吳良銀，李文麗，劉 俊

粵北人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東韶關(guān) 512025；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東汕頭 515041

肝細(xì)胞癌是世界上第五大常見惡性腫瘤，每年全球確診的新病例超過70萬[1]。雖然目前采取了包括一級預(yù)防策略、早期篩查診斷以及更先進治療技術(shù)在內(nèi)的多種診療方案，但肝癌的總體發(fā)病率和病死率仍持續(xù)上升[2]。肝細(xì)胞癌是一種高異質(zhì)性腫瘤，且肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展是多機制調(diào)控、多分子參與的過程[3]。目前，肝細(xì)胞癌仍面臨著高復(fù)發(fā)率及晚期低生存率的現(xiàn)狀，因此，準(zhǔn)確地識別預(yù)后生物標(biāo)志物對預(yù)后較差的高危患者進行監(jiān)測和制訂個體化治療策略，以及防止復(fù)發(fā)都具有重要的意義。

越來越多的證據(jù)表明，分子遺傳及拷貝數(shù)變異在肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。隆紹平等[4]研究結(jié)果表明，非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶12(PTPN12)是預(yù)測肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的因素，可能成為肝細(xì)胞癌預(yù)后的重要生物標(biāo)志物[4]。相關(guān)研究顯示，透明質(zhì)酸介導(dǎo)的運動受體(HMMR)在肝細(xì)胞癌中呈顯著高表達(dá)，并且有一定的預(yù)后意義，但其在肝細(xì)胞癌中的作用仍有待進一步研究[5]。本研究回顧性分析了癌癥基因組圖譜計劃(TCGA)和國際癌癥基因組聯(lián)合體(ICGC)數(shù)據(jù)庫中的肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相對應(yīng)的臨床資料，旨在分析HMMR在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，以及與臨床分期的相關(guān)性，同時通過單因素生存分析以及多因素COX回歸分析HMMR對肝細(xì)胞癌預(yù)后的預(yù)測作用?，F(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1一般資料 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載377例肝細(xì)胞癌患者的表達(dá)譜數(shù)據(jù)和臨床資料，同時從ICGC數(shù)據(jù)庫下載232例肝細(xì)胞癌患者的表達(dá)譜數(shù)據(jù)和臨床資料。選取癌旁組織202例、正常組織202例進行比較。609例肝細(xì)胞癌患者中男426例，女183例；生存438例，死亡171例；TNM分期T1、T2、T3、T4分別有185、95、80、13例，M0、M1、MX各有272、4、101例，N0、N1、NX各有257、4、115例；Stage分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期各有211、193、157、24例；組織學(xué)分級G1、G2、G3、G4級各有55、180、124、13例。

1.2基因富集分析(GSEA) 為了進一步探索HMMR的表達(dá)對于肝細(xì)胞癌的潛在影響機制，本研究通過GSEA分析來闡明HMMR高低表達(dá)組之間差異基因的富集通路。從GSEA官網(wǎng) (http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)下載GSEA (JAVA version,2-2.2.3) 分析軟件。GSEA通過標(biāo)準(zhǔn)化的P值和標(biāo)準(zhǔn)化的富集評分來分析富集通路。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 使用R3.6.1統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示。采用Wilcoxon秩和檢驗比較HMMR的表達(dá)水平在肝細(xì)胞癌和正常組織之間以及肝細(xì)胞癌和癌旁組織之間的差異。采用Wilcoxon秩和檢驗、Kruskal-Wallis檢驗和Logistic回歸分析臨床特征與HMMR表達(dá)水平之間的關(guān)系。采用Kaplan-Meier法分析HMMR的表達(dá)水平與患者總體生存時間的關(guān)系。采用單因素及多因素COX回歸分析比較HMMR的表達(dá)水平對生存期及其他臨床特征的影響。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HMMR在肝細(xì)胞癌組織、正常組織、癌旁組織中的表達(dá)水平比較 結(jié)果顯示，與正常組織比較，HMMR在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。同時，與癌旁組織比較，HMMR在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖1。

注：A為HMMR在正常組織和肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平的比較；B為HMMR在癌旁組織和肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平比較。圖1 HMMR在肝細(xì)胞癌組織、正常組織、癌旁組織中的表達(dá)情況

2.2HMMR在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平與臨床特征的相關(guān)性 本研究分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中 HMMR的表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，組織學(xué)分級越高，HMMR表達(dá)水平越高(P<0.05)；Stage分期、T分期越高，HMMR表達(dá)水平也更高(P<0.05)。而不同M分期及N分期的患者HMMR表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。同時，Logistic回歸分析顯示，StageⅡ期和StageⅢ期的HMMR表達(dá)水平高于StageⅠ期(OR=2.49、2.57；P=0.000 7、0.000 5)；T2及T3期的HMMR表達(dá)水平高于T1期(OR=2.73、2.31；P=0.000 1、0.002 2)；同時，G3期的HMMR表達(dá)水平高于G1期(OR=2.92，P=0.001 5)。Kaplan-Meier曲線分析結(jié)果顯示，HMMR低表達(dá)患者生存率高于HMMR高表達(dá)者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見圖2。同時，本研究分析了ICGC數(shù)據(jù)庫中HMMR在肝細(xì)胞癌組織、正常組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，HMMR在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)；Kaplan-Meier生存分析也表明，HMMR高表達(dá)患者在ICGC數(shù)據(jù)庫中的生存率低于HMMR低表達(dá)者(P<0.001)。見圖3。

