蔡鑫磊,黃益平,胡 猛,夏 苗,樊現(xiàn)超,孫瑋晨

(中建安裝集團有限公司,江蘇 南京 210000)

我國是工業(yè)和人口大國,近3年來年均石油消耗量超6億噸,其中70%以上的原油依賴于進口,能源安全問題亟需重視。生物燃料乙醇作為交通運輸燃料已在全球范圍內(nèi)得到廣泛應用,將燃料乙醇和汽油調(diào)和制成的E10乙醇汽油不僅能在不改動汽車發(fā)動機的前提下直接使用,還因調(diào)和后的燃料汽油中氧的增加,使燃燒更為充分,防止爆燃爆缸現(xiàn)象發(fā)生,并且可以有效減少有害氣的釋放,將污染物控制在環(huán)保等級要求之內(nèi),顯著降低環(huán)境污染[1-2]。

目前,我國燃料乙醇工業(yè)化仍以玉米、甘蔗、木薯和小麥等作物為主要原料,提取這類作物中的淀粉和糖,采用發(fā)酵技術(shù)制備得到工業(yè)級乙醇[3-5]。然而該方式發(fā)酵周期較長,且菌體耐受性受環(huán)境因素影響較大,使得工業(yè)乙醇產(chǎn)率低,這些技術(shù)問題制約著工業(yè)燃料乙醇行業(yè)的快速發(fā)展。為有效解決以上問題,燃料乙醇研究人員開始密切關(guān)注細胞固定化技術(shù)[6-7]。該技術(shù)源于酶固定化技術(shù),將游離的細胞通過物理或化學的方法限制在固定空間內(nèi)以達到細胞聚集的目的[8-10]。傳統(tǒng)的工業(yè)燃料乙醇發(fā)酵制備,往往采用游離的酵母細胞間歇發(fā)酵的方式對淀粉等物質(zhì)發(fā)酵[11]?？紤]到酵母細胞處于游離狀態(tài),體系內(nèi)細胞密度相對較低,發(fā)酵效果較差,且酵母回收時需進行高速離心,容易對酵母細胞產(chǎn)生損傷,難以回收利用[12]。與傳統(tǒng)游離發(fā)酵相比,固定化發(fā)酵過程中酵母細胞被固定在一定空間范圍內(nèi),可極大地減少酵母細胞的流失,且單位體積內(nèi)酵母細胞多,對外界影響的抵抗力強,發(fā)酵效果更佳[13-14]。此外,在產(chǎn)品分離過程中,固定化酵母更容易與發(fā)酵醪液分離,可大幅提高固定化酵母的重復利用率。

1 固定化技術(shù)分類

對燃料乙醇發(fā)酵的細胞固定化方法主要有5種,分別是吸附法、包埋法、膜隔離法、交聯(lián)法和絮凝法。

1.1 吸 附 法

吸附法的原理是將載體和酵母細胞通過靜電吸附或離子鍵作用力進行結(jié)合,使酵母細胞固定在載體表面或內(nèi)部,形成一層或多層酵母細胞膜。吸附法要求載體對酵母細胞吸附能力較強且無毒害作用。固定化載體所能吸附細胞的總數(shù)目主要與溫度、pH、細胞以及載體特性等因素相關(guān)[15]。吸附法常用的載體有磷酸鈣膠、DEAE-纖維素、硅膠、硅藻土、陶瓷和塊狀甘蔗等[16-17]。

梁磊等[18]采用塊狀甘蔗作為載體固定酵母細胞來實現(xiàn)工業(yè)乙醇發(fā)酵,以達到利用甘蔗汁發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)乙醇的目的。實驗結(jié)果表明:將甘蔗塊解凍、去木質(zhì)素處理后,酵母效能大幅度提高。當甘蔗塊的填裝率為40%,固定發(fā)酵36 h時,所產(chǎn)乙醇質(zhì)量濃度可達99.34 g/L,計算可得其發(fā)酵效率高達93.09%。

