王小鵬，閆爽，高亞欣，厲冰玉，姜波，周霞，崔文明

(1.河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院,鄭州 450002;2.河南花花牛乳業(yè)集團股份有限公司 乳工程研究院,鄭州 450000)

0 引言

乳酸菌是發(fā)酵乳生產(chǎn)的核心原料，它可以利用乳中的碳水化合物、蛋白質、脂肪等營養(yǎng)成分，產(chǎn)生乳酸、風味物質及胞外多糖，賦予發(fā)酵乳制品良好的質地、風味和口感[1-2]。乳酸菌還有重要的益生功能，乳酸菌菌株及其代謝產(chǎn)物可提高人體腸道內有益菌群的活性和豐度，具有增強機體免疫力、促進機體生長、降壓降血脂、抗衰老等作用[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌及其發(fā)酵產(chǎn)物通常具有一定的抗氧化作用，能夠清除自由基、抑制脂質氧化，是安全的抗氧化制劑，可用于功能性發(fā)酵乳制品開發(fā)[6-7]。

相對于其它來源的乳酸菌，人源乳酸菌安全性更高，腸道耐受性和定殖能力更強，菌株對宿主益生特異性更顯著[8]。同時，不同地域、不同種族的人群腸道微生物的功能、代謝機制并不完全相同[9]。目前，我國乳品行業(yè)廣泛使用的乳酸菌發(fā)酵劑主要來自國外，因為機體、環(huán)境等的不同，這些乳酸菌不一定適合中國人的體內環(huán)境[10]。

河南省夏邑縣2008年即被授予“中國長壽之鄉(xiāng)”，是全國內陸平原地區(qū)首個獲此殊榮的縣[11]。本研究首先從夏邑縣健康長壽老人糞便中分離出乳酸菌菌株，通過酸、膽鹽及H2O2耐受性實驗，初篩具有一定耐受能力及抗氧化性的菌株；隨后，以DPPH清除能力、羥基自由基清除能力、超氧陰離子清除能力和總還原力為指標，復篩并鑒定適于發(fā)酵乳生產(chǎn)的高抗氧化性活性乳酸菌菌株。旨在構建具有地域特色的乳酸菌發(fā)酵劑，推動我國乳品工業(yè)和乳酸菌產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

糞便樣品采集自河南省周口市夏邑縣百歲健康老人。MRS培養(yǎng)基、Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術有限公司；膽鹽、鄰苯三酚、鄰二氮雜菲、鐵氰化鉀等，阿拉丁試劑（上海）有限公司；微生物生化鑒定管，杭州微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型），天根生化科技有限公司；PCR擴增引物，大連寶生物技術有限公司。

1.2 主要儀器設備

ECLIPSE 80i電子顯微鏡，日本Nikon公司；Biometra TGradient梯度PCR儀，德國Biometra公司；EC3 310凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP公司；UV2600型紫外分光光度計，島津企業(yè)管理（中國）有限公司；HVE-50自動高壓滅菌器，日本Hirayama公司；SWCJ-2FD超潔凈工作臺，江蘇蘇凈集團公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集及菌株分離

采集新鮮糞便裝入含50%甘油溶液的無菌管中，置于含生物冰袋的泡沫箱中暫存并盡快運回實驗室。將樣品分別稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-55個梯度。取各稀釋度樣品100μL均勻涂布于含1%CaCO3的MRS培養(yǎng)基中，37oC有氧、無氧條件下倒置培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落生長形態(tài)、溶鈣圈大小及顏色的不同，挑取具有明顯特征的菌落編號并劃線純化，獲得形態(tài)一致的單菌落。挑選可能的乳酸菌菌株進行革蘭氏染色觀察及3%H2O2接觸酶反應，選擇革蘭氏陽性且H2O2接觸酶反應呈陰性的菌株，50%甘油中-80oC保存。

