王麗娜，賀顯晶，蔣劍成，汪鋒鋒，肖佳薇，蔣凱，趙鵬宇，王天碩，于思雯，畢欄，郭東華

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319）

牛壞死桿菌（bovine Fusobacterium necrophorum）是革蘭氏陰性厭氧多形性細菌，無芽孢、鞭毛，不產(chǎn)生莢膜，常駐于動物和人的口腔和消化道，是一種機會性病原體，常與壞死性感染有關[1]。它的毒力因子主要包括白細胞毒素、溶血素、內(nèi)毒素、血凝素、黏附因子等[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，牛壞死桿菌在牛子宮內(nèi)膜炎和牛乳房炎的感染中參與廣泛，嚴重影響牛的生產(chǎn)性能[3]。牛壞死桿菌病給養(yǎng)殖業(yè)帶來的損失，是畜牧業(yè)有待解決的重大問題，因此，對牛壞死桿菌感染相關蛋白的結(jié)構(gòu)和免疫原性的研究，對牛壞死桿菌病的防治具有深遠意義。

外膜蛋白（outer membrane protein，OMPs）是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，其不僅有維持細菌結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)物質(zhì)運輸?shù)壬飳W功能，還作為毒力因子發(fā)揮黏附宿主細胞和逃避宿主防御機制的作用[4-5]。在2013 年，Sun D 參考具核梭桿菌外膜蛋白FomA 的核苷酸序列，首次在牛壞死桿菌中鑒定出一個大小為43 kDa 的外膜蛋白，并將其命名為43K OMP，隨后發(fā)現(xiàn)其與壞死桿菌同屬其他梭菌成員的外膜蛋白相似，廣泛存在于牛壞死桿菌不同分離菌株中[6]。2014年，Kumar 等[7]進一步驗證了43K OMP 的存在，并發(fā)現(xiàn)其有黏附牛血管內(nèi)皮細胞（EJG 細胞）的功能。前期研究發(fā)現(xiàn)，43K OMP 可激起小鼠的體液免疫和細胞免疫[8]，且截短表達的43K OMP 基因片段中位于19-108aa 和283-377aa 的兩個重組蛋白有較好的免疫原性[9]，提示其可以作為牛壞死桿菌基因工程疫苗的候選抗原。但目前，有關該蛋白的空間結(jié)構(gòu)、理化特性、細胞表位等信息尚不明確，因此實驗利用生物信息學方法對該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)，B 細胞表位等進行預測，為該蛋白的功能研究及基因工程疫苗研制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基因、蛋白質(zhì)序列號及主要試劑

牛壞死桿菌43K OMP 的基因及蛋白Gen Bank登陸號分別是JQ740821.1 和AFJ54023.1。HRP-山羊抗兔IgG 購自Biosharp 公司；碳酸氫鈉購自天津市登峰化學試劑廠；無水碳酸鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；TMB 單組份顯色液購自Biosharp 公司；43K OMP 兔多克隆抗體來自黑龍江八一農(nóng)墾大學獸醫(yī)分子病理學實驗室；兔陰性血清來自黑龍江八一農(nóng)墾大學獸醫(yī)分子病理學實驗室。

1.2 理化性質(zhì)分析

應用Prot Param（https：//www.expasy.org/resources/protparam）在線軟件，分析43K OMP 氨基酸序列的理化性質(zhì)。

1.3 跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽和磷酸化位點預測

應用TMHMM（http：llwww.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線軟件預測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線軟件分析 蛋 白 的 信 號 肽；Net Phos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在線軟件預測43K OMP 的磷酸化位點。

1.4 親水性、可及性和柔韌性預測

用ExPASy（http：//www.expasy.ch/tools/protscale.html）在線軟件中的ProtScale 工具，對43K OMP 進行Hopp&Woods 親水性預測、Janin 表面可及性預測、Karplus 柔韌性預測，預測時分別選擇參數(shù)"Hphob./Hopp & Woods"、"% accessible residues" 和"Average flexibility"提交后獲取結(jié)果。

1.5 二級結(jié)構(gòu)預測

利用DNA Star 軟件分析43K OMP 的二級結(jié)構(gòu)。

1.6 三級結(jié)構(gòu)預測

利用I-TASSER（https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）在線軟件預測43K OMP 的三級結(jié)構(gòu)。

