包秋華，王麗娜，張雨虹，彭江英，馬學(xué)波

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018）

0 引言

干酪乳桿菌Zhang（Lactobacillus casei Zhang，Lb.casei Zhang）是從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中分離篩選的一株具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的益生菌，經(jīng)研究表明該菌株具有改善腸道菌群、拮抗致病菌、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、預(yù)防治療腫瘤等益生功能，是我國(guó)完成的第一株乳酸菌基因全序列測(cè)序的菌株，目前已經(jīng)發(fā)表該菌株的相關(guān)研究論文178篇，是研究比較深入的益生菌，目前已經(jīng)在乳制品、醫(yī)藥以及養(yǎng)殖等領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用[1-5]。乳酸菌在生產(chǎn)和應(yīng)用過程中，不可避免的要經(jīng)歷低溫、低酸、寡營(yíng)養(yǎng)、光照及輻射強(qiáng)度等不利條件。在這些逆境條件下細(xì)胞表面和內(nèi)部成分均會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)菌活力下降，部分乳酸菌能進(jìn)入VBNC態(tài)(Viable but non-culturable，VBNC)[6-9]。VBNC態(tài)的細(xì)菌會(huì)發(fā)生許多新陳代謝的變化，包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)臏p少、大分子合成的減少以及呼吸速率降低等，進(jìn)入VBNC狀態(tài)后的細(xì)菌不能在常規(guī)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)分裂，但保留了細(xì)胞完整形態(tài)，并有呼吸、蛋白質(zhì)合成、基因轉(zhuǎn)錄等低的代謝活性[9-11]。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)之后新興的一門組學(xué)技術(shù)，是能通過對(duì)生物體代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性定量分析進(jìn)而揭示生命活動(dòng)現(xiàn)象和過程的重要技術(shù)[12]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）是代謝組學(xué)常用的分析方法之一，具有高效和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，適用于各種復(fù)雜樣品微量成分的分離和分析[13]。與其它組學(xué)相比，代謝組學(xué)的優(yōu)勢(shì)在于基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的微小變化會(huì)在代謝物上放大。本實(shí)驗(yàn)以Lb.casei Zhang VBNC態(tài)和正常態(tài)為研究對(duì)象，利用超高效液相色譜-質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)對(duì)Lb.casei Zhang兩種狀態(tài)下的差異代謝物進(jìn)行測(cè)試和比較分析，從代謝組學(xué)層面揭示該菌株進(jìn)入VBNC態(tài)后的代謝特性，為進(jìn)一步探索Lb.casei Zhang在逆境條件下的生存機(jī)理提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器

1.1.1 菌株來源

Lb.casei Zhang是由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種庫(kù)保藏和提供。

1.1.2 材料與試劑

甲醇、乙腈，CNW科技公司；乙酸銨，Sigma公司；氨水，F(xiàn)isher Chemical；MRS液體培養(yǎng)基，Oxoid公司；超純水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

1.2 方法

1.2.1 Lb.casei Zhang的誘導(dǎo)和活化

將Lb.casei Zhang接種到液體MRS培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)18～24 h，按2%的接種量活化至第3代，測(cè)得此時(shí)的培養(yǎng)基p H為3.8±0.1，趨于穩(wěn)定。將處于對(duì)數(shù)期的Lb.casei Zhang三代菌液在4℃條件下進(jìn)行低溫低pH誘導(dǎo)（本文略），得到Lb.casei Zhang VBNC態(tài)，將其編號(hào)為L(zhǎng)CZ 1。將正?；罨腖b.casei Zhang三代菌液編號(hào)為L(zhǎng)CZ2。

1.2.2 樣品的制備與檢測(cè)

移取兩種樣品各100μL至2 mL EP管中，分別加入400μL提取液（v甲醇：v乙腈=1∶1），含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物），渦旋混勻30 s，超聲10 min（冰水?。?將樣品放在-40℃靜置1 h后，在4℃條件下，12 000 rpm離心15 min，取上清液于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測(cè)。