1.2 包 埋 法

包埋法是通過將酵母細胞固定在多孔物質(zhì)空間中以實現(xiàn)對酵母菌固定的方法,其最大優(yōu)點是操作方便,固定化后的細胞強度高。

酵母細胞一般被包裹在固定化載體內(nèi)部,通過載體的多孔結(jié)構(gòu)獲取營養(yǎng)物質(zhì)并不斷增殖[19]。包埋法可以將酵母細胞較為嚴密地固定在介質(zhì)內(nèi)部,且該技術(shù)較為成熟,固定化酵母可循環(huán)重復利用,在生產(chǎn)中得到了廣泛的應用。包埋法常用的固定材料通常分為兩類:一類是海綿、聚氨酯泡沫塑料、沸石以及多孔陶瓷等硬性材料,另一類是海藻酸鈉、瓊脂、卡拉膠、聚丙烯酰胺等凝膠材料[20]。

王珂[21]采用海藻酸鈉包埋酵母作為固定化粒子,在含[BMIN]Cl離子液體的培養(yǎng)基中進行乙醇發(fā)酵。研究結(jié)果表明:固定化發(fā)酵所產(chǎn)生的乙醇質(zhì)量濃度高于游離發(fā)酵,且固定化酵母能重復使用至50次。

Chandel等[22]使用1 cm×1 cm野生甘蔗莖塊“原位”包埋VS3釀酒酵母進行固定化,分批測試了野生甘蔗的酶水解產(chǎn)物的發(fā)酵。VS3游離細胞和固定化細胞分批發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量分別為(19.45±0.55) g/L和(21.66±0.62) g/L。在分批重復發(fā)酵期間,固定化VS3細胞在第8個周期中表現(xiàn)出最大的乙醇產(chǎn)量(22.85±0.44) g/L,隨后在后續(xù)發(fā)酵周期中逐漸減少。

1.3 膜隔離法

膜隔離法的原理是使用無菌半透膜將需要的細胞限制在固定空間內(nèi),該半透膜可選擇性地允許基質(zhì)和產(chǎn)物通過,酵母細胞則不允許通過[23]。膜隔離法的最大優(yōu)點是操作方便,通過選擇孔徑大小來提高物質(zhì)通過的選擇性,能有效控制底物和產(chǎn)物的擴散[12]。缺點是半透膜容易發(fā)生堵塞,傳質(zhì)容易受限,生產(chǎn)成本較高,因此該方法在燃料乙醇生產(chǎn)中應用較少。

1.4 交 聯(lián) 法

交聯(lián)法的原理是通過雙官能團或多官能團的交聯(lián)劑與酵母細胞的表面基團反應,使細胞相互連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以達到將酵母細胞固定化的目的。交聯(lián)法不需要載體,可以得到較高的細胞濃度。由于交聯(lián)法是通過化學反應形成的化學鍵相連接,固定化酵母細胞間結(jié)合力高,環(huán)境耐受程度較高,可承受溫度、pH的劇烈變化[23]。然而,由于交聯(lián)反應過于劇烈,使得酵母細胞活性降低,無法再生,而且固化細胞機械強度較低。因此該方法在實際生產(chǎn)中應用較少,常與其他固定化方法結(jié)合使用[24]。

祝英等[25]使用玉米糖化醪作為發(fā)酵底物,使用交聯(lián)法、瓊脂凝膠法、海藻酸鈣凝膠法和聚乙烯醇包埋法4種發(fā)酵培養(yǎng)手段對酵母進行合理固定。實驗結(jié)果表明:將4種固定化酵母用于分批和連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)乙醇中時,交聯(lián)法的發(fā)酵效率要明顯低于其他3種方法,并且其穩(wěn)定性也相對較差。

1.5 絮 凝 法

絮凝法的原理是利用微生物間相互吸附的能力使細胞吸附形成絮凝顆粒,以此將酵母細胞固定化。該方法同樣不需要添加固定化載體,且其具有對酵母細胞的固定相對簡單、細胞代謝能力強、傳質(zhì)阻力小以及細胞壽命長等優(yōu)點。另外,絮凝法操作簡單,固定化過程中不需要添加其他化學物質(zhì),因此酵母細胞在整個生長過程中未受到外來物質(zhì)影響,有利于酵母細胞代謝目標產(chǎn)物,且不影響酵母細胞壽命。絮凝顆粒內(nèi)部松散、傳質(zhì)阻力很小,因此絮凝顆粒存在剛性較差、易變性等問題[26-27]。

