陳靜 葉暉 朱艷

宮頸癌是最常見的侵襲性婦科癌癥之一，是全球女性癌癥相關(guān)死亡的重要原因[1,2]。診斷和治療技術(shù)的進(jìn)步極大改善了宮頸癌患者的治療。然而，由于宮頸癌的高度侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，晚期癌癥患者的預(yù)后仍然很差[3]。此外，缺乏有效的篩選生物標(biāo)志物和技術(shù)導(dǎo)致宮頸癌診斷不佳[4]。因此，了解宮頸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制，并開發(fā)出新的治療策略來治療該病至關(guān)重要。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)與許多疾病有關(guān)，尤其是腫瘤[4]。LncRNA PITPNA反義RNA 1(PITPNA antisense RNA 1，PITPNA-AS1)是新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，位于染色體17p13.3，在宮頸癌中高表達(dá)，并通過靶向miR-876-5p/c-MET軸調(diào)節(jié)宮頸癌的細(xì)胞周期和凋亡[5]。但LncRNA PITPNA-AS1對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用尚不清楚。競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)理論的提出加快了人們對(duì)LncRNA的探索，LncRNA通過ceRNA調(diào)節(jié)微小RNA(MicroRNA，miRNA/miR)的表達(dá)[6]。miR-491-3p是已報(bào)道的腫瘤抑制因子，在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤[7]、骨肉瘤[8]中低表達(dá)，并抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本研究的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，這表明LncRNA PITPNA-AS1可能通過miR-491-3p與宮頸癌進(jìn)展相關(guān)。因此，本研究LncRNA PITPNA-AS1在宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的功能和機(jī)制進(jìn)行考察，為宮頸癌新療法的開發(fā)提供新的啟示。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌細(xì)胞系(HeLa、SiHa、Caski)、宮頸上皮永生化細(xì)胞H8(上海雅吉生物公司)，siRNA陰性對(duì)照(si-NC)、siRNA LncRNA PITPNA-AS1(si-LncRNA PITPNA-AS1)、miR-491-3p mimics、miR-491-3p inhibitors(anti-miR-491-3p)、mimics/inhibitors陰性對(duì)照(miR-NC/anti-miR-NC)、pcDNA、pcDNA-LncRNA PITPNA-AS1(廣州RiboBio)，Revert AidTM Frist Strand cDNA試劑盒(加拿大Fermentas)，RIPA緩沖液、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗(美國(guó)Sigma-Aldrich)，BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(美國(guó)Promega Corporation)，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(Cell Counting Kit-8，CCK-8；日本Dojindo公司)，Matrigel(美國(guó)EMD Millipore)，pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告載體、Dual-Glo熒光素酶測(cè)定試劑盒(美國(guó)Promega)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 宮頸癌細(xì)胞HeLa、SiHa、Caski、宮頸上皮永生化細(xì)胞H8均維持在補(bǔ)充有10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培養(yǎng)基中，并保持在37℃，5% CO2的濕潤(rùn)氣氛中。將未處理的宮頸癌細(xì)胞HeLa設(shè)為對(duì)照(NC組)。根據(jù)Lipofectamine 2000試劑的說明，在宮頸癌細(xì)胞HeLa中轉(zhuǎn)染si-NC(si-NC組)、si-LncRNA PITPNA-AS1(si-LncRNA PITPNA-AS1組)、miR-NC(miR-NC組)、miR-491-3p mimics(miR-491-3p組)、pcDNA(pcDNA組)、pcDNA-LncRNA PITPNA-AS1(pcDNA-LncRNA PITPNA-AS1組)、si-LncRNA PITPNA-AS1和anti-miR-NC(si-LncRNA PITPNA-AS1+anti-miR-NC組)、si-LncRNA PITPNA-AS1和anti-miR-491-3p(si-LncRNA PITPNA-AS1+anti-miR-491-3p組)。轉(zhuǎn)染48 h后收獲細(xì)胞。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p表達(dá) TRIzol試劑(每1×106細(xì)胞1 ml)用于提取細(xì)胞總RNA。溶解后，使用Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit結(jié)合特異性引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA(2.5 μl)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后使用Revert AidTM Frist Strand cDNA試劑盒擴(kuò)增cDNA。記錄每個(gè)樣品的閾值(Ct值)，并使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH(對(duì)于LncRNA)或U6(對(duì)于miRNA)。引物序列如下所示：LncRNA PITPNA-AS1：5’-GCAGGGTGGATAAAGAGGA-3’(正向)和5’-CCT

