周旭，莊思遠(yuǎn)，李彥杰，劉箬瑤，劉春明，李賽男，張語(yǔ)遲

（長(zhǎng)春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130032）

靈芝（Ganoderma lucidum），又名三秀、神芝，為多孔菌目（Polyporales）、靈芝科（Ganodermataceae）、靈芝屬（Ganoderma），其味甘能補(bǔ)、性溫，具備扶正固本、補(bǔ)益肺氣、保肝護(hù)肝和鎮(zhèn)靜安神等功效[1]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，靈芝含三萜[2,3]、多糖[4-6]、生物堿、氨基酸和蛋白質(zhì)等多種活性成分[7,8]，其中三萜類(lèi)化合物是重要的活性組分，臨床上常用于慢性支氣管炎、冠心病等癥的治療以及癌癥化療之后的輔助治療[9,10]。

傳統(tǒng)提取方法主要有溶劑法和蒸餾法等，其中水煮法、浸漬法、超聲波提取技術(shù)和連續(xù)回流提取技術(shù)均隸屬于溶劑法。傳統(tǒng)的浸漬法，得率較低、耗時(shí)耗能且易產(chǎn)生廢氣污染。超聲波提取作為新式提取方法，具備節(jié)能、省時(shí)、運(yùn)行成本低和得率高等優(yōu)點(diǎn)，普遍用于動(dòng)植物、細(xì)菌學(xué)和中草藥等科學(xué)研究領(lǐng)域[11]。響應(yīng)面分析法（Response Surface Methodology，RSM）作為一種重要的綜合設(shè)計(jì)確定性試驗(yàn)和數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系的優(yōu)化方法，已普遍應(yīng)用于中草藥提取工藝優(yōu)化等方面，該方法是將影響提取試驗(yàn)結(jié)果的因素進(jìn)行設(shè)計(jì)，然后按照設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)得到試驗(yàn)結(jié)果[12]，分析試驗(yàn)因素和試驗(yàn)結(jié)果之間的數(shù)學(xué)關(guān)系，進(jìn)而得到最優(yōu)的試驗(yàn)條件[13]。本研究利用超聲波技術(shù)提取赤靈芝中的三萜類(lèi)成分，以赤靈芝總?cè)频牡寐蕿橹笜?biāo)，結(jié)合響應(yīng)面法篩選赤靈芝總?cè)铺崛l件，最終得到最佳提取工藝參數(shù)。

脂肪氧化酶（Lipoxygenase，LOX）俗稱(chēng)脂氧合酶，該酶是一種包含非血紅素鐵的過(guò)氧化物酶，其專(zhuān)門(mén)催化多元不飽和脂肪酸（含有順、順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)）發(fā)生加氧反應(yīng)，從而形成含共軛雙鍵的不飽和脂肪酸氫過(guò)氧化物，呈球型，可溶，無(wú)色，其分子量在動(dòng)物中為75 ku～80 ku，植物中為90 ku～104 ku，LOX一般遍布于動(dòng)植物中，主要涉及植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老、脂質(zhì)過(guò)氧化及其它脅迫反應(yīng)等[14-18]，LOX抑制劑通常作為抗炎活性研究的主導(dǎo)。炎癥是指機(jī)體被外來(lái)物質(zhì)、侵染或其他緣由導(dǎo)致?lián)p傷后作出的一種反應(yīng)，形成炎癥的首要因素是炎癥介質(zhì)和相關(guān)細(xì)胞之間的互相反應(yīng)。測(cè)定某種物質(zhì)對(duì)脂肪氧化酶的抑制率水平可在特定環(huán)境下體現(xiàn)該物質(zhì)的抗炎活性[19]。靈芝在炎癥治療領(lǐng)域有一定的特色，能夠有效治療急性腸炎、乳腺炎、肝炎等炎性疾病，對(duì)各種原因?qū)е碌钠つw炎癥也具有較好的治療作用。靈芝三萜提取物通過(guò)抑制脂氧合酶的活性可以有效防止炎癥，例如對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的急性炎癥和福爾馬林誘導(dǎo)的慢性炎癥導(dǎo)致的爪水腫有顯著療效[20]。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，赤靈芝中活性成分對(duì)抗炎的相關(guān)研究報(bào)道較少，因此，赤靈芝中的活性物質(zhì)對(duì)應(yīng)相關(guān)炎癥治療作用機(jī)制仍需深入探究。

