周桐同，郭皓，歐艷曦，張清華，袁帥，楊文欽，丁琳，藏傳剛，關(guān)宏,*

1(佳木斯大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯，154007)2(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 微生態(tài)工程技術(shù)研究中心，黑龍江 齊齊哈爾，161006)

乳清蛋白是由干酪生產(chǎn)過(guò)程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)品乳清經(jīng)過(guò)特殊工藝濃縮精制而得的一類(lèi)蛋白質(zhì)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，占比為20%，其余為酪蛋白[1]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明乳清蛋白的生物活性是因?yàn)槿榍宓鞍讛z入后經(jīng)過(guò)了消化道的降解，釋放活性多肽[2]。生物活性肽的研究已成為當(dāng)今多肽類(lèi)藥物和保健食品的研究熱點(diǎn)。從牛酪蛋白水解中提取的抗氧化肽、抗菌肽、降血壓肽、金屬螯合肽等多種活性肽已被研究[3-6]，銅離子是人體必需的微量礦物質(zhì)，且因銅離子促氧化作用導(dǎo)致其與多種發(fā)病機(jī)制有關(guān)[7]，銅離子螯合肽可用來(lái)治療因銅離子過(guò)量或過(guò)少而引起的多種疾病。缺少銅離子會(huì)造成神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病和帕金森病、特發(fā)性肺纖維化和糖尿病等[8-10]，銅離子過(guò)多會(huì)造成威爾遜病和不同形式的癌癥[11-12]。銅離子多肽是保持銅穩(wěn)態(tài)的有效工具之一[13]，銅離子多肽可作為螯合劑絡(luò)合體內(nèi)積累過(guò)多的銅離子，也可以通過(guò)銅離子多肽螯合物對(duì)缺少的金屬銅離子補(bǔ)充，銅離子多肽螯合物因?yàn)橥ㄟ^(guò)肽的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)形式，所以相比較其他金屬離子補(bǔ)充劑來(lái)說(shuō)，具有生物利用度高，降低金屬離子的促氧化作用，以及吸收性較好，穩(wěn)定性較高的優(yōu)點(diǎn)。

目前，大量的研究表明乳清蛋白源多肽具有抗氧化活性[14-15]，而乳清蛋白源多肽與銅離子進(jìn)行螯合研究較少，對(duì)乳清蛋白源銅螯合肽的活性評(píng)價(jià)更為少見(jiàn)，前期研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌A-2在脫鹽乳清粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的代謝產(chǎn)物具有抗氧化活性和抗腫瘤活性[16-18]。本文研究目的是采用銅離子固定化親和層析柱和Sephadex G-15層析柱對(duì)乳桿菌A-2的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，并對(duì)分離組分進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)，為合理開(kāi)發(fā)利用乳清蛋白，研制高附加值的產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳桿菌A-2(Lactobacillussp.A-2)，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院微生態(tài)工程技術(shù)研究中心保藏；脫鹽乳清粉D70(總蛋白12.0%，乳糖78%～84%)，Alpavit公司(Lauben，Germany)；FOCUROSE CL-6B瓊脂糖凝膠，北京慧德易科技有限責(zé)任公司；Sephadex G-15葡聚糖凝膠，GE healthcare Bio-Sciences AB公司；亞氨基二乙酸(iminodiacetic acid，IDA)、熒光素鈉鹽(fluorescein sodium salt，F(xiàn)L)、(R)-(-)-環(huán)氧氯丙烷、鄰苯二甲醛(1,2-phthalic dicarboxaldehyde，OPA)，北京百靈威科技有限公司；ABTS、2，2′-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽[2，2′-Azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH]、Trolox，Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO，USA)；蛋白非預(yù)染Marker l (4.1～66 kDa)，上海生物生工有限公司。以上試劑為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-200D搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；HDB-AB離子交換層析圖譜采集分析儀、HDB-7T電腦高靈敏度紫外檢測(cè)儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；AKTA Explorer 100全自動(dòng)蛋白層析儀，美國(guó)通用電氣公司；Safire2酶標(biāo)儀，Tecan集團(tuán)公司；JY200C電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 乳桿菌A-2培養(yǎng)基制備

1.3.1 MRS(DeMan Rogosa-Sharpe)培養(yǎng)基

大豆蛋白胨10 g，牛肉粉10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 0.2 mL，磷酸氫二鉀2 g，無(wú)水乙酸鈉5 g，檸檬酸三銨2 g，硫酸鎂200 mg，硫酸錳50 mg。加水至1 L，pH 6.0～6.5，121 ℃滅菌15 min。

