李恬，鄧?yán)?，夏瑞，駱麗，鐘?

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(重慶市生物技術(shù)研究所有限責(zé)任公司，重慶，401121) 3(重慶熙卓食品科技有限責(zé)任公司，重慶，400050)

咖啡是世界上最受歡迎的飲料之一。它不僅風(fēng)味獨(dú)特，還具有很多健康功效，如預(yù)防早期非酒精性脂肪性肝炎、改善心血管功能、緩解認(rèn)知能力下降[1]等。這些功效與咖啡含有的多種活性成分如咖啡因、綠原酸、葫蘆巴堿等有關(guān)。其中綠原酸是一種強(qiáng)抗氧化劑，可以預(yù)防糖尿病、減輕I/R引起的肝損傷以及肺炎和胰腺炎等帶來的不良后果[2]；咖啡因?qū)χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)及新陳代謝有益，還具有顯著的抗炎效果，對(duì)于各種炎癥和自身免疫性疾病有治療作用[3]；葫蘆巴堿可以減輕炎癥、氧化應(yīng)激和腎細(xì)胞凋亡，防治骨質(zhì)疏松[4]。

咖啡的提取方法多樣，不同提取方法制備出的咖啡原液品質(zhì)也有較大差異。傳統(tǒng)提取法主要分為三大類：滴漏法、浸提法和加壓提取法。其中滴漏法和浸提法操作簡單，不需要復(fù)雜的機(jī)器，常見于日常生活中。SANCHEZ等[5]認(rèn)為滴漏咖啡的有機(jī)酸提取物低于加壓提取法制得的咖啡，但是抗氧化活性高于加壓提取法。加壓提取法制備的咖啡有很高的泡沫稠度和香氣強(qiáng)度，幾乎沒有負(fù)面風(fēng)味。且研究表明在一定條件下，加壓提取法能最有效地萃取咖啡因、葫蘆巴堿和煙酸等生物活性化合物，其總酚、咖啡因和抗氧化劑的含量顯著高于滴漏法[6-7]。有研究使用浸提法分別提取了深度烘焙和中度烘焙咖啡豆，認(rèn)為前者香氣成分含量高，后者綠原酸含量更高[8-9]。ZAMANIPOOR等[10]認(rèn)為超聲波輔助提取可顯著增加咖啡中甘油三酯、咖啡因、二萜類和關(guān)鍵揮發(fā)物的含量，有助于咖啡的風(fēng)味，但對(duì)咖啡的抗氧化性有負(fù)面影響。LOPES等[11]研究發(fā)現(xiàn),微波輔助可以顯著提升咖啡中阿拉伯半乳聚糖、咖啡因、綠原酸的提取率和抗氧化活性。

目前工業(yè)生產(chǎn)咖啡飲品大多是使用速溶咖啡粉和香精香料進(jìn)行調(diào)配，而速溶咖啡中的活性物質(zhì)如葫蘆巴堿、咖啡因、咖啡?？鼘幩岷拖銡獬煞諲-甲基吡啶和2-糠醇的含量明顯減少[12]，降低了咖啡原有的口感、香氣和健康功效。隨著人們生活水平的提高，在追求咖啡的感官品質(zhì)同時(shí)，更注重其帶來的健康功效。到目前為止，關(guān)于滴漏法和加壓提取法的研究較多，其余3種方法相對(duì)較少，且微波輔助提取法提取咖啡的感官和香氣成分的分析未見報(bào)道。本文首次采用滴漏法、浸提法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法和加壓提取法提取咖啡，系統(tǒng)比較其基本理化性質(zhì)、主要活性成分、抗氧化活性、感官品質(zhì)和香氣成分的差別，為工業(yè)生產(chǎn)感官品質(zhì)優(yōu)異，活性成分含量高且抗氧化活性強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)咖啡飲品提供理論支撐和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AA級(jí)肯尼亞咖啡豆(中度烘焙)，重慶熙卓食品科技有限責(zé)任公司；福林酚試劑、甲醇(色譜純)、水溶性維生素E標(biāo)準(zhǔn)品(Trolox)、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(GAE)、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)、葫蘆巴堿標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)、咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)、DPPH、ABTS，北京索萊寶科技有限公司；鄰二氯苯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；CM-5色差儀，日本柯尼卡美能達(dá)有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；MAS-Ⅱ PLUS常壓微波合成/萃取儀，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；EXPOBAR加壓咖啡萃取機(jī)，杭州慧百特餐飲設(shè)備有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀，中國安捷倫科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品準(zhǔn)備

