馮 柳，王彬潘，陳 鳴，唱 凱

陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400038

即時(shí)檢測(cè)(POCT)作為一種可以在現(xiàn)場(chǎng)快速完成標(biāo)本采集、檢測(cè)反應(yīng)和結(jié)果讀取判別的技術(shù)方法，具有快速、簡(jiǎn)便、高度集成，不依賴儀器設(shè)備和專業(yè)工作人員等特點(diǎn)，為基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)公共衛(wèi)生監(jiān)控、家庭保健、疾病預(yù)防、食品、環(huán)境等現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供了可能。近年來(lái)，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的大流行對(duì)POCT技術(shù)提出了更高的要求[1-2]。以新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)檢測(cè)為例，快速、及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)是控制疫情流行的首要關(guān)鍵步驟，這不僅提高了患者的存活率，而且還能夠輔助及時(shí)有效地控制疫情流行，就全球防疫工作實(shí)踐而言，POCT技術(shù)在疾病診斷中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。因此，2021年12月28日，工信部等十部門聯(lián)合印發(fā)《“十四五”醫(yī)療裝備產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃》，提出2025年醫(yī)療裝備產(chǎn)業(yè)發(fā)展的總體目標(biāo)及2035年遠(yuǎn)景目標(biāo)，其中POCT裝備為我國(guó)未來(lái)5年醫(yī)療裝備產(chǎn)業(yè)發(fā)展的目標(biāo)之一，如何建立新型POCT方法已成為目前亟待解決的問題。

紙作為一種常見的材料，擁有輕薄、柔韌、廉價(jià)、使用廣泛、易加工、環(huán)保等固有特性，而紙的上述特性也逐漸被研究學(xué)者重視。MARTINEZ等[3]在2007年將色譜紙光刻膠圖案化，使疏水聚合物包圍親水性紙張，由此創(chuàng)建對(duì)生物流體可控的毫米級(jí)別通道，建立了一種簡(jiǎn)便、低成本的紙基傳感技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了一張?jiān)嚰垪l上多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)。該篇報(bào)道被廣泛認(rèn)為是紙基功能材料用于POCT發(fā)展歷程上的重要節(jié)點(diǎn)，自此之后紙基功能材料的生物傳感技術(shù)在基本材料及檢測(cè)方式等方面進(jìn)入了高速發(fā)展階段。相比于傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)，紙基功能材料的生物傳感技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)依靠紙纖維素的毛細(xì)管力實(shí)現(xiàn)了液體在紙質(zhì)中流動(dòng)，無(wú)須外加動(dòng)力源，無(wú)須使用檢測(cè)過程中的外接設(shè)備；(2)紙基多孔薄膜型結(jié)構(gòu)有篩選、分離等功能，可實(shí)現(xiàn)病原微生物核酸的有效提??；(3)紙質(zhì)很容易被加工，且造價(jià)低廉。因此，紙基功能材料的生物傳感技術(shù)在POCT中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。

因此，本文圍繞紙基材料，紙基功能材料生物傳感器的分類、液流控制，以及比色、電化學(xué)、電化學(xué)發(fā)光、熒光及拉曼光譜等紙基功能材料生物傳感技術(shù)在POCT中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

1 紙基材料

從17世紀(jì)英國(guó)著名化學(xué)家波義耳，因?yàn)樽狭_蘭而發(fā)明測(cè)試酸堿度的石蕊試紙之后，紙基在以原始植物纖維為主要原料的基礎(chǔ)上衍生出了多種材料并隨之賦予了新的理化特性，紙張的定義也變得更加寬泛。按照紙基的基本材料可分為3類：纖維素類、改性或復(fù)合的纖維素類、非纖維素類。

1.1纖維素類 纖維素是一種親水性極性的聚合物，可以與其他帶電或極性實(shí)體形成強(qiáng)烈的非共價(jià)相互作用。研究人員利用這一特性進(jìn)行紙質(zhì)的直接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)[4]。纖維素紙基檢測(cè)設(shè)備通常應(yīng)用于干化學(xué)試紙的制備，傳統(tǒng)制備方法是將檢測(cè)試劑浸潤(rùn)紙質(zhì)載體，待干燥后使用。例如，用酸堿度指示劑浸潤(rùn)吸水性良好的紙條，干燥后可作為便攜式pH檢測(cè)試紙條。在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用常見于各類多聯(lián)尿液干化學(xué)試紙條。