1.7 B 細胞表位預測

用BepiPred（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Bepi Pred/）、Ellipro（http：//tools.immuneepitope.org/main/bcell/）在線軟件預測43K OMP 的B 細胞表位。

1.8 預測表位肽合成

根據(jù)兩種不同在線軟件預測B 細胞表位的結(jié)果，選出預測的公共區(qū)域，取位于19-108aa 和283-377aa 之間的線性B 細胞表位，依據(jù)親水性、可及性和柔韌性預測結(jié)果綜合分析，確定出預測的表位肽，同時選一個無關肽作為陰性對照，將肽段送至南京金斯瑞生物技術有限公司合成，肽濃度為4 mg，凈度≥90%。

1.9 預測表位肽ELISA 驗證

采用間接ELISA 方法：以合成的預測表位肽為包被抗原，重組蛋白多克隆抗體為一抗，HRP-山羊抗兔IgG 為二抗，鑒定預測表位肽的反應活性。首先用棋盤法篩選抗原包被濃度和抗體最佳稀釋度，取一個預測表位肽溶解于ddH2O 中，調(diào)整至不同濃度，包被ELISA 板，以不同比例稀釋的43K OMP 兔多克隆抗體，為一抗，HRP-山羊抗兔IgG 為二抗，篩選出最佳包被濃度和最佳血清稀釋比例。結(jié)果以陽性值大于等于1，陰性值小于0.2 為標準，取P/N（陽性/陰性）值最大處的抗原包被濃度和抗體稀釋度為工作濃度。按照篩選出的最佳包被濃度和適宜一抗稀釋度，用合成的肽（預測肽和無關肽）包被ELISA 板，進行ELISA 檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 43K OMP 的理化性質(zhì)

Prot Param 預測結(jié)果顯示：43K OMP 的基因共編碼377 個氨基酸，其相對分子質(zhì)量為42.927×103；理論等電點為8.74，為堿性蛋白，帶負電荷的殘基（天冬氨酸+谷氨酸）總數(shù)為50，帶正電荷的殘基（精氨酸+賴氨酸）總數(shù)為54；氨基酸組成成分見表1；43K OMP 的半衰期（哺乳動物網(wǎng)織紅細胞）為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為18.82，表明該蛋白很穩(wěn)定；脂溶性指數(shù)為64.93，總平均親水性為-0.710。

表1 牛壞死桿菌43K OMP 的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of 43K OMP of bovine Fusobacterium necrophorum

2.2 43K OMP 的跨膜區(qū)、信號肽和磷酸化位點預測結(jié)果

TMHMM、SignalP 和NetPhos 在線軟件預測結(jié)果顯示（圖1）：43K OMP 不存在跨膜區(qū)，為膜外蛋白；在1-20aa 之間存在一個信號肽區(qū)域；其氨基酸序列上共有34 個磷酸化位點，包括15 個絲氨酸磷酸化位點，10 個蘇氨酸磷酸化位點，9 個酪氨酸磷酸化位點。

圖1 43K OMP 的信號肽（A）跨膜區(qū)（B）及磷酸化位點（C）預測結(jié)果Fig.1 Signal peptide（A）transmembrane region（B）and phosphorylation site（C）prediction results of 43K OMP

2.3 43K OMP 的親水性、柔韌性和可及性預測結(jié)果

用Prot Scale 工具，對牛壞死桿菌43K OMP 基因編碼的氨基酸序列，做Hopp&Woods 親水性預測、Karplus 柔韌性預測和Janin 表面可及性預測；結(jié)果如圖2 所示：得到各氨基酸位點的預測得分，圖中紅線以上的區(qū)域為親水性區(qū)域、柔韌性區(qū)域和可及性區(qū)域；其中圖2A 為親水性預測結(jié)果閾值為0.168，親水區(qū)域包括：18-23，28-38，44-45，48-51，54-59，63-100，110-116，123-139，165-174，205-207，209-212，244-257，268-275，290-299，301-320，350-358。其中，244-257 區(qū)域親水性顯著高于其他區(qū)域。