1.3.2 脫鹽乳清蛋白粉培養(yǎng)基

脫鹽乳清蛋白粉50 g，碳酸鈣20 g，加水至1 L。121 ℃滅菌15 min。

1.4 菌株培養(yǎng)及代謝產(chǎn)物的制備

乳桿菌A-2經(jīng)MRS連續(xù)擴(kuò)培3次后，離心收集菌體細(xì)胞，采用等體積無(wú)菌含有10 mmol/L CaCl2的生理鹽水洗滌菌體沉淀2次，經(jīng)離心棄去上清液，利用上述生理鹽水懸浮菌體細(xì)胞，制備菌懸液，采用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處菌懸液的吸光度(A600)。接種于脫鹽乳清蛋白粉培養(yǎng)基中，使菌體終濃度為1.0 OD600/mL，于40 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，6 000 r/min離心15 min，取上清液經(jīng)真空冷凍干燥獲得凍干粉命名為乳桿菌A-2代謝產(chǎn)物。-20 ℃保存待用。

1.5 固定化親和層析柱制備

取凝膠FOCUROSE CL-6B 50 mL，經(jīng)洗滌過(guò)濾后、加入35 mL含2 g/L KBH4的1 mol/L NaOH溶液內(nèi)，再加入20 mL的(R)-(-)-環(huán)氧氯丙烷為活化劑，進(jìn)行凝膠活化，于37 ℃、250 r/min振蕩1 h。加入100 mL的NaHCO3-Na2CO3緩沖液(0.1 mol/L，pH 9.5)，20 mL 5% IDA溶液(pH 7.0)為與活化后的凝膠偶聯(lián)再與金屬離子絡(luò)合，于37 ℃、250 r/min振蕩24 h。

層析柱(1.0 cm×40 cm)洗干凈，烘干，將活化后的FOCUROSE CL-6B灌入層析柱中，用200 mmol/L CuSO4溶液(5倍柱體積的量)洗滌介質(zhì)；直至層析柱整體呈淡藍(lán)色[19]。

1.6 乳清蛋白源多肽的分離純化

1.6.1 銅離子固定化金屬親和層析柱層析

精密稱(chēng)取乳酸桿菌A-2代謝產(chǎn)物0.2 g，用5 mL 0.02 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 6.6)溶解，3 000 r/min離心3 min，重復(fù)上樣循環(huán)3次，用0.02 mol/L乙酸-乙酸鈉溶液(pH 6.6)沖洗2～3個(gè)柱體積、含1 mol/L NaCl的0.02 mol/L乙酸-乙酸鈉溶液(pH 6.6)沖洗2～3個(gè)柱體積和純凈水沖洗2～3個(gè)柱體積，流速為0.5 mL/min。采用自動(dòng)部分收集器收集分離組分，每管收集時(shí)間為10 min，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，以220 nm下檢測(cè)吸光度為縱坐標(biāo)，繪制銅離子固定化金屬親和柱層析譜圖，依次出現(xiàn)3個(gè)峰。根據(jù)出峰時(shí)間次序，命名為F1、F2、F3，采用OPA法跟蹤檢測(cè)餾分中的多肽。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果分別收集具有銅螯合活性的多肽組分，將收集的樣品經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，-20 ℃保存待用。

1.6.2 Sephadex G-15凝膠過(guò)濾柱層析

用Sephadex G-15(1.6 cm×100 cm)凝膠過(guò)濾柱分別對(duì)F1、F2、F3組分進(jìn)行脫鹽分離，用純凈水進(jìn)行洗脫，流速為1 mL/min。使用自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集，每8 mL收集1管，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，以214、280 nm下檢測(cè)吸光度為縱坐標(biāo)，繪制Sephadex G-15凝膠過(guò)濾柱層析譜圖。得到組分依次命名為F1-1、F1-2、F2-1、F2-2、F3-1、F3-2。采用OPA法跟蹤檢測(cè)餾分中的多肽。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行收集，將收集的樣品真空冷凍干燥、稱(chēng)重，-4 ℃保存待用。