1.2改性或復(fù)合的纖維素類 纖維素大分子鏈上的每一個(gè)葡萄糖基都有3個(gè)羥基，這些羥基能與酸類起酯化反應(yīng)，與硝酸生成的產(chǎn)物稱為硝化纖維素(NC)，有纖維素骨架的硝化纖維素還具有兩性離子硝基基團(tuán)，與生物分子具有更強(qiáng)的非共價(jià)相互作用，其作為固相結(jié)構(gòu)被廣泛應(yīng)用在側(cè)向?qū)游雒庖叻治鲋衃5-6]。纖維素與其他材料復(fù)合可以制備功能更為廣泛的材料，XU等[7]將纖維素與碳量子點(diǎn)雜化制備了一種圖案化熒光薄膜材料。

1.3非纖維素類 由于學(xué)科交叉不斷延伸，特別是材料學(xué)的突飛猛進(jìn)，“紙”的定義更加寬泛，邊界也更為模糊。一些材料因符合紙的某些特性，被稱為類紙。聚二甲基硅氧烷(PDMS)是一種疏水類的有機(jī)硅物料，具有生理惰性、電絕緣性、疏水性好及抗剪切能力等特性。與普通硅基材料相比，PDMS的成本更低，在合適溫度下更容易在模板上固化[8]。玻璃濾紙具有良好的光學(xué)性質(zhì)和生物相容性，隨著3D打印技術(shù)的不斷突破，玻璃微構(gòu)造也有了新的突破，TOOMBS等[9]利用一項(xiàng)體積光固化3D打印玻璃微結(jié)構(gòu)可精確到50 μm，與其他基于層的3D打印工藝相比，能夠制造出具有更光滑表面的物體，從而減少了斷裂的可能性，此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用為玻璃作為類紙材料提供了更廣闊的應(yīng)用空間。

2 紙基功能材料的生物傳感器的分類

根據(jù)紙基構(gòu)造和裝置中流體流動(dòng)方式可以大致劃分為一維、二維、三維的紙基功能材料的生物傳感器。

2.1一維紙基功能材料的生物傳感器——側(cè)流層析分析裝置(LFA) 最經(jīng)典的LFA是檢測(cè)人絨毛膜促性腺激素層析試紙條，該裝置被廣泛應(yīng)用于早孕診斷并沿用至今。LFA由5個(gè)部分組成，包括最底部的支撐底板，往上依次是樣品墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊。待測(cè)流體由樣品墊快速吸收，在毛細(xì)管作用下向結(jié)合墊側(cè)向流動(dòng)；待測(cè)流體中如含有檢測(cè)靶標(biāo)則在結(jié)合墊上與生物活性材料的標(biāo)志物形成復(fù)合物之后，繼續(xù)沿層析膜移動(dòng)依次浸潤(rùn)通過層析膜上固定的“檢測(cè)線”(T線)和“質(zhì)控線”(C線)，線上均勻分布可結(jié)合靶標(biāo)復(fù)合物的顯色物，肉眼可直觀判斷檢測(cè)結(jié)果；吸水墊為吸水材料用于吸收多余的待檢樣品，并促使足量的待檢物通過在層析膜?；贑RISPR-Cas9介導(dǎo)的SARS-CoV-2雙基因同步診斷LFA結(jié)構(gòu)示意圖見圖1[2]。LFA的各部件組合在一起以提供連續(xù)的一維流動(dòng)，盡管LFA具有便攜性和原位測(cè)試等優(yōu)點(diǎn)，但它們?cè)诙鄠€(gè)維度上執(zhí)行復(fù)雜流體操作的能力有限。