圖2B 所示為柔韌性預測結(jié)果，其閾值為1.000，大 于 均 值 的 柔 韌 性 區(qū) 域 為：28-51，56-98，110-116，124-141，147-154，194-213，243-254，306-319，347-358。其中，243-254 區(qū)間顯著高于其他區(qū)域。

圖2C 為可及性預測結(jié)果，其閾值為5.767，大于均 值 的 可 及 性 區(qū) 域 為：12-23，53-62，69-90，93-106，121-135，147-159，186-191，240-257，267-275，291-297，311-321，325-331，353-360。其 中，121-135，240-257，69-90，311-321 這些區(qū)域顯著高于其他區(qū)域。

圖2 43K OMP 的親水性（A）、柔韌性（B）可及性（C）預測結(jié)果Fig.2 Hydrophilicity（A），flexibility（B）and accessibility（C）prediction results of 43K OMP

2.4 43K OMP 的二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果

利用DNA Star 軟件分析43K OMP 的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3 所示：其中α 螺旋主要分布于：10-24，38-53，75-83，95-102，128-132，176-181，185-195，215-225，228-237，250-300，317-323，332-344區(qū)域內(nèi)；β-折疊主要分布在：3-17，58-65，108-122，135-140，150-158，168-180，200-225，235-240，318-321，370-377 區(qū)域內(nèi)；β-轉(zhuǎn)角主要分布在：16-23，42-47，55-60，65-78，83-93，105-112，120-148，162-166，182-185，192-196，203-206，223-227，242-250，260-264，268-273，308-317，320-328，342-355，361-365 區(qū)域內(nèi)。

圖3 43K OMP 的二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果Fig.3 The secondary structure prediction results of 43K OMP

2.5 43K OMP 的三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果

用I-TASSE 在線軟件預測43K OMP 三級結(jié)構(gòu)，得到五個蛋白質(zhì)模型（見圖4），圖中紅色為α 螺旋，黃色為β 折疊，綠色為無規(guī)則卷曲，其中模型4（圖4 D）綜合評分最高，可根據(jù)模型4 預測該蛋白的構(gòu)象B 細胞表位。

圖4 43K OMP 的三級結(jié)構(gòu)Fig.4 The three-level structure prediction results of 43K OMP

2.6 43K OMP 的B 細胞表位預測結(jié)果

Bepipred 在線軟件預測的B 細胞表位結(jié)果如圖5 所示：其具體氨基酸序列及位置見表2；Ellipro 預測的線性B 細胞表位和構(gòu)象B 細胞表位具體氨基酸位點見表3 和表4，球棒模型圖見圖6 和圖7，其中黃球為預測肽的殘基，白棒為蛋白質(zhì)非表位殘基。表2、表3 和表4 中僅展示了位于190-108aa 和283-377aa 區(qū)間內(nèi)預測得到的表位。

圖7 Ellipro 預測的構(gòu)象B 細胞表位球棒模型圖Fig.7 Ball-and-stick model of conformational B cell epitope predicted by Ellipro

表4 Ellipro 預測的構(gòu)象B 細胞表位氨基酸序列Table 4 Amino acid sequences of conformational B cell epitopes predicted by Ellipro

圖6 Ellipro 預測的線性B 細胞表位球棒模型圖Fig.6 Linear B cell epitope ball-and-stick model predicted by Ellipro

表3 Ellipro 預測的43K OMP 的線性B 細胞表位氨基酸序列Table 3 Amino acid sequence of the linear B cell epitope of 43K OMP predicted by Ellipro

圖5 43K OMP 的B 細胞表位預測結(jié)果（Bepipred）Fig.5 43K OMP B cell epitope prediction results（Bepipred）

表2 Bepipred 預測的43K OMP B 細胞表位氨基酸序列Table 2 Amino acid sequence of 43K OMP B cell epitope predicted by Bepipred