將咖啡豆磨粉，過30目篩備用。固定料液比為1∶10，按照表1的方法提取咖啡原液，制備完成后過200目濾網(wǎng)，備用。

表1 不同提取方法的具體操作過程Table 1 The specific operation process of different extraction methods

1.3.2 基本理化指標(biāo)[9]

可滴定酸：準(zhǔn)確移取 10.0 mL 樣液于燒杯中，用 0.10 mol/L NaOH 溶液滴定至 pH=8.00±0.05，記錄NaOH的消耗體積數(shù)，結(jié)果以1 L消耗 0.10 mol/L NaOH 的體積數(shù)表示。

色度：用色差儀分析樣品色度值，用L*、a*、b*值分別表示樣品的亮度、紅色-綠色和黃色-藍(lán)色。

總固形物：準(zhǔn)確量取5.0 mL 樣液于90 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干至恒重，通過差量法計(jì)算得出咖啡液中總固形物含量，結(jié)果表示為1 L樣品中固形物的質(zhì)量(g/L)。

1.3.3 總酚含量測(cè)定

參考WONGSA等[15]的方法，測(cè)定咖啡原液的總酚含量。

1.3.4 綠原酸、葫蘆巴堿、咖啡因含量測(cè)定

參考TANG等[16]的方法，適當(dāng)修改如下；色譜條件：色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為1%乙酸(流動(dòng)相A)、甲醇(流動(dòng)相B)；梯度洗脫：0～5 min，6%甲醇；5～10 min，6%～20%甲醇；10～15 min，20%～40%甲醇；15～20 min，40%～6%甲醇；20～25 min，6%甲醇；流速：1.0 mL/min；柱溫：26 ℃；檢測(cè)波長：280 nm；進(jìn)樣量：5.0 μL。結(jié)果表示為1 L樣品中活性成分的質(zhì)量(mg/L)。

活性成分標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=1.440 2X-2.617 2，R2=0.999 1(葫蘆巴堿)、Y=8.959 9X-131.33，R2=0.999 2(綠原酸)、Y=11.584X+918.902，R2=0.999 8(咖啡因)。

1.3.5 抗氧化活性測(cè)定

(1)DPPH自由基清除能力測(cè)定：參考PAIVA等[17]的方法，測(cè)定樣品DPPH自由基清除能力。

(2)ABTS陽離子自由基清除能力測(cè)定：參考AYSELI等[9]的方法，測(cè)定樣品ABTS陽離子自由基清除能力。

(3)羥自由基(·OH)清除能力測(cè)定：參考YANG等[18]的方法，測(cè)定樣品·OH清除能力。

1.3.6 感官評(píng)價(jià)

感官品嘗小組由10 名接受過專業(yè)感官培訓(xùn)的評(píng)價(jià)員組成，評(píng)價(jià)員分別從外觀、氣味、口感以及風(fēng)味4個(gè)方面對(duì)隨機(jī)編號(hào)的樣品比較品嘗，總分為100 分。感官評(píng)價(jià)表見表2。