超濾質(zhì)譜技術(shù)是近年來(lái)常用的一種新的研究手段，它結(jié)合了超濾和質(zhì)譜兩種方法。親和超濾質(zhì)譜（Affinity Ultrafiltration Mass Spectrometry，AUF-MS）技術(shù)是利用藥物配體和靶蛋白之間特異性結(jié)合的特性，將具有活性成分的混合物與靶蛋白充分混合，得到結(jié)合的復(fù)合物和未結(jié)合的配體，濾掉未結(jié)合的配體，保留配體與靶分子結(jié)合的復(fù)合物，加入有機(jī)試劑將復(fù)合物變性分解，釋放出結(jié)合配體，進(jìn)而通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）法分析鑒定化合物的活性成分。此技術(shù)能夠高效篩選特定疾病的靶蛋白，篩選的藥物配體靶向鮮明、藥理活性明顯，為當(dāng)代醫(yī)藥學(xué)提供開(kāi)發(fā)利用的價(jià)值[21]。本研究采用液相色譜-超濾-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，首先選取脂肪氧化酶作為與炎癥相關(guān)的生物靶分子，將受體酶和藥物配體混合在體外進(jìn)行孵化，形成與脂肪氧化酶結(jié)合的復(fù)合物和未結(jié)合的配體，超濾膜濾掉未結(jié)合的配體，加入有機(jī)試劑使復(fù)合物解離變性，釋放出結(jié)合配體，再通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)其結(jié)合配體進(jìn)行分析鑒定。研究結(jié)果表明，超濾質(zhì)譜技術(shù)適用于從傳統(tǒng)中藥中篩選脂肪氧化酶抑制劑，該方法快速、靈敏、具有高通量的特點(diǎn)，為天然抗炎藥的篩選和開(kāi)發(fā)提供科學(xué)有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤靈芝藥材購(gòu)自吉林省長(zhǎng)春市北京同仁堂藥店，經(jīng)長(zhǎng)春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室劉春明教授鑒定確認(rèn)為多孔菌科藥用真菌靈芝（Ganoderma lucidum）。

脂肪氧化酶，杭州安沃生物科技有限公司；齊墩果酸（純度≥92.8%），中國(guó)食品藥品檢定研究院；香草醛，上海生工生物工程有限公司；靈芝酸C2、靈芝酸D2、靈芝酸B、靈芝酸F、靈芝酸A，均純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；PBS緩沖溶液，Bueke公司；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制，美國(guó)Millipore公司；甲醇、乙腈均為色譜純，美國(guó)ThermoFisher公司；95%乙醇、冰乙酸均為分析純，北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC-Q-Extractive超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；Waters 2695高效液相色譜儀、Waters 2998 DAD檢測(cè)器、分析型SunFireTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，I.D. 5 μm），美國(guó)Waters公司；Evaluation600型紫外-可見(jiàn)分光光度儀，美國(guó)ThermoScientific公司；恒溫水浴鍋，北京泰克儀器公司；高速多功能粉碎機(jī)，武義海納電器有限公司；離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；超濾離心管，德國(guó)Merck公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 赤靈芝總?cè)频奶崛?/p>

稱(chēng)取赤靈芝藥材10 g，用30倍量的75%乙醇浸漬40 min，通過(guò)加熱裝置回流提取3次，每次1.5 h，提取液經(jīng)抽濾濾去藥渣并將清液濃縮至干，備用。稱(chēng)取赤靈芝粗提物50 mg，溶于50%的甲醇水溶液中，配成50 mg/mL的樣品溶液，待用。

1.3.2 總?cè)铺崛〉膯我蛩貙?shí)驗(yàn)

設(shè)計(jì)各單因素試驗(yàn)中不同考察情況見(jiàn)表1。除說(shuō)明考察變量條件不同外，其他影響因素均設(shè)置為料液比（乙醇）1:30、乙醇濃度75%、提取時(shí)間1.5 h、提取次數(shù)3次。

表1 總?cè)铺崛〉膯我蛩卦囼?yàn)設(shè)計(jì)表 Table 1 Single factor test design table for total triterpene extraction

1.3.3 總?cè)频寐薯憫?yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化赤靈芝中總?cè)铺崛〉母饔绊懸蛩?。利用Design-Expert11.0軟件設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)，進(jìn)行分析，研究赤靈芝總?cè)频淖罴烟崛」に?。試?yàn)中赤芝總?cè)频寐实乃囊蛩嘏c其對(duì)應(yīng)水平編碼設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平編碼表 Table 2 Response surface analysis test factor level coding table