注：A為HMMR表達(dá)水平與組織學(xué)分級的關(guān)系分析；B為HMMR表達(dá)水平與腫瘤Stage分期的關(guān)系分析；C為HMMR表達(dá)水平與T分期的關(guān)系分析；D為HMMR表達(dá)水平與M分期的關(guān)系分析；E為HMMR表達(dá)水平與N分期的關(guān)系分析；F為不同HMMR表達(dá)水平的患者生存率分析。圖2 HMMR在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

2.3HMMR是肝細(xì)胞癌的獨立預(yù)后因子 本研究采用單因素及多因素COX回歸分析HMMR對預(yù)后的預(yù)測價值。單因素回歸分析結(jié)果顯示，TCGA和ICGC數(shù)據(jù)庫中HMMR高表達(dá)是預(yù)后不良的危險因素(HR=1.15、1.19；P<0.001)。多因素回歸分析結(jié)果顯示，TCGA和ICGC數(shù)據(jù)庫中HMMR高表達(dá)是預(yù)后不良的危險因素(HR=1.80、2.56，P<0.001)。

2.4GSEA 采用GSEA方法，共發(fā)現(xiàn)12條通路富集在HMMR高表達(dá)患者中，包括RNA 降解、DNA復(fù)制、P53信號通路、癌癥通路、凋亡通路等，見表1。

表1 HMMR的高、低表達(dá)數(shù)據(jù)集與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路

續(xù)表1 HMMR的高、低表達(dá)數(shù)據(jù)集與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路

3 討 論

肝細(xì)胞癌是最常見的惡性腫瘤之一，患者的預(yù)后一般較差，在全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因中排名第二[6]。雖然肝細(xì)胞癌的治療在過去幾十年里取得了快速的發(fā)展，包括從手術(shù)和局部治療到分子靶向治療以及免疫治療等，但預(yù)后情況一直不樂觀[7]。因此，闡明肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，以及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，完善治療方案勢在必行。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，近年來越來越多的研究者運用高通量方法來探索與疾病發(fā)生和預(yù)后相關(guān)的潛在分子標(biāo)志物[8-9]。毛麗萍等[10]的研究表明，血漿Dickkopf同源物1(DKK1)對肝細(xì)胞癌的診斷有一定價值，并可作為甲胎蛋白(AFP)的有效補充。HAN等[11]在3個獨立的數(shù)據(jù)集中驗證了SAC3D1在腫瘤組織異常高表達(dá)，并且通過生存分析及多因素分析表明其是肝細(xì)胞癌的獨立預(yù)后因子。LIANG等[12]在兩個獨立的數(shù)據(jù)集中通過單因素COX回歸及最小絕對收縮和選擇算法構(gòu)建了10個基因的預(yù)測模型，用于肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后評估。本研究從TCGA和ICGC數(shù)據(jù)庫中獲得609例患者的信息來評估HMMR在肝細(xì)胞癌中的預(yù)后價值，在TCGA和ICGC數(shù)據(jù)庫中，HMMR表達(dá)水平在肝細(xì)胞癌晚期上升，提示較高的HMMR水平對肝細(xì)胞癌的進展有不利影響，并且單因素和多因素COX回歸分析表明，HMMR是肝細(xì)胞癌的獨立預(yù)后因子。

有研究表明，HMMR編碼的蛋白質(zhì)是透明質(zhì)酸介導(dǎo)的運動受體，當(dāng)透明質(zhì)酸與HMMR結(jié)合時，包括PTK2/FAK1在內(nèi)的許多蛋白質(zhì)就會發(fā)生磷酸化，HMMR與腫瘤的發(fā)生過程相關(guān)，是多種腫瘤的易感基因，其在腫瘤進展中的作用通常歸因于透明質(zhì)酸介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)[13]。HMMR也可能參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移的形成，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)的活性。YANG等[14]研究結(jié)果表明HMMR可能調(diào)控膀胱癌的多個通路，并且其在腫瘤組織中的異常高表達(dá)是膀胱癌的無病生存期的特異性預(yù)后標(biāo)志物。本課題組前期結(jié)果也表明HMMR在肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定作用，并對預(yù)后有影響[5]。

已有研究顯示，P53信號通路在維持基因組穩(wěn)定性和保真度上扮演著重要角色，并且影響著細(xì)胞的代謝和衰老，在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中都起著非常重要的作用[15]。Wnt 信號通路是胚胎發(fā)育過程中的關(guān)鍵傳導(dǎo)通路，并且在調(diào)節(jié)組織穩(wěn)態(tài)方面也起著重要作用，Wnt 信號通路的異常激活與許多腫瘤的發(fā)生相關(guān)[16]。本研究通過GSEA分析表明在HMMR高表達(dá)患者中，P53信號通路、Wnt信號通路、DNA復(fù)制及細(xì)胞凋亡通路被顯著富集。這些結(jié)果說明HMMR可能在肝細(xì)胞癌的P53及Wnt信號通路激活中起著重要作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，HMMR在肝細(xì)胞癌腫瘤組織中顯著高表達(dá)，且其表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌的疾病進展相關(guān)。此外，HMMR在肝細(xì)胞癌腫瘤組織中表達(dá)水平越高，其預(yù)后越差，且HMMR可以獨立于其他臨床因素作為肝細(xì)胞癌的預(yù)后因子。