1.6.3 OPA法檢測(cè)多肽組分

對(duì)銅離子固定化金屬親和層析柱層析、以及Sephadex G-15凝膠過(guò)濾柱層析進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤檢測(cè)，以確定多肽組分成分，采用OPA法[20]。取30 μL樣品加入到200 μL的OPA試劑中，混勻后于室溫下反應(yīng)2 min，通過(guò)酶標(biāo)儀在發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm下測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.7 抗氧化性測(cè)定

1.7.1 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定

采用ABTS法測(cè)定樣品的抗氧化能力[21]。利用50 mmol/L Tric-HCl(pH 7.4)緩沖液配制待測(cè)樣品溶液，經(jīng)稀釋制備不同濃度的樣品溶液。測(cè)定時(shí)，40 μL不同濃度樣品溶液分別與160 μL ABTS試劑(A734=0.80±0.1)混合，室溫條件下避光反應(yīng)，利用酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)液在734 nm處的吸光度值，反應(yīng)時(shí)間為5 min。取反應(yīng)第5 min時(shí)所測(cè)定的吸光度值進(jìn)行計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率。以50 mmol/L Tric-HCl(pH 7.4)緩沖液作為空白對(duì)照，以Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：Asample和Ablank分別為樣品溶液和空白對(duì)照溶液反應(yīng)后在734 nm處的吸光度。ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性采用各樣品溶液清除ABTS陽(yáng)離子自由基50%時(shí)的濃度，即IC50表示。

1.7.2 氧自由基清除能力測(cè)定

采用抗氧化指數(shù)(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)法測(cè)定樣品清除氧自由基能力[22]。測(cè)定時(shí)利用磷酸緩沖溶液(NaH2PO4-KH2PO4、pH 7.4)對(duì)0.1 mmol/L FL溶液進(jìn)行稀釋制成FL工作液，使其響應(yīng)值在7 000 AU左右，分別加入FL工作液80 μL、待測(cè)樣品20 μL，迅速加入200 mmol/L AAPH 100 μL后，利用酶標(biāo)儀，在37 ℃以激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)538 nm進(jìn)行連續(xù)測(cè)定，每6 min測(cè)定1次各孔熒光強(qiáng)度，測(cè)定時(shí)間一般設(shè)定在熒光衰減呈基線后為止。以Trolox為陽(yáng)性對(duì)照，相對(duì)ORAC值計(jì)算如公式(2)所示：

(1)

1.8 純化后組分分子質(zhì)量測(cè)定

采用SDS-PAGE蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測(cè)定[23]。使用15%分離膠和4%濃縮膠。將待測(cè)樣品按體積比1∶1與上樣緩沖液混合，100 ℃加熱3 min，8 000 r/min離心5 min，進(jìn)行上樣。加樣后立即開(kāi)始電泳，條件為：初始電壓為70 V，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)節(jié)電壓為120 V，電泳至結(jié)束。剝膠后置于培養(yǎng)皿中，倒入固定液固定1 h，用考馬斯亮藍(lán)染液進(jìn)行染色過(guò)夜，利用脫色液[V(甲醇)∶V(冰乙酸)∶V(水)=1∶1∶8]脫色至條帶清晰可見(jiàn)，采用凝膠成像儀掃描進(jìn)行成像處理。

1.9 銅離子螯合活性的測(cè)定

配制0.625、1.25、2.5、5、7.5、10 g/L的銅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，以純凈水為空白對(duì)照，在632 nm處測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。向盛有1 mL的組分F2-1、F3-1溶液的試管中分別加入1 mL的2 mmol/L CuSO4溶液、1 mL的10%吡啶溶液和20 μL的0.1%鄰苯二酚紫溶液。在632 nm處測(cè)定吸光度值[24]。螯合率計(jì)算如公式(3)計(jì)算：

(3)

式中：Ac表示空白對(duì)照吸光度，As表示樣品吸光度。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 乳清蛋白源銅離子螯合多肽分離純化

2.1.1 銅離子固定化金屬親和層析

固定化金屬親和層析是一種用來(lái)純化蛋白質(zhì)較好的一種方法，蛋白質(zhì)可以通過(guò)其表面上的暴露在外的一些氨基酸殘基，例如半胱氨酸、組氨酸、色氨酸，可以與金屬離子形成特異性結(jié)合位點(diǎn)，以此來(lái)達(dá)到分離效果，因本實(shí)驗(yàn)考查的目標(biāo)為具有銅離子螯合活性的乳清蛋白源多肽，故采用銅離子固定化金屬親和層析柱，對(duì)乳桿菌A-2代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離，得到具有銅離子螯合活性乳清蛋白源多肽，進(jìn)行下一步純化。結(jié)果如圖1所示。

