樊 逸,虞旭昶,張燁濤,謝煒煜,瞿鐘情,王遠山

(浙江工業(yè)大學 生物工程學院,浙江 杭州 310014)

我國是微生物發(fā)酵大國,每年都會產生大量菌渣[1]。這些菌渣成分復雜,含有多種氨基酸、大量粗蛋白、粗脂肪、抗生素及部分代謝中間產物和微量元素等,直接填埋或焚燒不僅會對環(huán)境產生威脅,直接或間接地對人類生活造成不良影響,也會造成資源浪費。赤霉素(Gibberellic acid,GA)是一種非常重要的植物生長調節(jié)劑,被廣泛應用于農業(yè)生產和啤酒發(fā)酵等領域,主要通過藤倉赤霉菌(Gibberellafujikuroi)發(fā)酵生產[2]。全球超過90%的赤霉素原藥GA3由我國生產[3],因此,每年產生大量的赤霉素菌渣,其處理存在一定難度[4]。從生物質的資源化利用角度考慮,這些菌渣由于含有大量碳源、氮源,通過部分代替原培養(yǎng)基的成分,可以極大地降低生產成本,并有利于可持續(xù)發(fā)展。

水熱液化技術是一種常用的生物質預處理技術,是近年來的研究熱點之一[5]。在水熱液化條件下,各種原本有生物活性的小分子化合物(如抗生素等)也可能失活,采用水熱液化法處理抗生素菌渣等危險固體廢棄物,不僅可以降低其危害性,而且可以將水解液回用于原菌種的培養(yǎng)。作為水熱液化的副產物之一,水相產物雖然含有大量可以供微生物生長的碳源和氮源[6],但其具有毒性,可以抑制微生物的生長[7]。目前關于水熱液化水相的大量研究集中在如何對水相進行脫毒排放[8],將水相產物作為培養(yǎng)基的研究較少。為開發(fā)新的赤霉素菌渣處理技術,筆者首次將利用水熱液化技術處理赤霉素菌渣的水解液作為培養(yǎng)基,用于生產生物乙醇。同時,錢江生物化學股份有限公司也在嘗試利用筆者研究所得赤霉素菌渣水解液培養(yǎng)赤霉素產生菌Fusariumfujikuroi。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和菌渣

高酒酵母(SaccharomycescerevisiaeCCTCC M94055),安琪酵母股份有限公司提供;赤霉素生產菌渣(主要成分為赤霉素產生菌Fusariumfujikuroi的菌絲體),浙江錢江生物化學股份有限公司提供。

1.1.2 YPD培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基[9]:酵母粉,1%;蛋白胨,2%;葡萄糖,2%;pH自然。

1.2 儀器與設備

GY-3型攪拌水熱反應釜,海安至精石油儀器廠;MQ-3乙醇檢測模塊,優(yōu)信電子科技;SpectraMax M5酶標儀,美國Molecular Devices;Spectrumlab S23A分光光度計,上海棱光技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌渣水解液的制備

將新鮮赤霉素生產菌渣平鋪于塑料筐,在烘箱中烘干至質量不變后,用粉碎機研磨成粉末,保存?zhèn)溆谩?/p>

研究所用的水熱反應釜為間歇式反應釜,其加熱套的保溫性能較好,不能實現短時間的溫度控制。由于設備的限制,水熱反應保溫時間30 min,m(菌渣粉末)∶V(水)=1∶10(其中質量單位為g,體積單位為mL,簡稱固液比),攪拌速度為200 r/min,壓力為水在該溫度下的蒸汽壓。

1.3.2 菌體生物量測定

將菌液搖勻后,吸取200 μL于96孔板中,在600 nm處用酶標儀檢測光密度值(OD600)。與菌體生物量測定相關的實驗均設計了1個對照和3個平行,實際值為實驗組數值減去對照組得到,以OD600表示。

1.4 MQ-3乙醇傳感器的設計和使用

MQ-3是一種金屬氧化物半導體氣敏元件,空氣中乙醇的體積分數可以影響其電阻值。通過簡單的分壓電路,即可檢測出相應的乙醇質量分數。該元件靈敏度高、穩(wěn)定可靠、成本低[10],可作為簡易乙醇傳感器對發(fā)酵液進行初步判定。在封閉條件下,液體中的乙醇質量分數和氣體中的乙醇體積分數呈正比例關系,并且該傳感器的輸出電壓和氣體中的乙醇體積分數呈正相關[11]。

