張順棠,劉繼東

(蓮花健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)股份有限公司,河南 項(xiàng)城 466200)

抗氧化劑是阻止氧氣不良影響的物質(zhì),它是一類能幫助捕獲并中和自由基,從而降低自由基對(duì)機(jī)體損害的一類物質(zhì)。常用的抗氧化劑有維生素類抗氧化劑、酚系抗氧化劑、胺系抗氧化劑和含硫化合物抗氧化劑等。日本味之素公司城照雄等研究表明:谷氨酸發(fā)酵中,在培養(yǎng)基中有抗氧化劑存在的時(shí)候,可以防止菌體成分的氧化,使谷氨酸生成酶系能夠維持較長時(shí)間和較高活性,菌體細(xì)胞的老化和培養(yǎng)時(shí)間的延遲均能得到根本改善[19]。筆者在谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同比例的抗氧化劑茶多酚和硫辛酸,利用茶多酚和硫辛酸的抗氧化特性,防止谷氨酸菌體細(xì)胞質(zhì)膜及細(xì)胞壁的主要組成分磷脂質(zhì)的氧化,清除過量的自由基,減少自由基積累對(duì)菌體的氧化損傷,延緩菌體細(xì)胞衰老,延長菌體高產(chǎn)酸期持續(xù)時(shí)間。研究茶多酚和硫辛酸對(duì)谷氨酸菌體生長和產(chǎn)酸的影響,探討其合適的添加比例,以提高谷氨酸生產(chǎn)效率。

1 設(shè)備與儀器

50 L發(fā)酵罐、10 L種子罐、溫度、風(fēng)量、pH數(shù)顯自控,上海國強(qiáng)生化裝備有限公司;754分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限公司;SBA-40C生物傳感儀,山東省科學(xué)院生物研究所;振蕩培養(yǎng)箱,上海智誠分析儀器制造有限公司;ES-A標(biāo)準(zhǔn)天平,天津市德安特傳感技術(shù)有限公司;DYS-40研究型生物顯微鏡,上海點(diǎn)應(yīng)光學(xué)儀器有限公司。

2 材料與配方

2.1 主要材料

谷氨酸棒桿菌“LHWJ-19”,蓮花健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)股有限公司保藏;茶多酚,宜昌清江茗研生物科技有限公司;硫辛酸,江蘇采薇生物科技有限公司;葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏,上海天蓮精細(xì)化工有限公司;生物素,日本進(jìn)口分裝;硫酸錳、硫酸亞鐵,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;尿素、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鈉,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;玉米漿,山東西王糖業(yè)有限責(zé)任公司;糖蜜,柳州市金黔灣糖蜜有限公司。

2.2 培 養(yǎng) 基

2.2.1 斜面培養(yǎng)基

葡萄糖,20 g/dL;磷酸氫二鈉,0.12%;硫酸鎂,0.06%;玉米漿,0.25%;糖蜜,0.25%;尿素,0.6%;消泡劑,0.1%;硫酸亞鐵,2 mg/kg;硫酸錳,2 mg/kg;生物素,2 mg/kg;pH 7.0～7.2。

2.2.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖,4.0 g/dL;尿素,0.5%;硫酸鎂,0.05%;玉米漿,3.0%;磷酸氫二鉀,0.14%;硫酸亞鐵,2 mg/kg;硫酸錳,2 mg/kg;pH 7.0～7.2。

2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖,10 g/dL;磷酸氫二鈉,0.12%;硫酸鎂,0.06%;玉米漿,0.25%;糖蜜,0.25%;硫酸亞鐵,2 mg/kg;硫酸錳,2 mg/kg;生物素,2 mg/kg;pH 7.0。

3 培養(yǎng)方法

3.1 菌種活化

取保藏菌種劃線接種于活化斜面培養(yǎng)基,30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)10～12 h。

3.2 種子培養(yǎng)

利用接種環(huán)刮取斜面菌種數(shù)環(huán),接入滅菌后的搖瓶培養(yǎng)基,搖床轉(zhuǎn)速100 r/min,溫度30 ℃,培養(yǎng)8～10 h。

3.3 二級(jí)種子培養(yǎng)

種子罐培養(yǎng)基115 ℃滅菌20 min;當(dāng)溫度降低到33 ℃時(shí),接入搖瓶培養(yǎng)好的一級(jí)種子;控制溫度33.0～33.5 ℃,pH 7.0～7.1,通風(fēng)量(按通風(fēng)體積比)1∶0.15～1∶0.25,罐壓0.1 MPa,培養(yǎng)8～11 h;當(dāng)OD凈增0.45以上時(shí),將二級(jí)種子移入發(fā)酵罐。