1.3.2 菌株的過氧化氫耐受能力分析

參照張俊等[12]的方法并稍作修改，將菌株（體積分數(shù)3%）接種于H2O2濃度為1 mmol/L的MRS液體培養(yǎng)基中，37oC恒溫震蕩培養(yǎng)24 h，稀釋涂布平板法計算活菌數(shù)，并按公式(1)計算細菌的存活率?？瞻捉M不添加H2O2同樣處理作為對照。

A1：實驗組活菌數(shù)；

A2：空白組（無H2O2）活菌數(shù)。

1.3.3 菌株的耐酸、耐膽鹽能力分析

菌株的耐酸、耐膽鹽能力測定參照周晏陽等[13]的方法，將菌液（體積分數(shù)2%）分別接種于pH=3.0（0.5 mol/L HCL溶液調整）和0.3%牛膽鹽（質量分數(shù)）的MRS液體培養(yǎng)基中，37oC恒溫培養(yǎng)3 h，稀釋涂布平板法計算活菌數(shù)，并按公式（1）計算細菌的存活率。

A1：實驗組活菌數(shù)；

A2：空白組（無HCL及膽鹽）活菌數(shù)。

1.3.4 菌株不同組分的制備

參照陳明[14]的方法制備菌株的不同組分。菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，37oC培養(yǎng)24 h，4 000 g離心10 min，分別收集上清液和菌體。上清液再次經(jīng)8 000 g離心5 min，0.22μm微孔濾膜過濾后得到發(fā)酵上清液(Fermentation Supernatants，F(xiàn)S)。所得的菌體用無菌水洗滌2～3次，調整密度為1×109CFU/mL，將其平均分為2部分，1部分作為菌體細胞 (Intact Strains，IS)；另1部分中加入溶菌酶（1 mg/mL），37oC培養(yǎng)30 min，隨后在冰浴條件下超聲破碎(250 W，超聲5 s，間隔10 s，共10 min)，8 000 g離心10 min，收集上清液，0.22μm微孔濾膜過濾，得到無細胞提取物（Cell Free Extracts，CFE）。

1.3.5 DPPH自由基清除能力分析

吸取1 mL樣品，加入2 mL的DPPH無水乙醇溶液（0.2 mmol/L）混勻，室溫避光靜置30 min，8 000 g離心10 min，測定上清液在517 nm的吸光度值[15]。DPPH自由基清除率計算公式為：

A0：等體積無水乙醇代替待測樣品，同樣處理測得的吸光度值。

A1：實驗組吸光度值。

A2：等體積無水乙醇代替DPPH溶液，同樣處理測得的吸光度值。

1.3.6 超氧陰離子自由基（O2·）清除能力分析

取3.4 mL Tris-HCl溶液（50 mmol/L，pH=8.2）、0.5 mL鄰苯三酚溶液（50 mmol/L），加入1 mL樣品，混合均勻后放入25oC的培養(yǎng)箱反應4 min，隨后加入0.1 mL的HCL溶液（8 mol/L）終止反應，測定其在325 nm的吸光值[16]。O2·清除率計算公式為：

A0：等體積的水分別代替待測物和鄰苯三酚，同樣處理測得的吸光度值。

A1：等體積的水代替待測樣品，同樣處理測得的吸光度值。

A2：等體積的水代替含鄰苯三酚，同樣處理測得的吸光度值。

A3：實驗組吸光度值。

1.3.7 羥自由基（·OH）清除能力分析

取1 mL的鄰二氮雜菲（2.5 mmol/L），加入1 mL的PBS（pH=7.4）和0.5 mL樣品，混勻后加入1 mL的FeSO4溶液（2.5 mmol/L），隨后加0.5 mL的H2O2（20 mmol/L），37oC水浴1 h，檢測其在536 nm波長處的吸光度值[17]?！H清除率計算公式為：