1.3.7 香氣成分測(cè)定

參考虞健[20]的方法，適當(dāng)修改如下：取3.0 mL咖啡液裝入10 mL氣相小瓶，加入10 μg/mL鄰二氯苯溶液，蓋上硅膠蓋。用DVB/CAR/PDMS 30～50 μm的萃取頭，恒溫水浴60 ℃吸附30 min后，250 ℃解析15 min。進(jìn)氣相色譜柱，溫度從40 ℃(維持5 min)，程序升溫5 ℃/min，到120 ℃。然后以10 ℃/min上升到230 ℃(維持5 min)。質(zhì)譜條件是：70 eV，50～350 aum，離子源溫度250 ℃。物質(zhì)相對(duì)含量計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：ω1：物質(zhì)的相對(duì)含量，μg/mL；ω2：內(nèi)標(biāo)物物質(zhì)的質(zhì)量濃度，μg/mL；S1物質(zhì)的峰面積；S2：內(nèi)標(biāo)物峰面積。

表2 咖啡原液感官評(píng)價(jià)表Table 2 Sensory evaluation table of coffee stock solution

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS 26.0和Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行相關(guān)性分析，Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對(duì)咖啡原液基本理化性質(zhì)的影響

如表3所示，超聲和微波輔助提取法制取的咖啡原液pH值無顯著性差異(P>0.05)，加壓提取法提取的咖啡原液pH顯著性低于其他4種方法。5種方法提取的咖啡原液pH值在文獻(xiàn)報(bào)道的咖啡pH值范圍(4.90～5.80)內(nèi)，且即使咖啡pH處于較低水平(4.90)，也可以被很好地接受[21]。

咖啡中的可滴定酸包括檸檬酸、綠原酸、蘋果酸等。如表3所示，比較5種提取方法，微波輔助提取法比其他方法提取的咖啡原液可滴定酸值低，滴漏法提取的咖啡原液可滴定酸值最高，可能是因?yàn)槠涮崛囟茸罡叩木壒省IVO等[22]在研究中測(cè)得咖啡的可滴定酸為52.00～274.00 mL(0.1 mol/L NaOH)/L(咖啡)，本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)在此范圍內(nèi)。有研究認(rèn)為pH和可滴定酸值與感知的酸度并無相關(guān)性[23]，另有研究認(rèn)為可滴定酸值與感知的酸度相關(guān)[24]，但不可否認(rèn)的是合適的酸度與良好的風(fēng)味息息相關(guān)。

咖啡原液的總固形物含量如表3所示，與微波輔助提取法和浸提法相比，滴漏法、超聲輔助提取法和加壓提取法制取的咖啡原液的總固形物含量更高。5種方法制取的咖啡原液的總固形物含量與文獻(xiàn)報(bào)道的12.20 g/L總體相差不大[25]，超聲提取法相對(duì)偏高，可能是因?yàn)槌暤目栈蜔嵝?yīng)的共同作用使基質(zhì)膨脹和細(xì)胞壁中的孔擴(kuò)大，增強(qiáng)了水和咖啡粉的接觸，從而導(dǎo)致其總固形物含量提高[26]，但是這也容易導(dǎo)致咖啡的提取過度。

表3 不同提取方法對(duì)咖啡原液pH、可滴定酸和 總固形物的影響Table 3 Effects of different extraction methods on pH, titratable acid and total solids of coffee stock solution

2.2 不同提取方法對(duì)咖啡原液色度的影響

L*表示明亮度，a*表示紅綠色，b*表示黃藍(lán)色。如表4所示，滴漏法和浸提法比其余3種方法的色度值高。這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間不同的緣故，研究表明提取時(shí)間越長，有色化合物的浸出越多，顏色就越深[27]，本實(shí)驗(yàn)除超聲輔助提取法制得的咖啡原液，其余4種方法均遵循此規(guī)律。超聲輔助提取法制得的咖啡顏色最淺，這可能歸因于其較高的甘油三酯含量[10]。有研究認(rèn)為，當(dāng)咖啡呈現(xiàn)深棕色，無顆粒懸浮物且有透明感時(shí)，更受人們喜愛[11]。

表4 不同提取方法對(duì)咖啡原液色度的影響Table 4 Effects of different extraction methods on coffee stock solution chroma