圖1 乳清蛋白源多肽經(jīng)銅離子固定化金屬親和柱層析譜圖Fig.1 The chromatogram of whey protein peptide immobilized by copper ion on metal affinity column

由圖1可知，乳桿菌A-2代謝產(chǎn)物經(jīng)循環(huán)3次上樣，與銅離子進(jìn)行螯合，后經(jīng)乙酸-乙酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫，其未吸附上的組分為滲透峰，經(jīng)乙酸-乙酸鈉-NaCl洗脫液液洗脫下來(lái)的組分為F1，經(jīng)過(guò)純凈水，洗脫下來(lái)的組分為F2、F3。對(duì)銅離子固定化金屬親和柱層析洗脫下餾分利用OPA法每1管進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤檢測(cè)，證明3個(gè)組分均含有多肽成分。

2.1.2 Sephadex G-15凝膠過(guò)濾柱層析

經(jīng)銅離子固定化金屬親和柱層析分離后，對(duì)組分F1進(jìn)行Sephadex G-15凝膠過(guò)濾柱層析。結(jié)果如圖2所示。

圖2 組分F1經(jīng)Sephadex G-15凝膠過(guò)濾柱譜圖Fig.2 Spectrogram of component F1 over gel Sephadex G-15 column

由圖2可知，經(jīng)銅離子金屬親和層析分離后得到組分F1利用Sephadex G-15(1.6 cm×100 cm)層析柱，以超純水作為洗脫劑，流速為1 mL/min，利用OPA法對(duì)每1管餾分進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤檢測(cè)表明組分F1-1、F1-2均含有多肽成分。

經(jīng)銅離子固定化金屬親和柱層析分離后，對(duì)組分F2進(jìn)行Sephadex G-15凝膠過(guò)濾柱層析。結(jié)果如圖3所示。

圖3 組分F2經(jīng)凝膠Sephadex G-15凝膠過(guò)濾柱譜圖Fig.3 Spectrogram of component F2 over gel Sephadex G-15 gel filtration column

由圖3可知，經(jīng)銅離子金屬親和層析分離后得到F2利用Sephadex G-15(1.6 cm×100 cm)層析柱，以超純水作為洗脫劑，流速1 mL/min，利用OPA法每1管餾分進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤檢測(cè)表明組分F2-1、F2-2均含有多肽成分。

經(jīng)銅離子固定化金屬親和柱層析分離后，對(duì)組分F3進(jìn)行Sephadex G-15凝膠過(guò)濾柱層析。結(jié)果如圖4所示。

圖4 組分F3過(guò)凝膠Sephadex G-15凝膠過(guò)濾柱譜圖Fig.4 Spectrogram of component F3 over gel Sephadex G-15 gel filtration column

由圖4可知，經(jīng)銅離子金屬親和層析分離后得到F3利用Sephadex G-15(1.6 cm×100 cm)層析柱，以超純水作為洗脫劑，流速1 mL/min，利用OPA法每1管餾分實(shí)時(shí)跟蹤監(jiān)測(cè)表明2組分F3-1、F3-2均含有多肽成分。

2.2 抗氧化性測(cè)定

采用ABTS法對(duì)組分F1-1、F1-2、F2-1、F2-2、F3-1、F3-2進(jìn)行抗氧化性測(cè)定，在氧化劑存在下，ABTS被氧化為綠色ABTS陽(yáng)離子，測(cè)定其在734 nm處的吸光度，加入抗氧化劑后，綠色被減弱，吸光度會(huì)有所下降，可測(cè)定和計(jì)算樣品的總抗氧化能力。Trolox是維生素E的類(lèi)似物，可作為其他抗氧化劑總抗氧化能力的參考。并計(jì)算IC50值，結(jié)果表明組分F2-1、F3-1有良好的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力，結(jié)果如表1所示。

表1 不同樣品IC50值Table 1 IC50 values of different samples

通過(guò)SPSS軟件分析，組分F2-1與F3-1清除ABTS陽(yáng)離子自由基能力IC50值分別為(3.068±0.15)、(5.510±1.56) g/L。由表1可知組分F1-1、F1-2、F2-2、F3-2由于洗脫劑引入鹽分較多，其抗氧化活性不顯著。