Verstrepen等[28]認為細胞絮凝的原因存在兩種可能:一種是由相鄰細胞表面存在的凝集素與甘露糖結(jié)合導致;另一種可能是由于細胞表面的多肽吸引作用或者疏水作用導致絮凝。伍彥華等[29]研究了自絮凝菌株的選育,以木薯為原料,比較了3株酵母SLS、SYA、SJY和一株自絮凝酵母FJY濃醪發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的性能,結(jié)果表明:4株酵母菌株中自絮凝菌株FYJ乙醇產(chǎn)量高,耗糖能力強,發(fā)酵86 h后,乙醇體積分數(shù)達到15.7%,總殘?zhí)?.35%,副產(chǎn)物產(chǎn)量比其他3株酵母菌株低20%。

2 固定化生物反應器

目前,傳統(tǒng)的工業(yè)燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)工藝開始向連續(xù)化發(fā)酵技術(shù)轉(zhuǎn)變,主要目的是在原有工藝基礎(chǔ)上將酵母固定化技術(shù)和連續(xù)發(fā)酵相結(jié)合,從而提高工業(yè)乙醇產(chǎn)出率,其中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)就是生物反應器的選擇和工藝參數(shù)的設(shè)定。

2.1 流化床反應器

流化床反應器的主要原理是通過流體流動讓反應體系中的固定層顆粒處于懸浮運動狀態(tài)。根據(jù)反應器應用環(huán)境可將其分為兩類:固相加工和液相流體加工[30]。該反應器的最大優(yōu)點是傳質(zhì)及傳熱效率高,便于連續(xù)操作。但該類反應器對固液相要求相對苛刻,只能應用在固定化載體與發(fā)酵液密度接近的兩相反應中,其主要原因是發(fā)酵液密度過大會導致固定化細胞在整個反應體系中上浮效果不理想,反應不充分,出現(xiàn)乙醇產(chǎn)出率低的現(xiàn)象[21]。

趙玲等[31]以木薯淀粉糖化醪為發(fā)酵原料,采用海藻酸鈣包埋的固定化酵母細胞和流化床反應器進行乙醇發(fā)酵。在反應器離子填充率為30%,發(fā)酵底物初糖質(zhì)量分數(shù)為15%～17%,發(fā)酵時間為9 h條件下進行反應。發(fā)酵結(jié)束后成熟醪中乙醇體積分數(shù)為9.5%左右,殘余還原糖質(zhì)量分數(shù)不高于11%,乙醇生產(chǎn)能力穩(wěn)定在5.17～5.9 g/(L·h)。在發(fā)酵底物初糖質(zhì)量分數(shù)為24.53%,發(fā)酵時間11 h條件下,成熟醪中乙醇體積分數(shù)為12.1%,殘余還原糖質(zhì)量分數(shù)為0.91%,乙醇生產(chǎn)能力控制在6.08 g/(L·h)。

2.2 填充床反應器

填充床生物反應器主要是將固定化介質(zhì)填充進反應器內(nèi)部制成穩(wěn)定床層并通入底物溶液進行反應。該反應器的主要優(yōu)點在于返混小、結(jié)構(gòu)簡單和機械磨損率低等[21,23],適用于各種不同形狀的固定化載體和沒有固體顆粒、黏度不高的底物溶液。該反應器的不足在于在操作過程中無法對固定化介質(zhì)進行更換,因此會出現(xiàn)風溝、氣溝等現(xiàn)象,且存在傳質(zhì)及傳熱效果較差等問題。