2.3 不同提取方法對(duì)咖啡原液的總酚含量的影響

如圖1所示，加壓提取法提取的咖啡原液的總酚含量顯著高于其他方法(P<0.05)，達(dá)到了(5.36±0.13) g GAE/L。超聲輔助提取法[(4.66±0.04)g GAE/L]和滴漏法[(4.60±0.14) g GAE/L]次之，微波輔助提取法[(3.20±0.09) g GAE/L]最低。本試驗(yàn)制得的咖啡原液的總酚含量與文獻(xiàn)報(bào)道相差不大，加壓提取法略高于文獻(xiàn)報(bào)道[28]。這可能是因?yàn)樵诩訅簵l件下，溶質(zhì)細(xì)胞壁被破壞，且高溫高壓有利于溶劑的擴(kuò)散，使多酚化合物的提取率更高[7]。多酚是咖啡中重要的活性物質(zhì)，在咖啡中含量頗高，如綠原酸、咖啡酸、阿魏酸。研究表明，咖啡多酚與抗阿爾茲海默癥和改善血管功能多種健康益處具有相關(guān)性。

圖1 不同提取方法對(duì)咖啡原液的總酚含量Fig.1 Effects of different extraction methods on coffee stock solution chroma total phenolic content

2.4 不同提取方法對(duì)咖啡原液的咖啡因、綠原酸、葫蘆巴堿含量的影響

咖啡中含有多種活性成分，其中綠原酸、咖啡因、葫蘆巴堿的含量較高，且對(duì)于咖啡的功能活性有很大貢獻(xiàn)。葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因的典型液相色譜圖見圖2。如表5所示，本試驗(yàn)的活性成分含量在文獻(xiàn)報(bào)道范圍內(nèi)[29]，且加壓提取法能提取出最多的生物活性物質(zhì)，與其他4種方法有顯著性差異(P<0.05)。這可能是因?yàn)槿軇┰趬毫ψ饔孟?，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部溶解活性成分，或者直接導(dǎo)致細(xì)胞破裂，活性成分暴露于提取溶劑中，有效提高了生物活性成分的提取率[22]。

1-葫蘆巴堿；2-綠原酸；3-咖啡因； A-葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖； B-咖啡原液液相色譜圖圖2 典型液相色譜圖Fig.2 Typical liquid chromatograms

表5 不同提取方法下咖啡原液的咖啡因、綠原酸、 葫蘆巴堿含量 單位：mg/L

2.5 不同提取方法對(duì)咖啡原液抗氧化能力的影響

咖啡具有良好的抗氧化能力，這也是咖啡有益健康的重要原因。如圖3所示，5種不同提取方法中，加壓提取法[(29.23±1.07) mmol Trolox/L]制得的咖啡原液DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，滴漏法[(23.23±1.11) mmol Trolox/L]、超聲輔助提取法[(23.17±0.72) mmol Trolox/L]、浸提法[(22.10±0.51) mmol Trolox/L]次之，微波輔助提取法[(18.47±0.90) mmol Trolox/L]最弱。如圖4所示，5種不同提取方法中，加壓提取法[(46.16±0.55) mmol Trolox/L]制得的咖啡原液ABTS陽離子自由基清除能力最強(qiáng)，滴漏法[(38.53±1.85) mmol Trolox/L]和超聲輔助提取法[(38.02±0.79) mmol Trolox/L]次之且無顯著性差異(P>0.05)，浸提法[(34.68±1.58) mmol Trolox/L]較弱，微波輔助提取法[(29.15±0.83) mmol Trolox/L]最弱。加壓提取法制得的咖啡原液無論是DPPH自由基清除能力，還是ABTS陽離子自由基清除能力都是最強(qiáng)的。如圖5所示，5種不同提取方法中，加壓提取法·OH 清除能力[(8.32±0.15) mmol Trolox/L]最強(qiáng)，微波提取法[(6.13±0.26) mmol Trolox/L]最弱。3種自由基清除能力測(cè)定結(jié)果相一致?？Х仍撼煞趾涂寡趸芰ο嚓P(guān)性分析如表6所示，總酚、葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因含量均與抗氧化能力呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，其中總酚與咖啡原液抗氧化能力相關(guān)性最強(qiáng)。

