yīng)用該法進(jìn)行部分二線抗結(jié)核藥物〔如氧氟沙星(Ofx)、Km、Cm、Eto 等〕MTB DST檢測(cè)的效果[6]。其缺點(diǎn)是檢測(cè)儀器和試劑較為昂貴，且易被污染[7-8]。其優(yōu)點(diǎn)包括可肉眼、自動(dòng)化判讀結(jié)果等[9]。

2 分子DST 檢測(cè)方法

分子DST 檢測(cè)目前已被公認(rèn)為是DR-TB 的確診項(xiàng)目之一[10]，其優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)時(shí)間短(2 ～48 h)、敏感度高，能從MTB 分離株、預(yù)處理的涂陰或培陰臨床標(biāo)本中檢出MTB 耐藥基因突變。需要注意的是，在進(jìn)行相關(guān)標(biāo)本處理或分離株前處理時(shí)存在較高的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，但在進(jìn)行標(biāo)本液化時(shí)和完成DNA 提取后，安全風(fēng)險(xiǎn)是很低的。此檢測(cè)方法的其他缺點(diǎn)包括：1）檢測(cè)僅限于部分耐藥基因型，應(yīng)用范圍受限[11]；2）難以檢出異質(zhì)性耐藥[12]，表型DST 低水平耐藥菌株可能無(wú)法被檢出；3）會(huì)檢出不影響耐藥表型的同義突變( 氨基酸無(wú)改變)、沉默突變( 不影響編碼蛋白的表達(dá))[13]，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果（但這種情況的發(fā)生概率很低）；4）無(wú)法檢出所有表型的MTB 耐藥菌株[14]；5）檢測(cè)成本較高?？梢?jiàn)，此檢測(cè)方法無(wú)法替代傳統(tǒng)的表型DST 檢測(cè)方法，僅可起到一定的補(bǔ)充作用。

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)進(jìn)行DST 檢測(cè)具有檢測(cè)時(shí)間短、自動(dòng)化程度高，既能檢測(cè)MTB 基因，又能辨別RFP 常見(jiàn)耐藥決定區(qū)域[15]，檢測(cè)可信度高等優(yōu)點(diǎn)。在進(jìn)行該檢測(cè)時(shí)，核酸片段提取、變性退火延伸、檢測(cè)分析產(chǎn)物等步驟均能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，操作不繁瑣，檢測(cè)所需時(shí)間在100 min 左右?？芍苯訉?duì)固體或液體培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)，除血液標(biāo)本外，其他臨床標(biāo)本（如痰、固/ 液培養(yǎng)物、肺外結(jié)核標(biāo)本）均可檢測(cè)。其傳染風(fēng)險(xiǎn)低，產(chǎn)生氣溶膠的幾率小。但目前只能檢測(cè)RFP 的耐藥性，并不能區(qū)分具體的突變類(lèi)型。

2.2 熒光PCR 探針熔解曲線法

采用熒光PCR 探針熔解曲線法可檢測(cè)MTB對(duì)多種抗結(jié)核藥物（如異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇及氟喹諾酮類(lèi)藥物）的耐藥性[16]。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短。其缺點(diǎn)是檢測(cè)結(jié)果易受到探針GC 含量、金屬離子濃度、雜交溫度等多種因素的影響，且不能區(qū)分具體的突變類(lèi)型。

2.3 基因芯片技術(shù)

采用基因芯片技術(shù)能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出MTB 對(duì)利福平及異煙肼的耐藥性。此技術(shù)可用于鑒別各種分枝桿菌[17]。有研究指出，利用基因芯片技術(shù)能夠快速檢出MTB 對(duì)RFP 和INH 耐藥的常見(jiàn)基因型，并可明確突變的具體位點(diǎn)和性質(zhì)。進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)的耗時(shí)僅為1 ～2 d。大量的研究表明，此技術(shù)在診斷MDR-TB 中的應(yīng)用價(jià)值較高。其缺點(diǎn)是進(jìn)行雜交、檢測(cè)過(guò)程中的工序繁瑣，所需技術(shù)熟練程度較高，且試劑較貴。

2.4 反向雜交技術(shù)

利用反向雜交技術(shù)可同時(shí)快速檢測(cè)MTB 對(duì)RFP、INH、EMB、FQs、Am、Km 和Cm 的 耐藥性[18]，明確相關(guān)基因突變的具體位點(diǎn)和性質(zhì)，并可對(duì)MDR-TB、pre-XDR-TB 和XDR-TB 進(jìn)行鑒別診斷。進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)的耗時(shí)僅為1 ～2 d。但由于其屬于開(kāi)放性檢測(cè)，容易產(chǎn)生氣溶膠，且雜交、顯色過(guò)程操作繁瑣，不易控制。

2.5 基因測(cè)序技術(shù)

利用基因測(cè)序（whole-genome sequencing,WGS）技術(shù)能夠高效便捷地檢測(cè)出MTB 對(duì)RFP和INH 的耐藥基因型，明確相關(guān)基因突變的具體位點(diǎn)和性質(zhì)，從而能夠?yàn)榫珳?zhǔn)診療提供有益參考。但進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)的準(zhǔn)入成本較高，經(jīng)驗(yàn)及技術(shù)人員相對(duì)缺乏[19]，目前在基層、乃至多數(shù)地市級(jí)定點(diǎn)醫(yī)院尚無(wú)法廣泛開(kāi)展。

3 小結(jié)

目前，無(wú)論是表型DST 檢測(cè)方法還是分子DST 檢測(cè)方法，均無(wú)法單一滿足臨床需求。低濃度MTB 易導(dǎo)致表型DST 檢測(cè)與分子DST 檢測(cè)的結(jié)果不一致。用表型DST 檢測(cè)方法和分子DST 檢測(cè)方法檢測(cè)RFP、INP、FQs 抗結(jié)核耐藥性的準(zhǔn)確度較高，其他藥物的DST 檢測(cè)需結(jié)合臨床。表型DST 和分子DST 對(duì)二線抗結(jié)核藥物的DST 檢測(cè)結(jié)果均不穩(wěn)定。傳統(tǒng)表型DST 檢測(cè)是檢測(cè)MTB 的金標(biāo)準(zhǔn)，但也有其局限性。分子DST 檢測(cè)可作為快速篩查MTB 的方法和（或）傳統(tǒng)表型DST 檢測(cè)的補(bǔ)充。采用多種方法聯(lián)合檢測(cè)能提高M(jìn)TB 的檢出率、縮短診斷時(shí)間，但會(huì)增加TB 患者的檢測(cè)費(fèi)用?！督Y(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)專(zhuān)家共識(shí)》[20]中提出了一種進(jìn)行MTB 耐藥性檢測(cè)的策略( 見(jiàn)圖1)，旨在為DR-TB 的早期明確診斷及治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

圖1 一種進(jìn)行MTB 耐藥性檢測(cè)的策略

綜上所述，對(duì)于疑似DR-TB 患者，臨床上應(yīng)選擇合適的DST 方法對(duì)其進(jìn)行耐藥性聯(lián)合檢測(cè)。相關(guān)研究人員應(yīng)努力尋找更有效的MTB DST 檢測(cè)方法，以便為DR-TB 的快速、準(zhǔn)確診斷和早期有效治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。