A0：等體積水代替待測樣品，同樣處理測得的吸光度值。

A1：等體積水分別代替待測樣品和H2O2，同樣處理測得的吸光度值。

A2：實驗組吸光度值。

1.3.8 總還原力的測定

取0.5 mL鐵氰化鉀（質量濃度1%）、0.5 mL PBS溶液（pH=7.4）和0.5 mL各組分樣品，混勻后置于50oC水浴20 min，加入0.5 mL三氯乙酸（質量濃度10%），4 000 g離心10 min。吸取上清液，和FeCl3溶液（質量濃度0.1%）等體積混合，檢測其在700 nm波長處的吸光度值[18]?？傔€原力的計算公式為：

A0：PBS代替待測樣品，同樣處理測得的吸光度值。

A1：實驗組吸光度值。

1.3.9 篩選乳酸菌菌株的鑒定

1.3.9.1 菌株的生理生化鑒定

按照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[19]和《伯杰細菌鑒定手冊》[20]等文獻方法，采用生化鑒定管在37oC下測定菌株的碳水化合物發(fā)酵模式。

1.3.9.2 菌株的16S rDNA測序及同源性分析

試劑盒方法提取細菌基因組DNA，隨后進行16S rDNA片段的PCR擴增。反應體系30μL：基因組DNA模板3μL，上游引物27F 3μL，下游引物1492R 3μL，ddH2O 6μL，Taq master mix 15μL。反應體系放入PCR儀進行擴增，反應步驟為：變性溫度94oC，1 min、復性溫度55oC，1 min、延伸溫度72oC，1 min；循環(huán)30次。

將擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，將目的基因片段條帶清晰的樣品送華大基因科技有限公司進行測序。將測序結果在NCBI網(wǎng)站通過BLAST的方法將各個菌株的基因序列進行比對，通過MEGA 7.0軟件使用Test Neighbor-Joining Tree的方法進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建[21]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每組實驗重復3次，表示為平均值±標準差。采用Excel 2010、SPSS 26.0分析處理數(shù)據(jù)。利用ANOVA進行顯著性分析（Duncan檢驗，p＜0.05）。

2 結果與討論

利用MRS瓊脂培養(yǎng)基對腸道微生物進行初步篩選，得到表面光滑、邊緣完整、革蘭氏染色陽性，且H2O2接觸酶反應陰性的菌株17株。對其進行耐酸、耐膽鹽及過氧化氫耐受能力分析，初篩具有一定腸道耐受能力的抗氧化菌株，結果如表1所示。

表1 酸、膽鹽、過氧化氫對分離菌株存活率的影響 %

乳酸菌在氧化脅迫條件下，通常會分泌過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等抗氧化酶類，以減輕氧化脅迫對菌株的損傷，提高菌株在氧化應激條件下的存活率，因此過氧化氫抗性可用來初篩抗氧化菌株[16]。在含有1 mmol/L H2O2的MRS培養(yǎng)基中，37oC培養(yǎng)24 h后，不同乳酸菌的存活率為29.68%～84.46%，菌株間H2O2耐受性有較大差異。

耐酸、耐膽鹽能力是益生菌能否順利到達腸道，發(fā)揮益生作用的基礎條件，菌株間生物酶、脂肪酸的種類、含量不同，以及代謝途徑的差異性，導致菌株間

2.1 分離菌株的酸、膽鹽、過氧化氫耐受能力

耐酸、耐膽鹽能力的差異[22-23]。在pH=3條件下，17株菌株的存活率為14.07%～59.19%；而在含0.3%牛膽鹽的液體培養(yǎng)基中，菌株的存活率為2.26%～36.74%。考慮菌株的H2O2耐受能力（存活率＞60%）及酸、膽鹽耐受性[14]，選擇XM-LS01、XM-BL01、XC-EF05、XJLC03、XJ-LL02等5株菌，進一步分析其抗氧化特性。