圖1 基于CRISPR-Cas9介導(dǎo)的SARS-CoV-2雙基因同步診斷LFA結(jié)構(gòu)示意圖

2.2二維紙基功能材料的生物傳感器——2D-微流控紙基分析設(shè)備(μPADs) μPAD是指在同一水平維度上同時(shí)進(jìn)行多項(xiàng)目檢測(cè)。MARTINEZ等[3]在2007年報(bào)道，通過對(duì)葡萄糖和蛋白質(zhì)兩個(gè)項(xiàng)目檢測(cè)展示了2D-μPAD的生物分析。MARTINEZ將光刻膠圖案化到色譜紙上，形成由疏水線隔開的親水紙的限定區(qū)域，由于所產(chǎn)生毫米大小通道的毛細(xì)管作用，對(duì)生物流體的空間進(jìn)行了控制，使流體能夠在沒有泵送的情況下傳輸，見圖2。隨著檢測(cè)通道的增加，樣品池由既往紙基檢測(cè)的一端改變到μPAD中央。ABE等[10]通過噴墨蝕刻在濾紙上制造三維親水性微流控圖案(550 μm流道)和傳感區(qū)域(1.5 mm×1.5 mm正方形)，制作了一個(gè)微流控多分析物化學(xué)傳感裝置，用于同時(shí)測(cè)定尿液中pH值、總蛋白和葡萄糖。LI等[11]利用壓電陶瓷換能器驅(qū)動(dòng)器和玻璃噴嘴進(jìn)行噴蠟的方式制造紙基微流控傳感器，成功實(shí)現(xiàn)了葡萄糖、蛋白質(zhì)和pH值的多重測(cè)定。但2D-μPAD的檢測(cè)通道不論如何增加，在同一維度始終存在反應(yīng)過程單一性的限制，為解決這一問題，3D-μPAD引入了垂直分量來(lái)流動(dòng)。

注：較暗的線條用光刻膠固化；較輕的區(qū)域是未曝光的紙張。圖2 用光刻膠圖案化的色譜紙結(jié)構(gòu)示意圖

2.3三維紙基功能材料的生物傳感器——3D-μPAD 3D-μPAD利用紙基具有折疊、彎曲和扭轉(zhuǎn)的特性可以實(shí)現(xiàn)二維到三維的轉(zhuǎn)變，維度的增加使紙基不同層面之間創(chuàng)建微流控通道的連接，形成多層流體網(wǎng)絡(luò)，在多個(gè)檢測(cè)區(qū)域同時(shí)快速定量不同分析物。與2D-μPAD相比，3D-μPAD提供了多重和多步驟分析等更為便捷的操作功能。SHEN等[12]采用蠟屏障和“紙橋”制備了一種具有5個(gè)單獨(dú)通道的場(chǎng)效應(yīng)晶體管/化學(xué)電阻生物傳感器，傳感器可以將樣品平均分到每個(gè)內(nèi)置微流通道，并實(shí)現(xiàn)人血清清蛋白(HSA)和人免疫球蛋白G(hIgG)的超敏檢測(cè)。SUN等[13]開發(fā)了一個(gè)多功能自動(dòng)驅(qū)動(dòng)的多路紙質(zhì)集成平臺(tái)，用于胃腸瘺的超快速檢測(cè)。該設(shè)備為非對(duì)稱聚砜血漿分離膜制成的3D-μPAD，集成了血漿分離、自動(dòng)進(jìn)樣和特異性檢測(cè)3項(xiàng)功能，見圖3。為進(jìn)一步提高紙基中液體的流動(dòng)速度，CHANNON等[14]通過光學(xué)和電化學(xué)對(duì)流體動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，并與μPAD內(nèi)已建立的流動(dòng)理論進(jìn)行了比較，建立了多層μPAD作為在自泵送紙?jiān)O(shè)備中產(chǎn)生增強(qiáng)流速的方法。與典型的1層μPAD設(shè)計(jì)相比，通過精確控制2層紙?jiān)O(shè)備中的通道高度，流速可增加168倍。

圖3 血漿分離膜多功能折紙紙基設(shè)備的結(jié)構(gòu)和功能圖

3 紙基功能材料生物傳感器的液流控制

閥門是紙基功能材料生物傳感器液流啟停控制的重要工具，在多步分析和定時(shí)試劑輸送中發(fā)揮著重要作用，按照閥門發(fā)揮作用的主、被動(dòng)形式其大致可劃分為手動(dòng)閥門和自動(dòng)閥門。