3.4 谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵罐培養(yǎng)基初定容量10%,115 ℃滅菌20 min;當(dāng)溫度降低到34 ℃時(shí),移入種子罐培養(yǎng)好的二級(jí)種子開始發(fā)酵。

1) 溫度控制:0～6 h,34 ℃;6～12 h,35 ℃;12～18 h,36 ℃;18～24 h,37 ℃;24～28 h,38 ℃;28 h～放罐,39 ℃。

2) 轉(zhuǎn)速控制:當(dāng)OD為0時(shí),400 r/min;當(dāng)OD凈增0.2～0.25時(shí),500 r/min;當(dāng)OD凈增0.4～0.65時(shí),600 r/min;當(dāng)OD凈增0.85以上時(shí),700 r/min。

3) 通風(fēng)量控制:當(dāng)OD為0時(shí),1∶0.12～1∶0.15;當(dāng)OD凈增0.2～0.25時(shí),1∶0.20;當(dāng)OD凈增0.4～0.65時(shí),1∶0.30～1∶0.35;當(dāng)OD凈增0.85以上時(shí),1∶0.35～1∶0.45。發(fā)酵后期可根據(jù)生產(chǎn)情況適當(dāng)調(diào)整通風(fēng)量,但不能低于零時(shí)通風(fēng)量。

4) pH控制:0～2 h,pH 7.0～7.2;2～26 h,pH 7.0～6.8;26 h以后pH 6.7～6.8;放罐pH 6.4～6.7。

5) 流加糖控制:當(dāng)殘?zhí)琴|(zhì)量濃度≤3.0 g/dL時(shí)流加濃縮高糖,流加糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45 g/dL。

6) 耗糖的控制:菌株生長期每2 h耗糖4.0～6.0 g/dL;產(chǎn)酸期每2 h耗糖1.5～2.0 g/dL;發(fā)酵后期每2 h耗糖0.5～1.0 g/dL。當(dāng)耗糖過慢時(shí)可適當(dāng)降低通風(fēng)量或pH并提高溫度,當(dāng)耗糖過快時(shí)可適當(dāng)提高通風(fēng)量或pH以使發(fā)酵平穩(wěn)。

3.5 檢測(cè)方法

1) 菌體OD值檢測(cè):利用754分光光度計(jì)于600 nm測(cè)定,以蒸餾水為空白。

2) 葡萄糖液質(zhì)量濃度測(cè)定:利用SBA-40C生物傳感儀測(cè)定,吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液25 μL進(jìn)樣標(biāo)定,到標(biāo)定結(jié)束,取葡萄糖液10 μL,稀釋100倍后,取25 μL稀釋液進(jìn)樣,讀取葡萄糖的質(zhì)量濃度。

3) 谷氨酸質(zhì)量濃度測(cè)定:利用SBA-40C生物傳感儀測(cè)定。

3.6 計(jì)算方法

1) 谷氨酸質(zhì)量=谷氨酸質(zhì)量濃度×發(fā)酵液體積。

2) 葡萄糖質(zhì)量=葡萄糖質(zhì)量濃度×葡萄糖液體積。

3) 糖酸轉(zhuǎn)化率=谷氨酸質(zhì)量÷葡萄糖質(zhì)量×100%。

4 結(jié)果與討論

4.1 添加茶多酚對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響

茶多酚又稱茶單寧、茶鞣酸、茶鞣質(zhì),是一類以α-苯基苯并吡喃為基本結(jié)構(gòu)的多羥基酚類復(fù)合體的統(tǒng)稱,包含黃烷醇(兒茶素)類、黃酮類等30余種化合物[20]。茶多酚屬于鏈終止型抗氧化劑,含有不穩(wěn)定的—H,自身易失去—H被氧化,而活性氧化基團(tuán)因接受—H得到電子變成穩(wěn)定的非活性基團(tuán),抗氧化劑非活性基團(tuán)的形成切斷了活性氧化基團(tuán)進(jìn)一步的氧化連鎖反應(yīng),從而起到抗氧化作用。生物體內(nèi)自由基的生成與相關(guān)的氧化酶有關(guān),如黃嘌呤氧化酶系、脂氧化酶和環(huán)氧酶等,茶多酚對(duì)以上氧化酶有抑制作用,通過抑制氧化酶減少自由基的產(chǎn)生。茶多酚的抗氧化性表現(xiàn)為直接和間接清除自由基[21],茶多酚對(duì)活細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基綜合清除效果明顯[22]。筆者在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加10,20,30,50 mg/kg的茶多酚,與在發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加茶多酚進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn),茶多酚對(duì)谷氨酸菌體OD值影響如圖1所示,對(duì)谷氨酸質(zhì)量濃度的影響如圖2所示。