2.7 預測表位肽ELISA 驗證

兩個在線軟件均預測到的氨基酸殘基匯總至表5 中，預測得到的4 個表位肽，分別命名為T1、T2、T3、和T4；此外，取信號肽區(qū)域的一段氨基酸序列作為無關對照肽命名為T0。按表5 所示的氨基酸序列合成肽段，用棋盤法篩選出最佳檢測包被濃度為20 μg·mL-1，最佳一抗稀釋度為1∶2 500，最佳二抗稀釋度為1∶1 000。用所選包被濃度和抗體稀釋度對合成表位肽進行ELISA 檢測，結(jié)果顯示：4 個預測表位肽（T1、T2、T3 和T4）均能與重組全長43K OMP 兔多克隆抗體結(jié)合，而不與兔陰性血清反應，1 個無關對照肽（T0）不能與重組全長43K OMP 兔多克隆抗體和兔陰性血清結(jié)合。說明4 個預測表位肽與一抗特異性結(jié)合，有較好的免疫反應活性。通過實驗證實了預測的表位肽T1、T2、T3、T4 為43K OMP 的線性表位。通過抗原抗體結(jié)合的親和力反應得出，預測的表位肽免疫反應活性從大到小依次是T3＞T2＞T4＞T1，由此可知T3 的免疫活性最高。

表5 預測表位肽及無關肽氨基酸序列Table 5 Prediction of amino acid sequences of epitope peptides and unrelated peptides

圖8 合成表位肽ELISA 檢測結(jié)果Fig.8 ELISA test results of synthetic epitope peptides

3 討論

牛壞死桿菌是革蘭氏陰性厭氧多形性細菌，廣泛分布于人和動物的口腔、胃腸道和泌尿生殖道，常引起人和動物的多種壞死性、化膿性疾病，在牛、羊等反芻動物中以腐蹄病和肝膿腫最為常見[10-11]。該菌有許多毒力因子，如白細胞毒素、溶血素、內(nèi)毒素、蛋白水解酶、黏附因子等[12]，這些毒力因子在細菌侵入機體、黏附宿主細胞、逃避機體天然防御以及形成壞死性感染等方面發(fā)揮著重要的作用。研究初期，人們發(fā)現(xiàn)牛壞死桿菌白細胞毒素對家兔、綿羊的白細胞和牛的外周血白細胞有很強的毒性作用[13-14]，其溶血素對白細胞也具有毒性作用，但不同物種對其敏感性不同，以兔紅細胞最為敏感[15]。所以較長一段時間人們致力于對白細胞毒素和溶血素作為亞單位疫苗和候選抗原的研究[16-17]。雖然白細胞毒素和溶血素作為疫苗候選抗原在一定程度上可以抑制壞死桿菌感染，但其免疫保護效果與臨床需求有一定的差距[18]。這些研究提示，防治牛壞死桿菌病僅依靠白細胞毒素和溶血素等毒力因子是不夠的。所以，對壞死桿菌其他功能蛋白的研究變得十分必要。

外膜蛋白是革蘭氏陰性細菌外膜的主要成分，在細菌與外界環(huán)境之間的溝通中起到橋梁作用。許多革蘭氏陰性菌的OMP 能介導細菌與宿主細胞的粘附[19]，除此之外細菌的OMP 具有免疫原性且能誘導保護性免疫反應，因此研究并開發(fā)OMP 基因工程疫苗具有十分廣闊的應用前景[21]。前期研究發(fā)現(xiàn)，壞死桿菌不同亞種間外膜蛋白有所不同，在Fnn 亞種（subsp.necrophorum）中最顯著的是大小為40 kDa 的蛋白，在Fnf 亞種（subsp.funduliforme）中最顯著的是大小為37.5 kDa 的蛋白[22]。此外，徐晶等[23]在壞死桿菌中提取了一個大小為44.5 Ku 的蛋白，并發(fā)現(xiàn)其有就較好的免疫原性。2013 年，Sun 等[8]發(fā)現(xiàn)43K OMP后，有研究人員用壞死桿菌感染重組43K OMP 免疫過的小鼠，發(fā)現(xiàn)43K OMP 對小鼠具有免疫保護作用。賀顯晶等[24]制備了43K OMP 多克隆抗體，發(fā)現(xiàn)該蛋白反應性良好。由此可知，43K OMP 在壞死桿菌感染機體的過程中發(fā)揮重要作用，由于其對機體有很好的免疫保護作用，具備成為基因工程疫苗候選抗原的條件。