1.3.4 三萜含量的測(cè)定

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱(chēng)2 mg齊墩果酸對(duì)照品于10 mL容量瓶，加甲醇至刻度線定容，制得齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。分別取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10支干燥試管，將其95 ℃水浴蒸干，分別向10支試管內(nèi)加入0.3 mL現(xiàn)制5%香草醛-冰乙酸，再分別加入1.0 mL HClO4，待混合均勻后，置于75 ℃水浴鍋加熱15 min，使其均勻反應(yīng)；用冰乙酸補(bǔ)充至10.0 mL容量瓶刻度線處，在λ=560 nm處，檢測(cè)紫外吸收。測(cè)定并繪制齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，如圖1，該回歸方程為y=71.811x-0.0563（R2=0.9991）。

1.3.4.2 樣品的測(cè)定 將赤靈芝樣品以75%乙醇為溶劑配成溶液，按照“1.3.4.1項(xiàng)”下操作步驟測(cè)吸光度值，依據(jù)回歸方程可計(jì)算三萜濃度。

1.3.4.3 總?cè)频寐视?jì)算

式中：

ρ——三萜濃度，mg/mL；

V——溶液體積，mL；

m——樣品總質(zhì)量，g。

1.3.5 高效液相色譜條件

C18色譜柱（SunFireTM，250 mm×4.6 mm，Waters），以乙腈（A）和超純水（C）作為流動(dòng)相，梯度程序?yàn)椋?～5 min，2% A，5～22 min，2%～22% A，22～24 min，22% A，24～60 min，22%～40% A；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣體積為8.0 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm、257 nm、268 nm；柱溫：30 ℃。

1.3.6 UPLC-Q-Extractive條件

UPLC選擇二元線性梯度洗脫：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相C為超純水，流動(dòng)相梯度程序：0～5 min，2% A，5～20 min，2%～40% A，20～60 min，40%～80% A；流速：0.3 mL/min；樣品進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm、257 nm、268 nm；柱溫：30 ℃。液相色譜光電二級(jí)陣列管檢測(cè)器通過(guò)三通閥和質(zhì)譜相連接，離子源：電噴霧離子源（ESI）；分析模式：負(fù)離子模式；掃描范圍m/z：100～1000；離子阱條件：離子源噴霧電壓4.5 kV，鞘氣輔助氣為氮?dú)?，流速?0 L/min，離子阱壓力3.1×107Pa；金屬毛細(xì)管溫度350 ℃，金屬毛細(xì)管電壓3.5 V。

1.3.7 超濾試驗(yàn)篩選脂肪氧化酶抑制劑

30.0 μL赤靈芝樣品溶液（100.0 mg/mL）分別與90.0 μL不同活度的脂肪氧化酶（0.5、1.0、10 U/mL）混合，各加100.0 μL PBS緩沖溶液，于37 ℃水浴鍋中孵育30 min，通過(guò)100 KD濾膜分離未結(jié)合的小分子配體和結(jié)合的大分子復(fù)合物。加入100.0 μL 50%甲醇水（50:50，V:V）沖洗膜上結(jié)合的大分子復(fù)合物，在室溫下離心（12000 ×g）10 min，若膜上還殘留有結(jié)合的復(fù)合物則重復(fù)上一步驟。空白實(shí)驗(yàn)組用相同體積的PBS緩沖溶液替代酶，其他條件與實(shí)驗(yàn)組相同，最后得到的溶液用“1.3.5項(xiàng)”下條件檢測(cè)。

樣品對(duì)脂肪氧化酶的結(jié)合強(qiáng)度（%）按下式計(jì)算：

式中：

A0——原提取液中該化合物的初始峰面積；

A1——與脂肪氧化酶結(jié)合的復(fù)合物的峰面積，結(jié)合強(qiáng)度反映了三萜類(lèi)化合物與脂肪氧化酶結(jié)合能力的大小[22]。

利用紫外-可見(jiàn)分光光度法檢測(cè)赤靈芝提取物對(duì)LOX的抑制率可在一定程度上反映其抗炎活性。在234 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)反應(yīng)液的吸光度（A）值[23]。

樣品對(duì)脂肪氧化酶活性的抑制率（%）按下式計(jì)算:

式中：

A空白——不加待測(cè)樣品反應(yīng)后的吸光值；

A樣品——加入待測(cè)樣品反應(yīng)后的吸光值；

A背景——只加待測(cè)樣品的吸光值。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面分析在Design Expert 11.0軟件上進(jìn)行；統(tǒng)計(jì)分析作圖均在Office Excel 2019 software軟件上進(jìn)行；測(cè)試平行3次，顯著性差異采用SPSS 19.0 Duncan’s multiple range test分析（p＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)總?cè)频寐实挠绊?/p>

