奚少勇,磨立達(dá)
〔南寧市第四人民醫(yī)院,廣西艾滋病臨床治療中心(南寧)檢驗(yàn)科,廣西 南寧 530023〕
結(jié)核病是全球范圍內(nèi)重要的傳染病。耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)給結(jié)核病的防治帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。世界衛(wèi)生組織(WHO)于2013 年重新修訂了耐藥結(jié)核病的分類(主要分為以下五類:單耐藥結(jié)核病、多耐藥結(jié)核病、耐多藥結(jié)核病、廣泛耐藥結(jié)核病和利福平耐藥結(jié)核?。1]。2020 年,WHO就全球結(jié)核病(TB) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì),數(shù)據(jù)顯示,2019 年全球新增結(jié)核病患者996 萬例,約有3.3% 的新患者和18% 的復(fù)治患者對(duì)RFP 耐藥,估算利福平耐藥結(jié)核病患者數(shù)約有46.5 萬,其中耐多藥結(jié)核病患者約占78%。我國的耐藥結(jié)核?。―R-TB)患者數(shù)約為6.5 萬,占全球的14%,相關(guān)疾控形勢相當(dāng)嚴(yán)峻[2]。我國每年花費(fèi)大量的資金用于治療DR-TB,但效果不夠理想,患者的死亡率較高(死亡病例數(shù)幾乎是全球結(jié)核病死亡病例數(shù)的四分之一),近年來不少菌株對(duì)貝達(dá)喹啉(Bbq)、德拉馬尼(Dlm)等新藥逐漸發(fā)生耐藥,甚至達(dá)到了無藥可用的地步[3]。耐藥結(jié)核病的診斷主要以MTB DST 檢測結(jié)果為依據(jù)。在本文中,筆者主要是對(duì)各種MTB DST 檢測方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。
當(dāng)前,業(yè)內(nèi)一致認(rèn)同MTB 耐藥性檢測必須依賴于MTB 培養(yǎng)。MTB 培養(yǎng)主要是利用絕對(duì)濃度法或比例法將菌株接種于含抗結(jié)核藥及不含藥的羅氏培養(yǎng)基上,根據(jù)培養(yǎng)基表面覆蓋菌落數(shù)量或無菌落情況判斷培養(yǎng)菌株是否產(chǎn)生耐藥性。另外,也可利用菌株在含藥和不含藥液體培養(yǎng)基中的生長情況來判斷其是否產(chǎn)生耐藥性。此方法可同時(shí)檢測其對(duì)多種藥物的耐藥性,包括一線及二線抗結(jié)核藥。然而,檢測表型DST 需使用MTB 純培養(yǎng)物,且MTB 存在生長較慢、有生物安全危害性的特性,這決定了該檢測方法存在費(fèi)時(shí)、成本高、可比性差等缺點(diǎn)[4]。另外, 在培養(yǎng)異質(zhì)性耐藥菌株時(shí),敏感菌比耐藥菌生長快,這可能會(huì)引起耐藥漏判。
目前臨床上常用的表型DST 檢測方法主要包括絕對(duì)濃度法和比例法,用這兩種方法檢測MTB耐藥性的相符性均達(dá)80% 以上,檢測RFP 耐藥性的相符性可高達(dá)90%。研究表明,在對(duì)MTB耐藥的檢出率方面,比例法優(yōu)于絕對(duì)濃度法。上述傳統(tǒng)DST 檢測方法的優(yōu)勢是可同時(shí)檢測十幾種抗結(jié)核藥物的耐藥水平、有商業(yè)化的試劑、操作簡便、檢測費(fèi)用低,適于在縣級(jí)疾控中心或縣級(jí)定點(diǎn)醫(yī)院開展。但其同時(shí)存在較多缺點(diǎn),包括檢測EMB、吡嗪酰胺(PZA)、Pto、PAS 和Cs 的結(jié)果不穩(wěn)定、耗時(shí)長(培養(yǎng)時(shí)間通常在30 d 以上)、檢測結(jié)果易受含藥管中實(shí)際藥物濃度、MTB 懸液濃度、接種量和MTB 活力的影響等。
采用分枝桿菌液體培養(yǎng)DST 檢測法檢測MTB耐藥性的結(jié)果與傳統(tǒng)表型DST 檢測方法具有較高的符合性,但檢測時(shí)間較短(通常需要8 ~10 d)[5]。WHO 已認(rèn)可應(yīng)用該法進(jìn)行部分二線抗結(jié)核藥物〔如氧氟沙星(Ofx)、Km、Cm、Eto 等〕MTB DST檢測的效果[6]。其缺點(diǎn)是檢測儀器和試劑較為昂貴,且易被污染[7-8]。其優(yōu)點(diǎn)包括可肉眼、自動(dòng)化判讀結(jié)果等[9]。
分子DST 檢測目前已被公認(rèn)為是DR-TB 的確診項(xiàng)目之一[10],其優(yōu)點(diǎn)是檢測時(shí)間短(2 ~48 h)、敏感度高,能從MTB 分離株、預(yù)處理的涂陰或培陰臨床標(biāo)本中檢出MTB 耐藥基因突變。需要注意的是,在進(jìn)行相關(guān)標(biāo)本處理或分離株前處理時(shí)存在較高的生物安全風(fēng)險(xiǎn),但在進(jìn)行標(biāo)本液化時(shí)和完成DNA 提取后,安全風(fēng)險(xiǎn)是很低的。此檢測方法的其他缺點(diǎn)包括:1)檢測僅限于部分耐藥基因型,應(yīng)用范圍受限[11];2)難以檢出異質(zhì)性耐藥[12],表型DST 低水平耐藥菌株可能無法被檢出;3)會(huì)檢出不影響耐藥表型的同義突變( 氨基酸無改變)、沉默突變( 不影響編碼蛋白的表達(dá))[13],產(chǎn)生假陽性結(jié)果(但這種情況的發(fā)生概率很低);4)無法檢出所有表型的MTB 耐藥菌株[14];5)檢測成本較高。可見,此檢測方法無法替代傳統(tǒng)的表型DST 檢測方法,僅可起到一定的補(bǔ)充作用。