3.1手動(dòng)閥門 手動(dòng)閥門通常是人工對(duì)紙基裝置的組成元件進(jìn)行折疊、滑動(dòng)或旋轉(zhuǎn)的操作以打開或關(guān)閉閥門。折疊和滑動(dòng)兩種方式的操作簡(jiǎn)單，但可用的折疊步驟數(shù)量有限，同時(shí)由于紙張自身的回彈特性，標(biāo)本在未被樣品墊完全吸收前容易發(fā)生標(biāo)本外溢或噴濺污染[15]?；瑒?dòng)則存在各層反應(yīng)不連貫的情況[16]。旋轉(zhuǎn)比折疊或滑動(dòng)結(jié)構(gòu)更緊湊、更精確，通常有適當(dāng)?shù)膯⒅挂源_保準(zhǔn)確放置，但是其構(gòu)造更為復(fù)雜[17]。

3.2自動(dòng)閥門 自動(dòng)閥門通常是在特定時(shí)間通過可溶解物質(zhì)或電子調(diào)控自動(dòng)打開或關(guān)閉，雖然設(shè)計(jì)更加復(fù)雜但這提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和用戶操作的友好性。最簡(jiǎn)單的自動(dòng)閥門設(shè)計(jì)是可溶解的橋聯(lián)/屏障，但設(shè)計(jì)時(shí)要注意應(yīng)用的靶物質(zhì)，因?yàn)榭扇芙獾奶腔虮砻婊钚詣┛赡軙?huì)干擾測(cè)定，另外，溶解這一過程本身也會(huì)延長(zhǎng)整體操作的時(shí)間[18-19]。吸收控制閥門和電子控制閥門具有多種閥門功能，且設(shè)計(jì)更為復(fù)雜，特別是電子控制閥門在功能實(shí)現(xiàn)方面更為精細(xì)，同時(shí)又額外需要?jiǎng)恿x器[20-21]。

4 紙基功能材料生物傳感技術(shù)及其在POCT中的應(yīng)用

4.1紙基功能材料的比色傳感技術(shù) 比色法是紙基檢測(cè)技術(shù)中最常用的檢測(cè)方法，在紙基上獲得有色信號(hào)的方法有多種，如pH誘導(dǎo)變色、金屬-配體絡(luò)合、偶聯(lián)反應(yīng)、顯色底物的酶轉(zhuǎn)化、納米顆粒的聚集和光聚合等。該檢測(cè)方法可以用于重金屬、蛋白質(zhì)、DNA、血細(xì)胞比容水平、葡萄糖等小分子、細(xì)菌等生物活性物質(zhì)的檢測(cè)。紙基的白色背景與比色信號(hào)提供了高對(duì)比度，為檢測(cè)提供了良好的信噪比，可以定性或定量檢測(cè)，比色讀數(shù)可以通過肉眼直接觀察并解釋，但是精度有限。KO等[22]利用聚苯胺/聚乙二醇復(fù)合體系響應(yīng)pH比色指示劑檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)，見圖4。LEE等[23]利用亞硝酸根離子與磺胺反應(yīng)生成重氮鹽，由于生成的偶氮染料可與預(yù)處理中使用的有機(jī)堿進(jìn)一步變色，因此，添加磷酸以抑制混色反應(yīng)，可用于西維因農(nóng)藥的檢測(cè)。

圖4 在PANI/PEG復(fù)合模式下，通過字母“K”的顏色變化監(jiān)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)的示意圖

紙基功能材料的比色傳感技術(shù)有利于POCT的應(yīng)用，但環(huán)境照明、濕度和人工解釋都會(huì)影響實(shí)際的信號(hào)判讀，使其更難以一致量化。為了解決上述問題，KATOH等[24]將智能手機(jī)QR碼識(shí)別集成到具有“基于距離”的色度信號(hào)的μPAD中，從而完全依靠簡(jiǎn)單的條形碼閱讀器解決方案實(shí)現(xiàn)半定量讀數(shù)，見圖5。此外，為解決微量樣本檢測(cè)問題，MAHMUD等[25]報(bào)道了一種橫向流動(dòng)分析LFA型μPADs，克服了亞微升樣本量半定量檢測(cè)的難題。該方法分別使用0.5 μL和1.0 μL樣品溶液進(jìn)行葡萄糖和總?cè)祟惷庖咔虻鞍譋(IgE)測(cè)試，證實(shí)了該裝置的有效性。