該實(shí)驗(yàn)使用Vanquish (Thermo Fisher Scientific)超高效液相色譜儀，通過Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm,1.7μm)液相色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。液相色譜A相為水相，含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水，B相為乙腈。樣品盤溫度：4℃，進(jìn)樣體積：3μL。

Thermo Q Exactive HFX質(zhì)譜儀能夠在控制軟件（Xcalibur，Thermo）控制下進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)如下。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

初中學(xué)生的升學(xué)率不僅僅是教師和學(xué)校關(guān)注的問題，很多家長(zhǎng)也認(rèn)為應(yīng)試教育是最適合初中學(xué)校采用的教學(xué)方法。特別是對(duì)于地理科目來說，許多家長(zhǎng)并不十分重視學(xué)生在地理科目方面的發(fā)展，認(rèn)為學(xué)生只需要在考試之前將知識(shí)點(diǎn)進(jìn)行背誦和記憶，考試中拿到高分即可，并不需要在地理科目中花費(fèi)較多的時(shí)間，而是應(yīng)該將精力放在學(xué)習(xí)語(yǔ)文、數(shù)學(xué)、英語(yǔ)等主要的科目上。同時(shí)，很多家長(zhǎng)也并沒有正確認(rèn)識(shí)到不同學(xué)生之間存在的差異，也并不關(guān)心學(xué)生是否能夠從各個(gè)方面進(jìn)行全面發(fā)展，而是只關(guān)心學(xué)生的考試成績(jī)和學(xué)生是否能夠考到重點(diǎn)的高中。在這種情況下，教師如果要應(yīng)用差異教學(xué)方法來進(jìn)行地理科目的教學(xué)，就會(huì)面臨著來自家長(zhǎng)以及其他方面的較大的壓力。

將原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mz XML格式后，使用自主編寫的R程序包（內(nèi)核為XCMS）進(jìn)行峰識(shí)別、峰提取、峰對(duì)齊和積分等處理，然后與BiotreeDB(V2.1)自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋，算法打分的Cutoff值設(shè)為0.3。將原始數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后導(dǎo)入在線分析軟件MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析(Orthogonal partial least squarediscriminate analysis，OPLS-DA)。依據(jù)OPLS-DA模型的變量投影重要性指標(biāo)（Variable importance in the projection，VIP）≥1、P＜0.05及變化倍數(shù)（Folder change，F(xiàn)C）＞2的方法篩選顯著差異代謝物。

表1 質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 Lb.casei Zhang VBNC態(tài)和正常態(tài)色譜圖分析

本研究利用LC-MS代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)干酪乳桿菌Zhang的VBN C態(tài)和正常態(tài)兩種細(xì)胞代謝物進(jìn)行檢測(cè)分析并在正離子、負(fù)離子模式下分別對(duì)樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，在正離子和負(fù)離子模式下分別檢測(cè)到874個(gè)和368個(gè)代謝物。圖1和圖2分別顯示了Lb.casei Zhang VBNC態(tài)和正常態(tài)在正離子和負(fù)離子模式下的總離子流圖。

由圖1和圖2可知，色譜峰基線平穩(wěn)，保留時(shí)間的重現(xiàn)性較好，表明本研究所使用的方法是穩(wěn)定可靠的，穩(wěn)定性和重復(fù)性都很好，適用于本試驗(yàn)樣品的測(cè)定。另外，從圖1和圖2中還可以看出，Lb.casei Zhang VBNC態(tài)和Lb.casei Zhang正常態(tài)兩種細(xì)胞狀態(tài)代謝物的色譜峰數(shù)量、離子強(qiáng)度和色譜峰的保留時(shí)間等方面都存在明顯的差異。

圖1 正離子模式下Lb.casei Zhang VBNC態(tài)和正常態(tài)總離子流圖

圖2 負(fù)離子模式下Lb.casei Zhang VBNC態(tài)和正常態(tài)總離子流圖

2.2 Lb.casei Zhang VBNC態(tài)和正常態(tài)OPLS-DA圖分析

為了獲得兩組之間主要差異的相關(guān)代謝物信息，本研究利用多元變量統(tǒng)計(jì)分析軟件Simca 14.1對(duì)兩種細(xì)胞狀態(tài)下Lb.casei Zhang的代謝組進(jìn)行了有監(jiān)督的正交偏最小二乘法-判別分析(Orthogonal partial least square-discriminate analysis，OPLS-DA)。正離子模式和負(fù)離子模式下的OPLS-DA結(jié)果見圖3。