Liu等[32]以過期大米為發(fā)酵原料,采用棉纖維吸附固定化酵母,使用具有多層填充床固定結(jié)構(gòu)和多分支循環(huán)路徑的320 t中試反應器代替典型的圓柱形固定反應器進行乙醇發(fā)酵。固定化酵母完成發(fā)酵后的乙醇體積分數(shù)和發(fā)酵效率均值分別為12.46%和83.72%,分別比游離細胞發(fā)酵高0.45%和3.2%。該發(fā)酵重復32批次,結(jié)果表明該發(fā)酵方式具有良好的重復性和長期穩(wěn)定性。

2.3 氣升式反應器

氣升式反應器是由鼓泡式反應器演化改進而來,氣源是該反應器的主要動力裝置。其原理是依靠純液體和含氣泡液體之間的密度差來完成特定路徑的流動,氣體通過流動循環(huán)來完成物質(zhì)間的反應[33]。該反應器有兩個主要的液體池,通入氣體部分為升氣管,不通入氣體部分為降液管[34]。其主要優(yōu)點是節(jié)能環(huán)保,且反應器自身可明顯降低內(nèi)部剪切應力,對固定化細胞基本不會產(chǎn)生任何破壞。

張慶文等[35]以玉米粉為原料,使用一種15 L改進型氣升式外環(huán)流反應器進行乙醇發(fā)酵,發(fā)酵48 h后,測得的乙醇體積分數(shù)高達12.8%,取樣測得殘?zhí)琴|(zhì)量濃度為3.8 g/L,與普通型氣升環(huán)流反應器相比,發(fā)酵效率得到極大的提升。

2.4 攪拌釜反應器

攪拌釜反應器是較為傳統(tǒng)的生物化學反應器,該類反應器通過機械攪拌對攪拌釜內(nèi)部物質(zhì)進行充分攪拌,以達到反應目的。雖然反應器存在攪拌裝置,混合較為充分,反應比較徹底,但由于整個過程為機械攪拌,因此當反應過程中攪拌產(chǎn)生的剪切力過大時,會對體系內(nèi)固化的細胞結(jié)構(gòu)造成一定影響,導致固定化細胞外泄[21,33]。

季更生等[36]以30 g/L葡萄糖和15 g/L木糖為原料,將兩者混合均勻后作為發(fā)酵底物加入到1.5 L的全混釜生物反應器中,對1株樹干畢赤酵母馴化菌株進行連續(xù)發(fā)酵反應,得出二級連續(xù)發(fā)酵對還原糖的利用率比一級發(fā)酵高6%的結(jié)論。

2.5 膜式反應器

膜式反應器的原理是將乙醇發(fā)酵與膜的滲透汽化進行耦合,此類反應器由于膜的比表面積相對較大,因此在整個工藝過程中催化效率也相對較高。但是膜反應器在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生濃差極化、膜污染等問題,進而導致傳質(zhì)效率下降、膜孔堵塞,不利于生產(chǎn),因此該類反應器中的膜需要定時清洗和維護[37]。

丁文武等[38]采用硅橡膠膜(PDMS)滲透汽化與酵母細胞固定床耦合發(fā)酵連續(xù)化生產(chǎn)乙醇,該系統(tǒng)能大幅度降低乙醇對細胞的抑制作用,提高乙醇產(chǎn)率。該系統(tǒng)經(jīng)378.5 h連續(xù)穩(wěn)定運行,下游產(chǎn)品產(chǎn)率最大為32%,總通量最大值為690 g/(m2·h),計算得其分離因子為7.2,分離效果較好。該系統(tǒng)PDMS膜投入使用后,發(fā)酵液內(nèi)乙醇質(zhì)量濃度由間歇發(fā)酵時的70 g/L降至43 g/L,大大減輕了乙醇對細胞的發(fā)酵作用。通過將PDMS膜與酵母固定床耦合,有效提高了生產(chǎn)效率,乙醇體積產(chǎn)率和葡萄糖發(fā)酵效率分別是游離連續(xù)發(fā)酵的2.1倍和2.5倍。

3 共固定化技術(shù)