圖3 不同提取方法下咖啡原液的DPPH自由基清除活性Fig.3 DPPH radical scavenging activity of coffee stock solution extracted by different methods

圖4 不同提取方法下咖啡原液的ABTS陽離子 自由基清除活性Fig.4 ABTS cationic radical scavenging activity of coffee stock solution extracted by different methods

圖5 不同提取方法下咖啡原液的·OH清除活性Fig.5 ·OH radical scavenging activity of coffee stock solution extracted by different methods

表6 咖啡原液成分與抗氧化能力的相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis between components of coffee stock and antioxidant capacity

2.6 不同提取方法對(duì)咖啡原液感官品質(zhì)的影響

如圖6所示，不同提取方法制得的咖啡原液外觀無顯著性差異，加壓提取法制得的咖啡原液感官評(píng)價(jià)總分(91.0)最高，香味最好，口感潤滑但是苦味稍重；微波輔助提取法制得的咖啡原液感官評(píng)價(jià)總分(86.7)次之，酸味和苦味適中，但是香味稍差；評(píng)分最低的為超聲輔助提取法制得的咖啡原液(80.2)，咖啡顏色泛白且口感最差。

圖6 不同提取方法下咖啡原液感官評(píng)價(jià)得分Fig.6 Sensory evaluation score of coffee stock solution extracted by different methods

2.7 不同提取方法對(duì)咖啡原液揮發(fā)性香氣成分的影響

如表7所示，不同提取方法制得的咖啡原液揮發(fā)性香氣成分有較大差異，加壓提取法制得的咖啡原液香氣種類最多，超聲輔助提取法制得的咖啡原液揮發(fā)性香氣含量最多，滴漏法制得的咖啡原液香氣成分損失最嚴(yán)重。吲哚類物質(zhì)只有在滴漏法和加壓提取法制得的咖啡原液中檢測(cè)到，且低濃度吲哚具有茉莉花香氣。浸泡和超聲輔助提取法制得的咖啡原液吡嗪類物質(zhì)含量比另外3種方法高，并且大多吡嗪類物質(zhì)具有美好的香氣，如2-甲基吡嗪具有堅(jiān)果的香氣，2,5-二甲基吡嗪具有堅(jiān)果、烘烤和青草的香氣等[6]。

5種提取方法制得的咖啡原液的揮發(fā)性香氣成分也有共同點(diǎn)——呋喃類物質(zhì)種類和含量最多，分別占總揮發(fā)性香氣成分含量的78.23%、67.72%、69.62%、68.69%和62.98%，呋喃類物質(zhì)中含量最多的為糠醛和5-甲基糠醛，具有烘烤和面包的香氣，同時(shí)也是其他關(guān)鍵香味物質(zhì)的重要前體。但是在本次實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到咖啡的關(guān)鍵香氣成分——糠基硫醇，這可能是因?yàn)槠錁O易通過離子反應(yīng)和自由基反應(yīng)降解成其他含硫物質(zhì)的緣故[29]。

表7 不同提取方法下咖啡原液的揮發(fā)性香氣成分Table 7 Volatile aroma components of coffee stock solution extracted by different methods

3 結(jié)論

綜上所述，5種提取方法中，雖然滴漏法和浸提法操作最為簡單，但是滴漏法提取的咖啡原液香氣成分損失嚴(yán)重，浸提法提取的咖啡品質(zhì)較差，均不適合生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)咖啡飲品。超聲輔助提取法制得的咖啡原液顏色泛白，口感差，且容易出現(xiàn)提取過度的現(xiàn)象。微波輔助提取法制得的咖啡原液感官品質(zhì)較好，但是活性成分含量低，抗氧化活性弱，品質(zhì)最差。加壓提取法制得的咖啡原液的總酚含量和活性成分含量高、抗氧化活性強(qiáng)，品質(zhì)最優(yōu)，并且感官評(píng)價(jià)最好，香氣豐富。綜合比較5種提取方法，加壓提取法最適合作為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)咖啡飲品的方法。