圖5 基于QR碼比色的μPAD檢測(cè)流程示意圖

比色法檢測(cè)是POCT中使用最廣泛的檢測(cè)方法之一，其檢測(cè)范圍廣泛，以及結(jié)果判讀的簡(jiǎn)便性都成為其優(yōu)勢(shì)。此外，通過使用“基于距離”的檢測(cè)、智能手機(jī)和其他便宜的傳感器，比色法檢測(cè)開始提供逐漸精確的定量結(jié)果。

4.2紙基功能材料的電化學(xué)傳感技術(shù) 紙基功能材料的電化學(xué)傳感技術(shù)為定量分析提供了一個(gè)可供選擇和較靈敏的平臺(tái)，與傳統(tǒng)的電化學(xué)檢測(cè)裝置類似，該技術(shù)需在紙基表面制造敏感電極并在其上固定生物活性分子，使其具備捕獲靶標(biāo)的能力。紙基功能材料的電化學(xué)傳感器通常由3個(gè)電極系統(tǒng)組成。參比電極(RE)通常被放置在靠近工作電極(WE)的位置，以最大限度地減小由于溶液的電阻而引起的壓降，而對(duì)電極(CE)被設(shè)計(jì)成大于WE，從而在電路內(nèi)持續(xù)提供電流。WE對(duì)于檢測(cè)至關(guān)重要，它決定了傳感器的功能和分析性能。紙基功能材料的電化學(xué)傳感技術(shù)中常用的兩種材料是碳和貴金屬。傳統(tǒng)碳電極便宜，而石墨、玻璃炭、碳黑、石墨烯和碳納米管等新型碳材料為各種分析物提供了更寬廣的檢測(cè)范疇。金屬和碳之間的雜化材料也被用于提高電極的電化學(xué)性能，其中碳被用作電極襯底，金屬或金屬氧化物被用作襯底內(nèi)的涂層材料或改性劑。電化學(xué)法應(yīng)用于紙基傳感分析的缺點(diǎn)是需要外部?jī)x器，長(zhǎng)時(shí)間測(cè)量會(huì)導(dǎo)致電極結(jié)垢，如選擇電勢(shì)測(cè)定法則僅能檢測(cè)帶電物質(zhì)，需要分析物為選擇性電極。

BOONKAEW等[26]創(chuàng)建了一種使用紙質(zhì)分析裝置檢測(cè)鐵蛋白的無(wú)標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感技術(shù)。該設(shè)備圖案是在濾紙上定制設(shè)計(jì)的，同時(shí)使用噴墨印刷技術(shù)將氧化石墨烯修飾到工作電極上，然后使用標(biāo)準(zhǔn)的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)/N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)化學(xué)進(jìn)行電極表面的活化步驟?？硅F蛋白抗體共價(jià)固定在胺反應(yīng)性酯表面上。通過差分脈沖伏安法 (DPV) 觀察所選氧化還原對(duì)的電化學(xué)信號(hào)來(lái)監(jiān)測(cè)鐵蛋白濃度。在鐵蛋白存在的情況下，傳感器顯示出電化學(xué)響應(yīng)以濃度依賴性方式顯著降低。相反，在沒有鐵蛋白的情況下檢測(cè)到的電流響應(yīng)沒有可觀察到的變化。電流響應(yīng)與鐵蛋白濃度在1～1 000 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的相關(guān)性，檢測(cè)限達(dá)到0.19 ng/mL。該免疫傳感器提供了良好的選擇性、重現(xiàn)性和長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性，見圖6。RUECHA等[27]通過使用循環(huán)伏安法將聚苯胺(PANI)沉積在石墨烯(G)絲網(wǎng)印刷紙電極上開發(fā)了用于靈敏檢測(cè)人γ干擾素(IFN-γ)無(wú)標(biāo)記電化學(xué)阻抗免疫傳感器平臺(tái)。與傳統(tǒng)方法相比，該系統(tǒng)具有成本低、樣本量要求低、可處置性和快速分析等優(yōu)點(diǎn)，使該平臺(tái)可作為人IFN-γ篩查的替代工具。