ACTGACAGGATGTCCT-3’(反向)；miR-491-3p：5’-’-ATGCAAGATTCCCTTCTACAAA-3’(正向)和5’-CAT

GATCAGCTGGGCCAAGA-3’(反向)；GAPDH：5’-GAA

GGTGAAGGTCGGAGT-3’(正向)和5’-GAAGATGGTG

ATGGGATTTC-3’(反向)；U6：5’-CTCGCTTCGGCAGC

ACA-3’(正向)，5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(反向)。

1.4 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloprotease，MMP)-2、MMP-9蛋白表達(dá) 用RIPA緩沖液裂解每組宮頸癌細(xì)胞HeLa。使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。通過10% SDS-PAGE分離總共50 μg/泳道蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。然后在室溫下用脫脂乳在Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液(Tris buffered saline with Tween，TBST)中將膜封閉1 h。將膜與抗CyclinD1、MMP-2、MMP-9一抗和抗β-actin一抗(均為1∶1 000)在4℃下過夜。然后，將膜用TBST緩沖液洗滌，用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔抗體(1∶10 000)在室溫保持2 h。使用Pierce ECL Western印跡底物可視化蛋白條帶。蛋白質(zhì)水平通過β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并使用ImageJ軟件評(píng)估條帶密度。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將宮頸癌細(xì)胞HeLa以2×103個(gè)細(xì)胞/孔的量接種在96孔板上，每組3孔。使用CCK-8在48 h時(shí)測(cè)量細(xì)胞增殖。向每個(gè)孔中總共加入10 μl CCK-8(5 mg/ml)。在37℃溫育4 h后，在450 nm處測(cè)定吸光度A值。

1.6 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 將宮頸癌細(xì)胞HeLa在無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，以5×104細(xì)胞/100 μl的密度接種到未涂(遷移測(cè)定)或預(yù)先涂有(侵襲測(cè)定)Matrigel膠(37℃放置2 h)的24孔Transwell板上層隔室中。下腔室裝有500 μl RPMI-1640培養(yǎng)基，其中添加了10% FBS。在37℃下孵育24 h后，將穿過膜的細(xì)胞在室溫下用75%甲醇固定15 min，然后在用0.1%結(jié)晶紫染色15 min。在Nikon光學(xué)顯微鏡下觀察侵襲細(xì)胞。

1.7 雙熒光素酶活性檢測(cè) 用LncBase Predicted v.2軟件預(yù)測(cè)LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p的結(jié)合區(qū)域。將含有miR-491-3p結(jié)合位點(diǎn)的LncRNA PITPNA-AS1-野生型(WT)片段插入pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告載體中以產(chǎn)生LncRNA PITPNA-AS1(WT)。將突變型(MUT)LncRNA PITPNA-AS1片段插入pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告載體，合成LncRNA PITPNA-AS1(MUT)。為了進(jìn)行報(bào)告基因檢測(cè)，將宮頸癌細(xì)胞HeLa接種到24孔板中，24 h后將上述報(bào)告質(zhì)粒與miR-491-3p mimics或miR-NC一起使用Lipofectamin 2000共轉(zhuǎn)染到宮頸癌細(xì)胞HeLa中。溫育48 h后，收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，通過Dual-Glo熒光素酶測(cè)定試劑盒來測(cè)量相對(duì)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況 宮頸癌細(xì)胞系HeLa、SiHa、Caski中LncRNA PITPNA-AS1表達(dá)水平均比宮頸上皮永生化細(xì)胞H8高，miR-491-3p表達(dá)水平均比宮頸上皮永生化細(xì)胞H8低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。選擇差異最顯著的宮頸癌細(xì)胞HeLa進(jìn)行后續(xù)研究。見表1。

表1 LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況

2.2 LncRNA PITPNA-AS1低表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖、遷移和侵襲 在宮頸癌細(xì)胞HeLa中低表達(dá)LncRNA PITPNA-AS1，與NC組比較，si-NC組LncRNA PITPNA-AS1、CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平、細(xì)胞增殖、遷移和侵襲均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而si-LncRNA PITPNA-AS1組LncRNA PITPNA-AS1、CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平比NC組低，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲數(shù)量也低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 LncRNA PITPNA-AS1低表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖、遷移和侵襲

圖1 LncRNA PITPNA-AS1低表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa遷移，侵襲以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平(結(jié)晶紫染色×100);A Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲;B Western Blot檢測(cè)CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

2.3 miR-491-3p抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖、遷移、侵襲 在宮頸癌細(xì)胞HeLa中過表達(dá)miR-491-3p，miR-491-3p組miR-491-3p表達(dá)水平比miR-NC組高，但CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平、細(xì)胞增殖、遷移和侵襲數(shù)量均比miR-NC組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 miR-491-3p抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖、遷移、侵襲

圖2 miR-491-3p抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa遷移、侵襲以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白質(zhì)表達(dá)水平;A Transwell檢測(cè)下?lián)苓w移和侵襲(結(jié)晶紫染色×100)；B Western Blot檢測(cè)CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)

2.4 LncRNA PITPNA-AS1靶向miR-491-3p，調(diào)控miR-491-3p的表達(dá) miR-491-3p和 LncRNA PITPNA-AS1靶向結(jié)合在LncBase Predicted v.2軟件中預(yù)測(cè)。miR-491-3p組LncRNA PITPNA-AS1(WT)報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性比miR-NC組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，miR-491-3p組與miR-NC組LncRNA PITPNA-AS1(MUT)報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。miR-491-3p表達(dá)水平在pcDNA-LncRNA PITPNA-AS1組中低于pcDNA組，在si-LncRNA PITPNA-AS1組中卻高于si-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3，表4、5。