因此,筆者選用50 mL離心管為密閉容器,利用3D打印的蓋子將MQ-3乙醇氣體傳感器固定于離心管上,形成封閉空間,以實現乙醇質量分數的初步定量檢測。

1.4.1 乙醇傳感器檢測方法

取1 mL菌液,10 000 r/min離心10 min,取上清500 μL于50 mL離心管中,蓋緊蓋子,讓離心管內乙醇揮發(fā)一段時間達到氣液平衡。將預熱好的乙醇傳感器蓋在離心管上,傳感器會通過串口向電腦返回數據繪制成曲線,如圖1(a)所示,在短時間內即可達到最大值并保持穩(wěn)定。取出傳感器探頭后,信號曲線迅速下降,待信號恢復到“基線水平”,即可進行下一次測量。簡易乙醇傳感器裝置如圖1(b)所示,包含單片機、液晶屏和MQ-3氣體傳感器,液晶屏上的“RT”代表當前信號值,“Max”代表在檢測過程中的最大信號值,作為檢測結果。

圖1 MQ-3乙醇傳感器信號曲線和裝置圖

1.4.2 乙醇傳感器信號值和乙醇溶液真實質量分數的對應關系

為了將傳感器返回的信號值轉換為乙醇的真實質量分數,配制了不同質量分數的乙醇溶液,用乙醇傳感器對這些乙醇溶液進行測定,來確定返回值和實際質量分數之間的關系。

使用量筒量取5 mL水加入試管中,再向試管中加入不同體積的無水乙醇。用移液槍吸取1 000 μL乙醇,使用分析天平稱得其質量為0.753 g,計算得到每支試管中乙醇的質量分數,見表1。由于傳感器非常靈敏,因此在8號試管的基礎上以10倍為梯度對9,10號試管進行稀釋。從每支試管中分別取500 μL乙醇溶液轉移到50 mL離心管中,蓋上蓋子,讓離心管內乙醇揮發(fā)一段時間達到氣液平衡。將預熱好的乙醇傳感器蓋在離心管上,記錄乙醇信號值。取出傳感器,待基線走平后進行下一次測量。

表1 乙醇質量分數和傳感器信號值關系

利用MATLAB對傳感器信號值和乙醇真實質量分數進行擬合,發(fā)現在乙醇質量分數較低時傳感器信號變化幅度很大,較高時(2.9%～10.7%)則呈現出良好的線性關系(R2=0.990 8)。當總方程形式為f(x)=a×xb+c時,R2=0.991 4。該方程在較高質量分數范圍內誤差較小,在低質量分數范圍內誤差較大。由于低質量分數乙醇發(fā)酵液不是筆者的主要研究對象,為簡化計算,之后的實驗數據計算公式簡化為

E=2.941×10-29×S10.21

(1)

式中:E為乙醇的質量分數;S為乙醇傳感器返回的信號值。

2 結果與討論

2.1 水解液的生物毒性驗證

大量文獻表明:水熱液化的水相中含有大量小分子有機物,有顯著的生物毒性,且處理溫度越高,毒性越強。Nelson等[12]利用微藻水熱液化水相產物作為培養(yǎng)基,發(fā)現需要額外添加葡萄糖酵母菌才能在水解液中生長。筆者發(fā)現在170 ℃時處理的水解液已經有令人不適的刺激性氣味。為了驗證生物毒性,通過觀察酵母菌的生長情況,測試了水解液在130,150,170 ℃時的毒性。

在28 ℃下培養(yǎng)24 h后,酵母菌生長情況如圖2所示,圖中編號1～3的水解液添加量(體積分數)分別為0,50%,100%。在170 ℃處理時的水解液添加量為100%時,酵母菌菌體量和清水相近,無明顯生長跡象,表明170 ℃可能溫度過高,已經產生了大量抑制酵母菌生長的物質。在130 ℃和150 ℃的水解液中,酵母菌生長情況較好,150 ℃可能產生了少量的有毒物質,導致酵母菌生長情況較50%添加時差。

圖2 溫度和水解液添加量對S.cerevisiae CCTCC M94055生長的影響

2.2 水解條件初步探索

通過生物毒性驗證,預計(固液比和時間根據前期工作確定)在1∶10固液比,30 min保溫時間的前提下,最佳的反應溫度可能在140 ℃左右。測試了130,140,150 ℃水解條件下的水解液,以50%和100%添加量作為培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母,對照組為YPD培養(yǎng)基。每隔24 h測一次OD值,得到的生長曲線如圖3所示。