4.3紙基功能材料的電化學(xué)發(fā)光傳感技術(shù) 電化學(xué)發(fā)光是化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，其中信號(hào)是通過電化學(xué)電勢(shì)來(lái)啟動(dòng)和控制化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)相比，該技術(shù)保留了化學(xué)發(fā)光的優(yōu)勢(shì)，并且重復(fù)性好，試劑更穩(wěn)定，可操控性更強(qiáng)。許多基于納米粒子的增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光體也已用于紙器件，包括半導(dǎo)體納米晶體/量子點(diǎn)(QD，如CdTe QD、CdSe QD)，金屬納米顆粒(如Pt-AgNP、Pd@Au NP)，碳量子點(diǎn)，石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)，無(wú)機(jī)絡(luò)合物和發(fā)光碳納米晶體[28]。2014年FENG等[29]報(bào)道了第一個(gè)紙質(zhì)雙極電極(BPE)，通過ELISA夾心法成功實(shí)現(xiàn)了前列腺特異性抗原(PSA)的檢測(cè)。BPE是與離子相接觸的浮動(dòng)導(dǎo)體，當(dāng)在離子相上施加足夠高的電場(chǎng)時(shí)，即使BPE和外部電源之間沒有物理接觸，法拉第反應(yīng)也會(huì)發(fā)生在BPE的末端，ECL試劑可用作該法拉第反應(yīng)的間接報(bào)告，見圖6。目前紙基功能材料的電化學(xué)發(fā)光傳感技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于miRNA、腫瘤標(biāo)志物、細(xì)菌[30-32]等的檢測(cè)。

圖6 基于紙基BPE的用于PSA分析的ECL生物傳感器的制備流程示意圖

4.4紙基功能材料的熒光傳感技術(shù) 熒光探針作為紙基傳感技術(shù)的一種重要檢測(cè)模式，為其提供了更低的檢測(cè)限和更高的檢測(cè)靈敏度。量子點(diǎn)作為一種能發(fā)射熒光的半導(dǎo)體納米微晶體，因具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)而在紙基傳感技術(shù)中發(fā)揮重要作用。GUO等[33]通過硼酸功能化的 MoS2 量子點(diǎn)(B-MoS2 QD)，構(gòu)建一種新的熒光傳感器，用于靈敏和選擇性地檢測(cè)汞離子(Hg2+)。由于Hg2+促進(jìn)芳基硼酸的金屬轉(zhuǎn)移反應(yīng)，該方法對(duì)不同環(huán)境水中Hg2+的分析具有快速響應(yīng)、超靈敏和高選擇性的優(yōu)點(diǎn)，且可用于Hg2+的在線監(jiān)測(cè)?；贐-MoS2 QD的試紙可用于紫外燈下微量Hg2+檢測(cè)，結(jié)果可通過肉眼直接判讀表明該方法在環(huán)境Hg2+現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。與單一熒光信號(hào)相比，比率熒光法對(duì)偏置性能變化、顏色變化分辨率和定量準(zhǔn)確度均有提高。NA等[34]首次通過一步法制備了一種基于銪(Eu)摻雜的硅納米粒子(Eu@SiNPs)的新型比率熒光納米探針，用于測(cè)定枯草芽孢桿菌孢子中的DPA(模擬物)。該方法對(duì)枯草芽孢桿菌孢子的檢測(cè)限(LOD)低至2.38×104spore/mL。ZHU等[35]研制了一種堅(jiān)固、便攜、實(shí)用的三維折紙比例熒光微流控裝置，利用碳量子點(diǎn)相同的兩種熒光信號(hào)指示劑，通過級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)堿性磷酸酶和苯丙氨酸。焦磷酸(PPI，堿性磷酸酶的酶底物)和硫代膽堿(TCH，BChE的酶產(chǎn)物)可以與Cu2+配位，自由Cu2+將鄰苯二胺(OPD)氧化成2，3-二氨基吩嗪(oxOPD，Abs最大吸收波長(zhǎng)為420 nm，Em最大值為565 nm)，然后通過內(nèi)濾波效應(yīng)oxOPD猝滅碳量子點(diǎn)的發(fā)射(Em最大值為445 nm)。因此，成功研制了445 nm(碳量子點(diǎn)的藍(lán)色熒光)和565 nm(oxOPD的黃色熒光)雙發(fā)射的比率型熒光傳感平臺(tái)，用于ALP和BChE的傳感，見圖7。