圖3 LncBase Predicted v.2對(duì)miR-491-3p和 LncRNA PITPNA-AS1結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)示意圖

表4 miR-NC或miR-491-3p與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測(cè)

表5 qRT-PCR檢測(cè)miR-491-3p的表達(dá)

2.5 anti-miR-491-3p逆轉(zhuǎn)LncRNA PITPNA-AS1低表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖、遷移、侵襲的抑制作用在宮頸癌細(xì)胞HeLa中同時(shí)低表達(dá)miR-491-3p和LncRNA PITPNA-AS1，si-LncRNA PITPNA-AS1+anti-miR-491-3p組miR-491-3p表達(dá)水平比si-LncRNA PITPNA-AS1+anti-miR-NC組低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平、細(xì)胞增殖、遷移和侵襲數(shù)量高于si-LncRNA PITPNA-AS1+anti-miR-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6，圖4。

表6 anti-miR-491-3p逆轉(zhuǎn)LncRNA PITPNA-AS1低表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖、遷移、侵襲的抑制作用

圖4 anti-miR-491-3p逆轉(zhuǎn)LncRNA PITPNA-AS1低表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa遷移、侵襲以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平的抑制作用;

3 討論

越來越多的研究表明，LncRNA的異常表達(dá)與各種人類癌癥的進(jìn)展密切相關(guān)。例如，lncRNA FTH1P3通過靶向miR-145在宮頸癌中起促癌因子的作用[9]。LncRNA PTENP1通過抑制miR-106b抑制宮頸癌進(jìn)展[10]。資料顯示，Sun等[11]在肝癌組織中觀察到LncRNA PITPNA-AS1的升高，然后證明過表達(dá)LncRNA PITPNA-AS1通過miR-876-5p/WNT5A途徑可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)。LncRNA PITPNA-AS1在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，LncRNA PIPTNA-AS1沉默通過靶向miR-32-5p抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[12]。LncRNA PITPNA-AS1可通過miR-129-5p/HMGB1軸促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移[13]。盡管以前的研究表明，LncRNA PITPNA-AS1過表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用[5]，但仍缺乏關(guān)于LncRNA PITPNA-AS1對(duì)宮頸癌轉(zhuǎn)移作用的探索，因此需要進(jìn)一步分析。這項(xiàng)研究與此前的數(shù)據(jù)一致，LncRNA PITPNA-AS1在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)明顯上調(diào)。本研究首次表明，低表達(dá)LncRNA PITPNA-AS1可顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，低表達(dá)LncRNA PITPNA-AS1的宮頸癌細(xì)胞增殖和相關(guān)蛋白CyclinD1、MMP2、MMP9表達(dá)被抑制?？傮w而言，這些研究表明LncRNA PITPNA-AS1可能起癌基因的作用，并有利于宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。

LncRNA作為海綿發(fā)揮調(diào)節(jié)miRNA的作用[14]。本研究生物學(xué)預(yù)測(cè)后，發(fā)現(xiàn)LncRNA PITPNA-AS1與miR-491-3p之間存在緊密聯(lián)系。miR-491-3p在宮頸癌細(xì)胞系中低表達(dá)，并與LncRNA PITPNA-AS1表達(dá)相反，暗示miR-491-3p可能由LncRNA PITPNA-AS1介導(dǎo)。這個(gè)假設(shè)已通過雙熒光素酶活性檢測(cè)得到了驗(yàn)證。在用si-LncRNA PITPNA-AS1處理的宮頸癌細(xì)胞HeLa中，miR-491-3p被促進(jìn)，而pcDNA-LncRNA PITPNA-AS1處理后，其表達(dá)被抑制，這表明LncRNA PITPNA-AS1可以充當(dāng)miR-491-3p海綿，負(fù)向調(diào)控miR-491-3p。此前研究表明，miR-491-3p與多種癌癥有關(guān)，例如肝癌、結(jié)腸癌[15,16]。miR-491-3p在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中下調(diào)，miR-491-3p抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、增殖，并損害了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖。miR-491-3p在15對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào)。miR-491-3p的過度表達(dá)增強(qiáng)了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡，并顯著抑制了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。相反，miR-491-3p抑制劑導(dǎo)致相反的結(jié)果[7]。miR-491-3p在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)經(jīng)常降低，其表達(dá)的恢復(fù)抑制了骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[8]?？梢?，miR-491-3p是腫瘤的抑制因子。本研究揭示了過表達(dá)miR-491-3p可以減弱宮頸癌細(xì)胞中的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，與前人研究相吻合[17]。此外，anti-miR-491-3p逆轉(zhuǎn)了si-LncRNA PITPNA-AS1對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖、遷移、侵襲的抑制作用，表明LncRNA PITPNA-AS1通過靶向miR-491-3p發(fā)揮在宮頸癌中發(fā)揮作用。

總之，本研究表明，LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p參與宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過程。LncRNA PITPNA-AS1加速宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，機(jī)制與靶向miR-491-3p有關(guān)。這些結(jié)果可能為宮頸癌提供潛在的治療目標(biāo)和策略，以阻礙宮頸癌的進(jìn)展。