圖3 Lb.casei Zhang VBNC態(tài)和正常態(tài)OPLS-DA圖分析

從圖3兩組OPLS-DA圖中可以看出，在正離子和負(fù)離子兩種模式下，Lb.casei Zhang VBNC態(tài)（LCZ1）和正常態(tài)（LCZ2）兩組間分離效果較好。在正離子模式下R2Y為1，Q2為0.984；在負(fù)離子模式下，R2Y為1，Q2為0.991。在多元統(tǒng)計(jì)分析建模時(shí)，R2Y表示Y軸方向模型的累積解釋率，可以理解為Y軸方向保留原始數(shù)據(jù)信息百分比的平方，Q2代表模型的累積預(yù)測(cè)率，R2Y和Q2這兩個(gè)值＞0.5為好，越是接近1表明該模型越理想，對(duì)樣本具有較好的解釋率和預(yù)測(cè)率[14]。本試驗(yàn)中R2Y和Q2均接近1，說明本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膮^(qū)分程度和預(yù)測(cè)程度都較好。

為了防止檢測(cè)結(jié)果為假陽(yáng)性，進(jìn)一步對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行置換檢驗(yàn)（Permutation test）分析。置換檢驗(yàn)隨機(jī)置換了200次。分離模型用原始的數(shù)據(jù)來證明所有置換值都是合適的，正、負(fù)離子模式下的置換檢驗(yàn)圖見圖4所示。

圖4 Lb.casei Zhang VBNC態(tài)和正常態(tài)的置換檢驗(yàn)圖分析

從圖4兩組置換檢驗(yàn)圖中可以看出，原始值與置換值以及R2和Q2之間的關(guān)系，并用回歸直線表示，其截距是衡量過度擬合的指標(biāo)，該實(shí)驗(yàn)兩個(gè)模型的Q2的斜率值大于R2的斜率，證明了數(shù)據(jù)不存在假陽(yáng)性，說明模型穩(wěn)健，結(jié)果可信度高。

2.3 Lb.casei Zhang VBNC態(tài)和正常態(tài)細(xì)胞的差異代謝物的篩選

對(duì)數(shù)據(jù)預(yù)處理后得到的正離子和負(fù)離子模式下的874個(gè)和368個(gè)代謝物，應(yīng)用MetaboAnalyst 5.0在線分析軟件進(jìn)行對(duì)Lb.casei Zhang VBNC態(tài)和正常態(tài)的細(xì)胞代謝物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理與分析。隨后根據(jù)OPLS-DA模型的變量投影重要性指標(biāo)（Variable importance in the projection，VIP）≥1并結(jié)合P＜0.05及變化倍數(shù)（Folder change，F(xiàn)C）＞2的篩選原則，并通過數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)鑒定得到了24個(gè)主要差異代謝物，具體差異代謝物見表2。

表2 Lb.casei Zhang VBNC態(tài)和正常態(tài)細(xì)胞的主要差異代謝物

從表2可以看出，Lb.casei Zhang VBNC態(tài)和正常態(tài)兩種細(xì)胞狀態(tài)下篩選出的24個(gè)主要差異代謝物分為氨基酸類、糖類、維生素類、脂肪酸類、短肽類和嘌呤類共6類，這些相關(guān)代謝物的變化代表了干酪乳桿菌Zhang在由正常態(tài)進(jìn)入VBNC態(tài)過程中的生理化學(xué)變化。