2.2 分離菌株的DPPH清除能力

為探究各菌株抗氧化活性的差異性及其根源，根據(jù)文獻方法[14]，將篩選出的5株乳酸菌分別處理，可得到發(fā)酵上清液（CFS）、菌體細胞（IS）和無細胞提取物（CFE）。

1,1二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）是一種穩(wěn)定的自由基，在乙醇溶液中呈紫紅色，能夠捕捉自由基清除劑的單電子，顏色變淺，其OD517吸光度值變化可反映被檢測物質抗氧化能力的強弱，廣泛應用于體外抗氧化評價[24]。各菌株不同組分的DPPH清除能力如圖1所示。

圖1 分離菌株的DPPH清除率

從圖1可以看出，5株菌都有一定的DPPH自由基清除能力，不同菌株、同一菌株不同組分之間的DPPH自由基清除能力不同，XM-LS01、XM-BL01菌株具有更強的DPPH自由基清除能力。5株分離菌株的發(fā)酵上清液、菌體細胞、無細胞提取物的DPPH清除能力分別為70.45%～89.73%、30.70%～52.17%和9.23%～20.09%，同一菌株DPPH自由基清除能力依次為發(fā)酵上清液＞菌體細胞＞無細胞提取物（p＜0.05）。張開屏等[25]研究了6株乳桿菌發(fā)酵上清液和菌體細胞對DPPH自由基的清除能力，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵上清液的DPPH自由基清除能力為73.04%～87.37%，是菌體細胞的11.06倍。乳酸菌具有DPPH自由基清除能力可能和菌體分泌的胞外多糖有關，且和胞外多糖的數(shù)量呈現(xiàn)出明顯的正相關性[26]。

2.3 分離菌株的羥基自由基（·OH）清除能力

羥基自由基（·OH）是重要的活性氧物質之一，具有極強的氧化能力，能夠增強細胞膜通透性，損傷DNA和多糖分子，造成細胞損傷。本研究分析了5株乳酸菌的發(fā)酵上清液（CFS）、菌體細胞（IS）和無細胞提取物（CFE）對羥基自由基的清除能力，結果如圖2所示。

從圖2中可知，5株菌都有一定的羥基自由基清除能力，不同菌株、同一菌株不同組分之間的羥基自由基清除能力不同，XM-LS01、XM-BL01菌株具有更強的羥基自由基清除能力。5株分離菌株發(fā)酵上清液、菌體細胞、無細胞提取物的羥基自由基清除能力分別為20.73%～35.28%、28.43%～63.54%、和35.17%～66.17%。同一菌株的菌體細胞和無細胞提取物的羥基自由基清除能力無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但均顯著高于發(fā)酵上清液（P＜0.05），表明5株菌株的羥基自由基清除能力主要來自于菌體表面及菌體細胞內物質，而不是來自于菌株生長過程中的代謝產(chǎn)物。有研究表明，乳酸菌能夠和Cu2+、Fe2+等金屬離子鰲合，減少羥基自由基的產(chǎn)生，但具體的鰲合機制還有待進一步研究[27]。

圖2 分離菌株的羥基自由基清除率

2.4 分離菌株的超氧陰離子自由基（O·2）清除能力

超氧陰離子自由基（O2·）經(jīng)金屬離子催化后，發(fā)生Fenton反應，生成高活性的羥基自由基，引發(fā)體內脂類過氧化，加速機體衰老過程。5株分離菌株對超氧陰離子自由基清除能力如圖3所示。