采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)進(jìn)行DST 檢測具有檢測時(shí)間短、自動(dòng)化程度高,既能檢測MTB 基因,又能辨別RFP 常見耐藥決定區(qū)域[15],檢測可信度高等優(yōu)點(diǎn)。在進(jìn)行該檢測時(shí),核酸片段提取、變性退火延伸、檢測分析產(chǎn)物等步驟均能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,操作不繁瑣,檢測所需時(shí)間在100 min 左右??芍苯訉?duì)固體或液體培養(yǎng)物進(jìn)行檢測,除血液標(biāo)本外,其他臨床標(biāo)本(如痰、固/ 液培養(yǎng)物、肺外結(jié)核標(biāo)本)均可檢測。其傳染風(fēng)險(xiǎn)低,產(chǎn)生氣溶膠的幾率小。但目前只能檢測RFP 的耐藥性,并不能區(qū)分具體的突變類型。
采用熒光PCR 探針熔解曲線法可檢測MTB對(duì)多種抗結(jié)核藥物(如異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇及氟喹諾酮類藥物)的耐藥性[16]。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、檢測時(shí)間短。其缺點(diǎn)是檢測結(jié)果易受到探針GC 含量、金屬離子濃度、雜交溫度等多種因素的影響,且不能區(qū)分具體的突變類型。
采用基因芯片技術(shù)能快速、準(zhǔn)確地檢測出MTB 對(duì)利福平及異煙肼的耐藥性。此技術(shù)可用于鑒別各種分枝桿菌[17]。有研究指出,利用基因芯片技術(shù)能夠快速檢出MTB 對(duì)RFP 和INH 耐藥的常見基因型,并可明確突變的具體位點(diǎn)和性質(zhì)。進(jìn)行相關(guān)檢測的耗時(shí)僅為1 ~2 d。大量的研究表明,此技術(shù)在診斷MDR-TB 中的應(yīng)用價(jià)值較高。其缺點(diǎn)是進(jìn)行雜交、檢測過程中的工序繁瑣,所需技術(shù)熟練程度較高,且試劑較貴。
利用反向雜交技術(shù)可同時(shí)快速檢測MTB 對(duì)RFP、INH、EMB、FQs、Am、Km 和Cm 的 耐藥性[18],明確相關(guān)基因突變的具體位點(diǎn)和性質(zhì),并可對(duì)MDR-TB、pre-XDR-TB 和XDR-TB 進(jìn)行鑒別診斷。進(jìn)行相關(guān)檢測的耗時(shí)僅為1 ~2 d。但由于其屬于開放性檢測,容易產(chǎn)生氣溶膠,且雜交、顯色過程操作繁瑣,不易控制。
利用基因測序(whole-genome sequencing,WGS)技術(shù)能夠高效便捷地檢測出MTB 對(duì)RFP和INH 的耐藥基因型,明確相關(guān)基因突變的具體位點(diǎn)和性質(zhì),從而能夠?yàn)榫珳?zhǔn)診療提供有益參考。但進(jìn)行相關(guān)檢測的準(zhǔn)入成本較高,經(jīng)驗(yàn)及技術(shù)人員相對(duì)缺乏[19],目前在基層、乃至多數(shù)地市級(jí)定點(diǎn)醫(yī)院尚無法廣泛開展。
目前,無論是表型DST 檢測方法還是分子DST 檢測方法,均無法單一滿足臨床需求。低濃度MTB 易導(dǎo)致表型DST 檢測與分子DST 檢測的結(jié)果不一致。用表型DST 檢測方法和分子DST 檢測方法檢測RFP、INP、FQs 抗結(jié)核耐藥性的準(zhǔn)確度較高,其他藥物的DST 檢測需結(jié)合臨床。表型DST 和分子DST 對(duì)二線抗結(jié)核藥物的DST 檢測結(jié)果均不穩(wěn)定。傳統(tǒng)表型DST 檢測是檢測MTB 的金標(biāo)準(zhǔn),但也有其局限性。分子DST 檢測可作為快速篩查MTB 的方法和(或)傳統(tǒng)表型DST 檢測的補(bǔ)充。采用多種方法聯(lián)合檢測能提高M(jìn)TB 的檢出率、縮短診斷時(shí)間,但會(huì)增加TB 患者的檢測費(fèi)用。《結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測專家共識(shí)》[20]中提出了一種進(jìn)行MTB 耐藥性檢測的策略( 見圖1),旨在為DR-TB 的早期明確診斷及治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
圖1 一種進(jìn)行MTB 耐藥性檢測的策略
綜上所述,對(duì)于疑似DR-TB 患者,臨床上應(yīng)選擇合適的DST 方法對(duì)其進(jìn)行耐藥性聯(lián)合檢測。相關(guān)研究人員應(yīng)努力尋找更有效的MTB DST 檢測方法,以便為DR-TB 的快速、準(zhǔn)確診斷和早期有效治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。