ORAC表示氧自由基吸收能力，又稱(chēng)抗氧化能力指數(shù)。其原理為AAPH熱分解產(chǎn)生的過(guò)氧化氫自由基，以FL為熒光探針，觀察自由基與熒光探針相互作用后探針熒光強(qiáng)度的衰減過(guò)程。以Trolox為抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，檢測(cè)體系中各種抗氧化劑延緩探針熒光強(qiáng)度下降的能力，評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化能力。根據(jù)測(cè)定ABTS陽(yáng)離子自由基清除率結(jié)果，選擇組分F2-1、F3-1進(jìn)行ORAC測(cè)定。結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，測(cè)定相同濃度不同組分ORAC抗氧化能力，與陽(yáng)性對(duì)照Trolox比較，且計(jì)算其相對(duì)ORAC值，最終可獲得結(jié)果，組分F2-1的相對(duì)ORAC值為(1 246.59±0.72) μmol TE/g，組分F3-1的相對(duì)ORAC值為(518.83±1.15) μmol TE/g。結(jié)果表明組分F2-1、F3-1具有良好的氧自由基清除能力。

圖5 組分F2-1、F3-1熒光自然衰敗曲線Fig.5 Natural decay curves of F2-1 and F3-1

2.3 純化后組分分子質(zhì)量分布圖

經(jīng)固定化金屬離子親和柱層析以及Sephadex G-15凝膠過(guò)濾柱層析，純化后得到抗氧化活性較強(qiáng)的2個(gè)組分，分別為F2-1、F3-1，檢測(cè)2個(gè)組分分子質(zhì)量分布情況，結(jié)果如圖6所示。

1-組分α-乳白蛋白；2-β-乳球蛋白；3-F3-1；4-F2-1圖6 組分F2-1、F3-1分子質(zhì)量分布圖Fig.6 Fraction F2-1, F3-1 molecular weight distribution

如圖6所示，1、2、3、4分別為組分α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、F3-1、F2-1，已知α-乳白蛋白分子質(zhì)量為14 kDa、β-乳球蛋白分子質(zhì)量為18 kDa，由圖6可清晰看出經(jīng)分離后得的2個(gè)組分分子質(zhì)量均>5 kDa。且F2-1主要成分分子質(zhì)量分布在6.5～20 kDa，主要為小分子質(zhì)量組分，F(xiàn)3-1主要成分分子質(zhì)量分布在66～27 kDa，多為大分子組分。

2.4 銅離子金屬螯合率測(cè)定

研究表明金屬螯合肽具有抗氧化性，具有無(wú)機(jī)金屬離子所不具備的生理生化特性，肽可以阻止金屬在細(xì)胞中催化反應(yīng)的進(jìn)行，一旦絡(luò)合穩(wěn)定，鐵、銅等金屬的促氧化作用會(huì)顯著降低。

通過(guò)測(cè)定不同濃度銅標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.063 7x+0.215 6(r=0.996 9)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算組分F2-1與F3-1與銅離子螯合率分別為(59±1.45)%、(6±0.32)%。

3 結(jié)論

目前金屬螯合肽研究較多，以食源性多肽角度出發(fā)，尋找出可以與金屬離子相結(jié)合，且能夠作為金屬離子補(bǔ)充劑的多肽，解決由于缺少金屬離子或金屬離子堆積過(guò)度而導(dǎo)致的疾病具有重要意義，且金屬螯合肽具有抗氧化性，可以降低由于金屬離子因促氧化反應(yīng)。近年來(lái)無(wú)毒純天然抗氧化劑，逐漸成為熱點(diǎn)。本文采用乳酸桿菌A-2代謝產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)分離純化出具有銅離子螯合活性的組分，并且經(jīng)過(guò)ABTS法和ORAC法測(cè)定抗氧化性，組分F2-1清除ABTS陽(yáng)離子自由基能力以IC50值表示為(3.068±0.15) g/L，組分F3-1 IC50值為(5.510±1.56) g/L。組分F2-1的相對(duì)ORAC值為(1 246.59±0.72) μmol TE/g，組分F3-1的相對(duì)ORAC值為(518.83±1.15) μmol TE/g，充分表明經(jīng)純化后的乳清蛋白源銅離子螯合肽屬于安全無(wú)毒的抗氧化性物質(zhì)，可應(yīng)用于食品、藥品等應(yīng)用領(lǐng)域。但本實(shí)驗(yàn)未對(duì)組分進(jìn)行表征，有待進(jìn)一步研究。