圖3 分離菌株的超氧陰離子自由基清除率

如圖所示，5株菌均有一定的超氧陰離子自由基清除能力，但不同菌株之間、同一菌株不同組分之間的超氧陰離子清除能力有差異，XM-LS01、XM-BL01菌株具有更強的超氧陰離子自由基清除能力。5株菌發(fā)酵上清液、菌體細胞、無細胞提取物的超氧陰離子自由基清除能力分別為73.46%～88.95%、22.22%～34.03%和32.52%～53.55%。同一菌株的超氧陰離子自由基清除能力依次為：發(fā)酵上清液＞菌體細胞＞無細胞提取物（P＜0.05），表明菌株超氧負離子清除能力主要來自于代謝產(chǎn)物中。乳酸菌生長過程中，代謝產(chǎn)生的各種氧化酶類，如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶，使其具備了清除超氧陰離子自由基的能力[28]。

2.5 分離菌株總還原力

總還原力測定是反映抗氧化物質提供電子能力大小的重要指標之一，5株分離菌株的總還原能力如圖4所示。

圖4 分離菌株的總還原力

如圖4所示，不同菌株、同一菌株不同組分間的總還原力有差異，XM-LS01、XM-BL01菌株具有更高的還原能力。5株菌發(fā)酵上清液、菌體細胞、無細胞提取物的總還原力為30.47%～51.86%、19.96%～43.82%和11.03%～23.62%。同一菌株中，總還原力依次為：發(fā)酵上清液＞菌體細胞＞無細胞提取物。菌株的總還原力可能源自菌體中的抗氧化成分及代謝產(chǎn)物中的蛋白質，而超聲破碎會導致部分細胞內抗氧化成分失活[26,29]。

2.6 高抗氧化菌株的生理生化鑒定

將DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基清除能力及總還原力較強的XM-LS01、XM-BL01菌株菌株進行生理生化鑒定。

XM-LS01和XM-BL01菌株革蘭氏反應陽性，H2O2接觸酶實驗陰性，糖發(fā)酵結果如表2所示，參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細菌鑒定手冊》，XM-LS01與清酒乳桿菌鑒定特征接近，XM-BL01與動物雙歧桿菌特征接近。

表2 XM-LS01和XM-BL01菌株的生理生化鑒定結果

（續(xù)表2）

2.7 高抗氧化菌株的16S rDNA測序及同源性分析結果

提取2株待測菌的基因組DNA，用16S rDNA通用引物（27f/1492r）進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖如圖5所示?？芍? 500 bp左右出現(xiàn)條帶，且無明顯拖尾，表明PCR擴增成功，可用于后續(xù)分析。

圖5 XM-LS01和XM-BL01菌株的PCR擴增電泳圖

在NCBI數(shù)據(jù)庫中，將堿基序列進行BLAST比對，利用MEGA7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹進行同源性分析，結果如圖6所示。

XM-LS01與Lactobacillus sakei subsp.sakei strain DSM 20017的同源性為99.64%，16S rDNA基因序列比對中，屬于同一個屬的最小同源性為92.10%，屬于同一物種的最小同源性為99.21%，結合生理生化鑒定結果，可以判定菌株為清酒乳桿菌。XM-BL01與Bifidobacterium animalis subsp.lactis strain YIT 4121的同源性為99.58%，16S rDNA基因序列比對中，屬于同一個屬的最小同源性為91.76%，屬于同一物種的最小同源性為98.34%，結合生理生化鑒定結果，可以判定菌株為動物雙歧桿菌。

圖6 XM-LS01和XM-BL01菌株的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結論

從健康百歲老人糞便中分離出17株菌株，通過酸、膽鹽和H2O2耐受性分析，得到5株高耐受性乳酸菌。以DPPH清除能力、羥基自由基清除能力、超氧陰離子清除能力和總還原力為指標，分析5株菌不同組分的抗氧化能力可知，不同菌株、同一菌株不同組分之間的抗氧化能力不同，無細胞提取物的羥基自由基清除能力較高，而發(fā)酵上清液有更強的DPPH自由基清除能力、超氧陰離子清除能力和總還原能力。通過形態(tài)學、生理生化和16S rDNA鑒定分析，抗氧化活性較高的XM-LS01和XM-BL01菌株分別為清酒乳桿菌和乳雙歧桿菌。