2.4 主要差異代謝物的分類分析

2.4.1 氨基酸類

從表2可以看出，Lb.casei Zhang VBNC態(tài)與正常態(tài)細(xì)胞的代謝物相比，主要氨基酸差異代謝物有8種，其中Lb.casei Zhang VBNC態(tài)中色氨酸、牛磺酸、L-組氨酸、L-酪氨酸、賴氨酸和蛋氨酸6種氨基酸均低于正常態(tài)細(xì)胞，說明Lb.casei Zhang正常態(tài)細(xì)胞在誘導(dǎo)進(jìn)入VBNC態(tài)過程中為了滿足生長(zhǎng)和存活需要不斷消耗氨基酸，導(dǎo)致代謝物差異物顯著性減少。另外，Lb.casei Zhang VBNC態(tài)中L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺二種氨基酸含量高于正常態(tài)細(xì)胞。L-天冬酰胺由天冬氨酰合成酶消耗ATP并轉(zhuǎn)化成L-天冬氨酸產(chǎn)生的[15]。L-谷氨酰胺主要通過谷氨酰合成酶和谷氨酸脫氫酶轉(zhuǎn)化而成。在逆境脅迫的條件下，氨基酸大量積累可以起到細(xì)胞保護(hù)的作用[16]，因此推測(cè)Lb.casei Zhang VBNC態(tài)中L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺增多在一定程度上可能對(duì)逆境條件下干酪乳桿菌Zhang起著保護(hù)作用。

2.4.2 糖類

從表2可以看，Lb.casei Zhang VBNC態(tài)與正常態(tài)兩種狀態(tài)下的主要糖類差異代謝物有4種，其中VBNC態(tài)細(xì)胞的海藻糖顯著性高于正常態(tài)細(xì)胞。海藻糖是生物體對(duì)于外部環(huán)境變化所形成的一種典型的應(yīng)激代謝物，保護(hù)機(jī)體抵抗外部惡劣環(huán)境，且有些微生物對(duì)外界惡劣環(huán)境，如干旱、高溫、寒冷、高滲透等，所表現(xiàn)出來的抗逆性和它們體內(nèi)存在有海藻糖密切相關(guān)[17]。本研究的Lb.casei Zhang在低溫低pH下能存活的VBNC態(tài)細(xì)胞內(nèi)海藻糖升高的結(jié)果與上述觀點(diǎn)一致。海藻糖對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用是海藻糖中的羥基代替水分子，通過氫鍵與生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、糖類、脂類等大分子物質(zhì)結(jié)合，從而穩(wěn)定并保持大分子的結(jié)構(gòu)和功能[18]。此外，也有研究表明，海藻糖的保護(hù)作用還可能源于其四面體氫鍵合水的重構(gòu)作用，這種作用能夠使水分子之間氫鍵的強(qiáng)度得到加強(qiáng)[19]，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用。由此推測(cè)Lb.casei Zhang在低溫低pH下海藻糖的變化也有類似作用。此外，Lb.casei Zhang VBNC態(tài)與正常態(tài)細(xì)胞相比，葡萄糖、D-木酮糖和古洛塘等3種代謝物低于正常態(tài)，說明Lb.casei Zhang正常態(tài)細(xì)胞在低溫低pH逆境條件下進(jìn)入VBNC態(tài)過程中消耗了這3種糖類物質(zhì)，導(dǎo)致代謝差異物顯著性減少。

2.4.3 維生素

從表2可以看出，Lb.casei Zhang VBNC態(tài)與正常態(tài)細(xì)胞相比，主要維生素類差異代謝物有3種，其中吡哆醛和生物素顯著性下降，脫硫生物素顯著性上升。維生素是參與生物生長(zhǎng)發(fā)育和代謝所必需的一類微量有機(jī)物質(zhì)，在物質(zhì)的代謝中有重要作用，例如，吡哆醛，核黃素與尼克酰胺等是乳酸菌的重要生長(zhǎng)因子[20]。脫硫生物素是合成生物素所必須的前體物質(zhì)，轉(zhuǎn)化過程中硫原子由生物素合成酶的Fe-S簇提供[21]。有研究表明當(dāng)維生素含量低于最佳狀態(tài)會(huì)抑制乳酸菌生長(zhǎng)，這是由于培養(yǎng)過程中微生物代謝以及冷藏過程中維生素的化學(xué)分解所造成的[22]。因此，這很好的解釋了干酪乳桿菌Zhang在低溫低pH誘導(dǎo)后進(jìn)入VBNC態(tài)過程中吡哆醛和生物素含量下降的主要原因。