圖3 不同溫度和水解液添加量的S.cerevisiae CCTCC M94055生長曲線

每一組酵母菌都可以生長,100%水解液添加量的生長情況要優(yōu)于50%添加量,YPD組的生長情況明顯好于其他各組。當水解液添加量為50%時,150 ℃優(yōu)于140 ℃;當水解液添加量為100%時,140 ℃和150 ℃生長曲線接近,可能是150 ℃的水解液中有毒的物質抑制了酵母的生長?？紤]到減少水解液的毒性、提高水解液利用率、節(jié)約能源,后續(xù)制備水解液溫度選擇140 ℃。結果表明:在低溫條件下,菌渣水熱液化的水相產物的生物毒性并不顯著,可以直接作為培養(yǎng)基來培養(yǎng)酵母菌。

2.3 碳氮源添加研究

為了進一步驗證水解液的利用價值,筆者設計了碳源(葡萄糖)和氮源(蛋白胨)添加實驗。培養(yǎng)24 h后,結果如圖4所示。

圖4 碳源和氮源添加對S.cerevisiae CCTCC M94055生長的影響

添加碳源時,筆者研究的碳源添加量范圍內,葡萄糖添加量越大,酵母菌生長情況越好。當葡萄糖添加量為20 g/L時,酵母菌生長情況幾乎達到YPD培養(yǎng)基的水平;向水解液中添加蛋白胨時,酵母菌的生長情況并沒有明顯改變,可能是由于水解液中已經含有充足的氮源或碳源不足。以上結果說明水解液具有部分代替YPD培養(yǎng)基的潛力。

2.4 乙醇發(fā)酵研究

筆者在原有的140 ℃水解液水相的基礎上,分別以0,50,100,150,200,250 g/L的添加量向水相中添加葡萄糖。參照文獻[13]的方法,試管裝液量為5 mL,接種量為5%(250 μL),在30 ℃下培養(yǎng)約24 h后,取1 000 μL,10 000 r/min離心10 min。取上清,通過乙醇傳感器測定乙醇對應質量分數,結果如圖5所示。

圖5 葡萄糖添加量對S.cerevisiae CCTCC M94055乙醇產量的影響

筆者發(fā)現:當向培養(yǎng)基中添加300 g/L的葡萄糖時,葡萄糖并不能完全溶解,其溶解度約為275 g/L;添加250 g/L葡萄糖時,乙醇產量出現下降趨勢,其原因可能是由于此時的培養(yǎng)基已經接近飽和,較大的滲透壓抑制了酵母的生長[14];添加200 g/L左右葡萄糖時,乙醇產量達到最大,表明利用水解液取代氮源來生產生物乙醇是可行的。

2.5 乙醇發(fā)酵曲線測定

為了探究該培養(yǎng)基生成乙醇的最佳時間,選用200 g/L的葡萄糖添加量,分裝到5組試管中,每組3個平行,裝液量2 mL,接種量選用5%(100 μL)。接種后,每隔12 h左右取出1組試管(3支),吸取1 mL離心收集菌體,并測定上清中的乙醇質量分數,結果如圖6所示。

圖6 乙醇質量分數和S.cerevisiae CCTCC M94055生物量變化曲線

由圖6可知:乙醇質量分數在達到峰值前持續(xù)穩(wěn)定升高,約36 h達到最大值。乙醇質量分數達到最大值后,可能由于底物質量分數過低,產生的乙醇被酵母菌代謝[15],乙醇產量下降。從酵母菌干質量變化曲線看,前24 h酵母菌生物量增速較快,后趨于平穩(wěn),約36 h達到最大值8.3 g/L。本研究添加了約20%的葡萄糖,得到了約5.3%的乙醇產出,可能由于水解液成分復雜,對S.cerevisiaeCCTCC M94055乙醇生物合成產生了抑制。后續(xù)可以通過耐受水解液菌種篩選及其乙醇發(fā)酵工藝優(yōu)化,進一步提高水解液利用率和乙醇產量。

3 結 論

我國是微生物藥物生產大國,在生產過程中會產生大量菌渣,對菌渣的高效處理極具挑戰(zhàn)性。筆者利用低溫水熱液化技術處理赤霉素生產中產生的菌渣,所得水相產物可以作為培養(yǎng)基培養(yǎng)S.cerevisiaeCCTCC M94055,在添加適量葡萄糖后得到乙醇,同時獲得酵母菌體,初步實現赤霉素菌渣的資源化利用。雖然低溫水熱液化下菌渣水解程度較低,但是可以通過收集反應固相產物進行多次水熱液化,以提高對菌渣的利用率。本研究也為其他微生物菌渣的處理和資源化利用提供了參考。