圖7 比率熒光檢測(cè)機(jī)制和智能手機(jī)輔助3D-μPAD檢測(cè)流程圖

熒光素酶是能夠催化不同底物氧化發(fā)光的一類酶，熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素，在催化氧化過程中，會(huì)發(fā)出生物熒光。TENDA等[36]報(bào)告了依賴于生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)開關(guān)(LUMABS)來(lái)識(shí)別分析物和產(chǎn)生比色信號(hào)的集成紙基分析設(shè)備。該設(shè)備使用基于BRET的抗體傳感蛋白，集成到垂直組裝的功能化紙層中，其設(shè)計(jì)使包括血漿分離在內(nèi)的樣品處理可獨(dú)立完成，且無(wú)須試劑操作。用戶操作僅需1滴(20～30 μL)樣品(血清、全血)，且在加樣20 min后采集照片，除照相機(jī)外不需要精確的移液、液體處理或分析設(shè)備。該設(shè)備實(shí)現(xiàn)了對(duì)全血中抗人類免疫缺陷病毒1(HIV1)、抗甲型肝炎病毒(HAV)和抗登革熱病毒1(DEN1)的同時(shí)檢測(cè)。因此，這種類型的設(shè)備非常適合在資源匱乏環(huán)境中進(jìn)行用戶友好的POCT，見圖8。

注：A為L(zhǎng)UMABS工作原理示意圖；B為3D-μPAD示意圖；C為操作流程。圖8 LUMABS工作原理及3D-μPAD示意圖

4.5紙基功能材料的拉曼光譜傳感技術(shù) 拉曼光譜近些年來(lái)作為一種無(wú)損、非接觸的快速檢測(cè)技術(shù)，吸引了不同領(lǐng)域的創(chuàng)新應(yīng)用。表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)是在普通拉曼效應(yīng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種技術(shù)，當(dāng)分子被吸收到金屬納米顆粒表面上時(shí)，分子的非彈性光散射會(huì)大幅度增強(qiáng)[37]。由于SERS可以提供豐富的振動(dòng)光譜信息，且可以實(shí)現(xiàn)分子樣品的指紋識(shí)別，其已被用于多種類型分析物的檢測(cè)。在POCT方面，ZENG等[38]創(chuàng)建了一種基于智能手機(jī)的便攜式拉曼光譜儀。該技術(shù)將智能手機(jī)作為小型拉曼光譜分析儀，基于常用濾紙和納米銀(AgNP)制備紙基SERS芯片，成功實(shí)現(xiàn)了羅丹明6G和結(jié)晶紫的辨別。之后該團(tuán)隊(duì)通過在AgNPs中嵌入尼龍濾膜(ANFM)制作柔性紙基SERS芯片，借助膜的微孔結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)分子的檢測(cè)[39]。

5 總結(jié)與展望

從石蕊酸堿度試紙的誕生到現(xiàn)在的幾百年歷史中，受限于其本身傳遞信息量有限，紙基在21世紀(jì)前的發(fā)展相對(duì)緩慢。進(jìn)入21世紀(jì)后，隨著各項(xiàng)交叉學(xué)科進(jìn)展飛速，紙基功能材料的生物傳感技術(shù)在POCT領(lǐng)域也得到了高速發(fā)展，特別是材料學(xué)中納米材料的研究進(jìn)展，使紙基底板本身，以及其他元件的功能都得到了極大提高，另外，通信技術(shù)及數(shù)據(jù)分析的高速發(fā)展使紙基POCT結(jié)果的判讀終端和信息處理方式更加多樣化，數(shù)據(jù)分析通過聯(lián)網(wǎng)可以快速得到全面、豐富的診療信息，以此推動(dòng)了床旁醫(yī)療管理的進(jìn)程。

紙基功能材料的生物傳感技術(shù)在POCT領(lǐng)域應(yīng)用面臨的挑戰(zhàn)，主要集中在以下兩個(gè)方面：(1)提高靈敏度和特異度。(2)優(yōu)化設(shè)備抗干擾能力從而適應(yīng)極端氣候等更廣泛的測(cè)試條件。對(duì)這兩方面的改善，需要圍繞紙基的材料本身、制備方式、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)等每個(gè)細(xì)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)，跨學(xué)科的深度合作也將更好地推動(dòng)紙基功能材料的生物傳感技術(shù)在POCT中的應(yīng)用。