圖1 茶多酚對(duì)谷氨酸菌體生長曲線的影響

圖2 茶多酚對(duì)谷氨酸質(zhì)量濃度的影響

由圖1可知:在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的茶多酚,發(fā)酵前期菌體的生長曲線基本一致,沒有明顯變化,說明茶多酚對(duì)前期谷氨酸菌體生長階段影響不明顯;與茶多酚0添加量時(shí)相比,添加10 mg/kg的茶多酚時(shí),發(fā)酵中后期菌體OD值變化不明顯;當(dāng)茶多酚添加量增加到20 mg/kg時(shí),發(fā)酵中期菌體OD值明顯提高,后期菌體OD值降低速度明顯放緩;當(dāng)茶多酚添加量增大到30 mg/kg和50 mg/kg時(shí),發(fā)酵中后期菌體OD值與添加量為20 mg/kg時(shí)基本一致,后期OD值下降速度放緩,趨于穩(wěn)定,添加過量的茶多酚時(shí)菌體OD值不再改變。由圖2可知:隨著茶多酚添加量的增加,谷氨酸質(zhì)量濃度明顯提高,當(dāng)添加量達(dá)到20 mg/kg時(shí),谷氨酸產(chǎn)酸率達(dá)到最大值16.6 g/dL,與0添加量相比,谷氨酸質(zhì)量濃度提高0.5 g/dL;當(dāng)添加量繼續(xù)加大時(shí),谷氨酸質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定,不再升高。綜上所述,發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量的茶多酚,在發(fā)酵中期菌體OD值增高,后期OD值下降速度放緩,菌體老化速度變緩,可以提高谷氨酸的質(zhì)量濃度,茶多酚適合的添加量為20 mg/kg,此時(shí)的谷氨酸質(zhì)量濃度為16.6 g/dL。

4.2 添加硫辛酸對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響

硫辛酸也稱α-硫辛酸,是一種天然的二硫化合物,其化學(xué)名稱為1,2-二硫戊環(huán)-3-戊酸,是一種B族維生素[23]。硫辛酸是已知的天然抗氧化劑中抗氧化能力最強(qiáng)的一種,被稱為“萬能抗氧化劑”[24],是代謝過程中三羧酸循環(huán)不可缺少的物質(zhì),在三羧酸循環(huán)過程起輔酶作用[25]。硫辛酸可直接清除自由基(·OH)、活性氧(ROS)、活性氮(RNS)、單線態(tài)氧(1O2)和一氧化氮(NO)等[26],并能阻止自由氧對(duì)組織細(xì)胞的損害,起到延緩細(xì)胞衰老的作用。筆者在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加10,20,30,50 mg/kg的硫辛酸,與在發(fā)酵培養(yǎng)基中硫辛酸0添加進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn),硫辛酸對(duì)谷氨酸菌體OD值的影響情況如圖3所示,對(duì)谷氨酸質(zhì)量濃度的影響情況如圖4所示。

圖3 硫辛酸對(duì)谷氨酸菌體生長曲線的影響

圖4 硫辛酸對(duì)谷氨酸質(zhì)量濃度的影響

由圖3可知:在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的硫辛酸,發(fā)酵前期菌體的生長曲線變化不明顯,表明硫辛酸對(duì)前期谷氨酸菌體生長階段的影響不明顯;與硫辛酸0添加量相比,添加量為10 mg/kg和20 mg/kg時(shí),發(fā)酵中后期菌體OD值變化不明顯;當(dāng)添加量增加到30 mg/kg時(shí),發(fā)酵中期菌體OD值明顯變大,后期菌體OD值的下降速度明顯放緩;當(dāng)添加量達(dá)到50 mg/kg時(shí),OD值與添加量為30 mg/kg時(shí)基本一致,表明進(jìn)一步加大添加量不會(huì)提高菌體OD值。由圖4可知:隨著硫辛酸添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,谷氨酸質(zhì)量濃度逐漸提高,當(dāng)添加量達(dá)到30 mg/kg時(shí),谷氨酸產(chǎn)酸率達(dá)到16.9 g/dL,與硫辛酸0添加相比,產(chǎn)酸率提高0.7 g/dL;當(dāng)添加量繼續(xù)加大時(shí),谷氨酸質(zhì)量濃度保持穩(wěn)定,過量的硫辛酸對(duì)進(jìn)一步提高菌體的產(chǎn)酸能力效果不明顯。綜上所述,發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量的硫辛酸,發(fā)酵中后期菌體OD值明顯升高,表明添加一定量的硫辛酸可降低菌體老化速度,提高谷氨酸的質(zhì)量濃度,硫辛酸適合的添加量為30 mg/kg,此時(shí)的谷氨酸質(zhì)量濃度為16.9 g/dL。