共固定化技術(shù)的最大特點是能在同一載體內(nèi)部同時嵌入2種或2種以上的酶或細胞,從而建立一個共固定化發(fā)酵體系。這種共固定化體系能將2種不同細胞的功能同時發(fā)揮出來,以達到提高乙醇產(chǎn)率的目的[39]。該類技術(shù)的最大優(yōu)點是將混合發(fā)酵和固定化技術(shù)的優(yōu)點相結(jié)合,兼具發(fā)酵和固定雙重屬性[40-41],可有效縮短生產(chǎn)周期、提高生產(chǎn)率。使用不同原料生產(chǎn)燃料乙醇時,不同原料水解后的糖化液中不僅含有葡萄糖,還可能含有半乳糖、阿拉伯糖、麥芽糖、乳糖和木糖等多種糖分,使用單一的微生物很難將其完全代謝利用[42-43]。而利用共固定化技術(shù)使用多種細菌或真菌協(xié)同發(fā)酵能夠有效提高底物的利用效率。共固定化技術(shù)所用方法與上述固定化方法基本相同,有吸附法、包埋法和交聯(lián)法等。共固定化技術(shù)最大的優(yōu)勢是能夠合理地將固定化優(yōu)勢與多種酶或細胞的功能相結(jié)合,從而提高其選擇性[40]。與傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)相比,共固定化技術(shù)具有發(fā)酵時間短、乙醇產(chǎn)率高、可連續(xù)化生產(chǎn)等優(yōu)點,可以幫助企業(yè)節(jié)能降耗,大幅度降低燃料乙醇生產(chǎn)成本。

周志明等[44]選用海藻酸鋁凝膠作為反應體系的載體,選用木薯淀粉為反應原料,將酵母細胞和糖化酶共固定化發(fā)酵,通過同步糖化發(fā)酵的方式來制取工業(yè)乙醇。研究表明:在整個反應體系中影響轉(zhuǎn)化的主要因素有凝膠填充率、糖化酶添加量和發(fā)酵溫度等。通過正交實驗優(yōu)化反應工藝,優(yōu)化后的工藝參數(shù)為凝膠填充率50%、糖化酶添加量300 U/g、發(fā)酵溫度37 ℃、pH 4.0～4.5、料液質(zhì)量比1∶2,當醪液中乙醇體積分數(shù)為13.4%時,其淀粉利用率達到峰值90.2%。

Altuntas[45]通過對運動發(fā)酵單胞菌和葡萄糖苷酶進行共固定化來發(fā)酵生產(chǎn)乙醇,結(jié)果表明:該反應體系中98%的底物已轉(zhuǎn)化,乙醇產(chǎn)率高達7.6 g/(L·h)。Lee等[46]采用DEAE-玉米秸稈材料吸附釀酒酵母和樹干畢赤酵母進行共固定化,發(fā)酵海帶水解物生產(chǎn)乙醇,結(jié)果表明:水解物中葡萄糖和木糖完全轉(zhuǎn)化為乙醇,乙醇的產(chǎn)率為0.126 g/(L·h),比單獨使用樹干畢赤酵母發(fā)酵海帶水解物的乙醇產(chǎn)率高2.7倍。

4 結(jié) 論

細胞固定化技術(shù)的發(fā)展為傳統(tǒng)乙醇發(fā)酵行業(yè)帶來了全面的技術(shù)革新。眾多研究成果表明:固定化酵母相較于游離酵母具有明顯優(yōu)勢。雖然固定化酵母發(fā)酵乙醇具有發(fā)酵效率高、乙醇產(chǎn)率高和附加值高等優(yōu)點,但固定化載體易結(jié)垢、發(fā)酵過程中的雜菌污染等問題也制約著固定化酵母在燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)中的大規(guī)模應用。因此,今后可從構(gòu)建具有良好發(fā)酵和吸附性能的酵母菌株、開發(fā)易于糖和乙醇通過的固定化載體、構(gòu)建同步糖化發(fā)酵的共固定體系等方面進行深入研究。隨著固定化技術(shù)在燃料乙醇領(lǐng)域的深入研究及應用,固定化技術(shù)將有效地推動燃料乙醇工業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展。