生物信息學分析是生命科學研究中的重要技術，其對于感染性疾病中的病原體，宿主的整體基因信息分析，抗感染藥物的設計，疫苗的研發(fā)，個體化的預防策略等均有重要的作用。隨著生物信息學的不斷發(fā)展，其在分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、預測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、推測蛋白質(zhì)功能等方面有著不可取代的地位，目前，生物信息學分析技術已經(jīng)廣泛應用于蛋白質(zhì)抗原表位預測的研究當中[25]。蛋白翻譯后修飾也稱之為“細胞開關”，它對于不同的細胞需求而提供不同的蛋白質(zhì)角色，任何蛋白質(zhì)都需要經(jīng)過適當?shù)姆g后修飾才能表現(xiàn)出正常的生物學活性。蛋白質(zhì)磷酸化作為最重要的一種蛋白翻譯后修飾方式，參與和調(diào)控信號轉(zhuǎn)導、基因表達、細胞周期等諸多生命活動[26]。研究通過分析其理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)43K OMP 為堿性蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)較低，表明該蛋白很穩(wěn)定。此外，測出43K OMP 共有15 個絲氨酸磷酸化位點，10 個蘇氨酸磷酸化位點，9 個酪氨酸酸化位點，在1-20aa 處有一個信號肽區(qū)域，沒有跨膜區(qū)為膜外蛋白。預測出的43K OMP 基本信息為以后43K OMP 蛋白功能研究提供依據(jù)。

一般認為，疏水性殘基一般存在于蛋白內(nèi)部，而親水性殘基位于蛋白表面，因此蛋白的親水部位與蛋白抗原表位有密切的聯(lián)系，表面可及性是指氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性，柔韌性是指蛋白質(zhì)構(gòu)象中活動性較強的氨基酸殘基，也就是可塑性大的位點，容易形成抗原表位[27]。這些特性為潛在的B 細胞抗原表位選取可提供重要的參考價值。所以在蛋白質(zhì)抗原表位的預測中，選擇了那些具有較好的親水性，較強的表面可及性以及較好的柔韌性的區(qū)域?？乖砦坏姆植寂c蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)密切相關，由于α 螺旋、β 折疊是支撐蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的基本骨架，起穩(wěn)定作用，不易變形，較難嵌合抗體，一般不作為抗原表位經(jīng)分析，無規(guī)則卷曲和β 轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)松散突出，主要位于蛋白質(zhì)表面，有利于和抗體結(jié)合，成為抗原表位的可能性較大。在43K OMP 蛋白中α螺旋和β 折疊區(qū)各占總氨基酸的比例分別為44.41%和13.82%，很可能形成抗原表位的無規(guī)則卷曲和β 轉(zhuǎn)角所占比例為36.35%和5.43%。這種結(jié)構(gòu)上的優(yōu)勢提示43K OMP 很有可能具有多個抗原表位。預測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)主要有三種方法，即同源建模、穿線法、從頭預測法，其中同源建模法要求模型蛋白與預測蛋白的同源性大于等于30%，而43K OMP 與模型蛋白同源性較小，所以選用不需要模型蛋白的穿線法對該蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預測，通過I-TRISS 預測結(jié)果得到5 個模型，選取其中綜合評分較好的模型4 對蛋白質(zhì)的構(gòu)象表位進行預測，共得到10 個構(gòu)象B 細胞表位，綜合三個不同服務器預測的線性B 細胞表位預測結(jié)果取交集，并選取位于19-108aa 和283-377aa 之間的表位，共得到4 個線性B細胞表位，合成后驗證，其中預測表位肽T3 的免疫反應活性最高，且預測出的4 個表位肽，均具有反應活性，說明該蛋白不僅可以引起體液免疫還能引起細胞免疫，可作為基因工程疫苗候選因子?？傊?3K OMP 的生物信息學分析從結(jié)構(gòu)特征和抗原表位上為進一步開展蛋白功能的研究提供了理論依據(jù)，為牛壞死桿菌43K OMP 致病機制和研制疫苗提供實驗依據(jù)。

4 結(jié)論

研究利用生物信息學分析技術對牛壞死桿菌43K OMP 的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、表位進行了初步預測，發(fā)現(xiàn)43K OMP 為堿性蛋白，不存在跨膜區(qū)，含有多個磷酸化位點及多個B 細胞構(gòu)象表位及線性表位表位，驗證的4 個線性B 細胞表位均有較高的反應活性。