4.3 組合添加茶多酚和硫辛酸對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響

硫辛酸有很強(qiáng)的抗氧化作用,具有水溶性和脂溶性雙重特性[23],可同時(shí)在細(xì)胞的親水部分和脂質(zhì)部分發(fā)揮抗氧化功效,作用時(shí)間也比其他抗氧化劑持久,硫辛酸在細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)化為還原型的二氫硫辛酸[27],二氫硫辛酸和硫辛酸是防止細(xì)胞DNA損傷的有效保護(hù)劑[24],二氫硫辛酸還可以激活生物體內(nèi)其他抗氧化劑的代謝循環(huán)。有研究表明硫辛酸與其他抗氧化劑復(fù)合使用比單獨(dú)使用效果好[28]。依據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將20,10 mg/kg的茶多酚分別與30,20,10 mg/kg的硫辛酸進(jìn)行組合,如表1所示。將組合1～6分別添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中,與發(fā)酵培養(yǎng)基中茶多酚和硫辛酸0添加進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn),組合添加后發(fā)酵后期谷氨酸菌體破碎情況如圖5所示,對(duì)谷氨酸的質(zhì)量濃度和糖酸轉(zhuǎn)率的影響情況如圖6所示。

表1 茶多酚與硫辛酸組合

圖5 發(fā)酵后期谷氨酸棒桿菌鏡檢情況(放大1萬倍)

圖6 組合添加茶多酚和硫辛酸對(duì)谷氨酸質(zhì)量濃度、糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

由圖5可知:組合添加茶多酚和硫辛酸后,鏡檢觀察到發(fā)酵后期谷氨酸菌體破碎情況減少,表明發(fā)酵菌體細(xì)胞得到了抗氧化劑的保護(hù),延緩了細(xì)胞的衰老、減少了細(xì)胞破碎和自溶現(xiàn)象的發(fā)生。由圖6可知:組合添加茶多酚和硫辛酸到發(fā)酵培養(yǎng)基中后,谷氨酸質(zhì)量濃度和糖酸轉(zhuǎn)化率明顯提高;與茶多酚和硫辛酸0添加相比,組合添加20 mg/kg的茶多酚和10 mg/kg的硫辛酸時(shí),谷氨酸質(zhì)量濃度由16.2 g/dL提高到17.1 g/dL,糖酸轉(zhuǎn)化率由64.6%提高到65.9%,指標(biāo)值最好,明顯優(yōu)于單獨(dú)添加茶多酚和硫辛酸的指標(biāo)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:發(fā)酵培養(yǎng)基中組合添加20 mg/kg的茶多酚和10 mg/kg的硫辛酸,比單獨(dú)添加茶多酚和硫辛酸更加有利于提高谷氨酸質(zhì)量濃度和糖酸轉(zhuǎn)化率。

5 結(jié) 論

在谷氨酸發(fā)酵過程中,谷氨酸菌體進(jìn)入產(chǎn)酸期后,加大通風(fēng)量可以提升菌體活力以提高菌體產(chǎn)酸能力。然而菌體代謝和老化速度也隨之加快,高產(chǎn)酸期持續(xù)時(shí)間縮短。筆者在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加抗氧化劑茶多酚和硫辛酸,利用茶多酚和硫辛酸能夠清除自由基的特性和硫辛酸的輔酶特性,阻斷和減少自由基對(duì)菌體細(xì)胞造成的傷害,延緩菌體細(xì)胞的老化,減少了菌體破碎和自溶現(xiàn)象,提高谷氨酸菌體持續(xù)高產(chǎn)酸能力。組合添加20 mg/kg茶多酚和10 mg/kg硫辛酸時(shí)谷氨酸發(fā)酵質(zhì)量濃度提高到17.1 g/dL,糖酸轉(zhuǎn)化率提高到65.9%,對(duì)提高谷氨酸質(zhì)量濃度和糖酸轉(zhuǎn)化率效果最明顯。