2.4.4 脂肪酸

從表2可以看出，Lb.casei Zhang VBNC態(tài)與正常態(tài)細(xì)胞相比，主要脂肪酸差異代謝物有3種，棕櫚油酸（C16∶1）、16-羥基棕櫚酸和十六碳-7-烯酸3種物質(zhì)均顯著性上升。梅邇藍(lán)[23]等人報(bào)道了Lb.casei Zhang在人工胃液的低酸脅迫下，細(xì)胞膜脂肪酸組成發(fā)生了變化，不飽脂肪酸的相對(duì)百分含量高于飽和脂肪酸，推測(cè)該菌在低pH下通過改變膜脂肪酸的組分和含量來減少逆境對(duì)細(xì)胞的損傷。本實(shí)驗(yàn)中棕櫚油酸（C16∶1）和十六碳-7-烯酸均為不飽和脂肪酸，其升高的原因可能也是Lb.casei Zhang在低溫低酸VBNC誘導(dǎo)過程中的細(xì)胞膜脂肪酸的組成和含量發(fā)生了變化的應(yīng)激反應(yīng)。吳重德[24]等也證明了干酪乳桿菌Zhang適應(yīng)性進(jìn)化菌株（pH 4.3 MRS培養(yǎng)基中連續(xù)傳代70 d）在酸脅迫條件下，細(xì)胞膜脂肪酸種類及含量會(huì)發(fā)生了變化，不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比率（UFA/SFA，不飽和度）增加，同時(shí)還通過增加脂肪酸鏈長(zhǎng)度等，來減少由逆境脅迫引起的對(duì)細(xì)胞造成的傷害，提升耐酸性。以上關(guān)于干酪乳桿菌Zhang在不同酸脅迫下脂肪酸變化的結(jié)論也很好地論證了本實(shí)驗(yàn)干酪乳桿菌Zhang VBNC中不飽和脂肪酸增加的原因。

2.4.5 短肽和嘌呤類

從表2可以看，Lb.casei Zhang VBNC態(tài)與正常態(tài)細(xì)胞相比，甘氨酰-L-酪氨酸、甘氨酰-L-纈氨酸和L-丙氨酰-L-亮氨酸等3種短肽代謝物是增加的。短肽具有一定的生理活性，包括抗氧化、降血糖等作用[25]。另外，本研究中Lb.casei Zhang VBNC態(tài)與正常態(tài)相比，鳥嘌呤和黃嘌呤呈顯著性增加的趨勢(shì)。嘌呤是細(xì)胞中最豐富的代謝物種，對(duì)于提供細(xì)胞能量及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)起著十分重要的作用。干酪乳桿菌可以分解嘌呤和嘧啶作為生長(zhǎng)的碳源、氮源和能源，在分解腺嘌呤過程中，腺嘌呤被腺嘌呤脫氨酶分解為次黃嘌呤，進(jìn)一步被分解為黃嘌呤，為L(zhǎng)b.casei Zhang VBNC態(tài)的生長(zhǎng)代謝提供了一定的條件。

3 結(jié)論

本研究采用LC-MS技術(shù)對(duì)Lb.casei Zhang正常態(tài)和VBNC態(tài)的代謝組進(jìn)行比較分析。通過多元變量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)合單變量統(tǒng)計(jì)分析，共篩選并鑒定得到包括海藻糖、吡哆醛、脫硫生物素等在內(nèi)的24種主要差異代謝物，其中Lb.casei Zhang VBNC態(tài)與正常態(tài)相比，有L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、棕櫚油酸和鳥嘌呤等12種代謝物呈顯著性上升的趨勢(shì)，有賴氨酸、葡萄糖、生物素等12種主要差異代謝物呈下降的趨勢(shì)（P＜0.05），這些差異代謝物的變化不僅為L(zhǎng)b.casei Zhang VBNC態(tài)的生存代謝提供一定的條件，也為探索Lb.casei Zhang VBNC態(tài)在逆境條件下的存活機(jī)理提供了一定的參考。