研究表明不同料液比對(duì)于赤芝有效成分的得率具有不一致的影響。分別設(shè)置料液比為1:10、1:20、1:30、1:40、1:50五組試驗(yàn)，考察其結(jié)果，如圖2所示。

由圖2可知，五組試驗(yàn)的總?cè)铺崛〉寐食尸F(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榭側(cè)频娜艹隽侩S著提取劑的增加而逐漸增多，直至三萜溶解達(dá)到飽和；由于溶出物濃度、雜質(zhì)溶解度等方面的影響，得率會(huì)在一定料液比的范圍內(nèi)出現(xiàn)峰值；但提取劑過(guò)多時(shí)，原料中其他物質(zhì)如甾體等也大量溶解在提取劑中，對(duì)三萜起到吸附作用，從而引起總?cè)频寐氏陆怠?/p>

2.1.2 乙醇濃度對(duì)總?cè)频寐实挠绊?/p>

三萜類(lèi)物質(zhì)成分復(fù)雜，可溶于乙醇等極性較大的試劑中。不同的三萜化合物其極性具有差異，利用有機(jī)溶劑提取三萜類(lèi)物質(zhì)，需要根據(jù)三萜類(lèi)化合物與雜質(zhì)極性不同進(jìn)行選擇。三萜類(lèi)化合物極性不同，在不同極性的提取劑中的得率也不同。試驗(yàn)考察條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)，分別為65%、75%、85%、95%、100%五組，試驗(yàn)結(jié)果如圖3。

由圖3可知，當(dāng)提取劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)，赤芝總?cè)频寐蔬_(dá)到最大值。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在75%前時(shí)，總?cè)频寐孰S體積分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；然而，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)大于75%后，其得率又出現(xiàn)依次遞減的趨勢(shì)。主要原因可能是增大乙醇濃度可以促使細(xì)胞溶脹，有利于提取劑向細(xì)胞內(nèi)部的滲透，從而提高了總?cè)频牡寐剩坏掖紳舛冗^(guò)高，導(dǎo)致溶液體系的極性下降，使赤靈芝中的醇溶性、脂溶性雜質(zhì)與脂溶性三萜競(jìng)爭(zhēng)溶劑，由于一部分水溶性三萜類(lèi)成分不溶于高濃度的乙醇溶劑，致使總?cè)频寐食尸F(xiàn)出降低的趨勢(shì)。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)總?cè)频寐实挠绊?/p>

三萜的提取是一個(gè)物質(zhì)轉(zhuǎn)移的過(guò)程。相同條件下的不同時(shí)間階段，三萜的析出程度不同，導(dǎo)致三萜的得率也有所不同。相關(guān)研究表明，三萜得率與提取時(shí)間并非呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。分別設(shè)置1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h五組試驗(yàn)，考察其影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，在1.0～1.5 h區(qū)間內(nèi)赤芝總?cè)频寐逝c提取時(shí)間呈正相關(guān)的關(guān)系。當(dāng)提取時(shí)間大于1.5 h時(shí)，赤芝的總?cè)频寐氏陆?。推測(cè)這是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致如甾體類(lèi)、多糖類(lèi)等其他組分溶出，或部分三萜類(lèi)化合物被氧化，從而引起總?cè)频寐氏陆怠?/p>

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)總?cè)频寐实挠绊?/p>

由圖5可見(jiàn)，提取次數(shù)對(duì)赤芝總?cè)铺崛〉寐实挠绊戄^大，當(dāng)提取次數(shù)為1～3次時(shí)，總?cè)铺崛〉寐孰S次數(shù)的增多而不斷升高，而當(dāng)提取次數(shù)超過(guò)3次時(shí)，三萜成分得率隨提取次數(shù)增加而發(fā)生緩慢降低的趨勢(shì)。推測(cè)這是因?yàn)閯傞_(kāi)始提取到第三次提取完成，提取溶劑能夠逐漸與赤靈芝充分地接觸，故總?cè)频寐手饾u升高，當(dāng)提取次數(shù)為三次時(shí)，藥材中的總?cè)埔鸦咎崛⊥耆?dāng)繼續(xù)增加提取次數(shù)時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致如甾體類(lèi)等其他組分的溶出，從而引起總?cè)频寐示従徬陆怠?/p>

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

利用DesignExpert 11.0軟件針對(duì)上述各影響因素設(shè)計(jì)Box-Benhnken試驗(yàn)，采取響應(yīng)面分析法（4因素3水平），將響應(yīng)值定為赤靈芝總?cè)频牡寐?，以此進(jìn)行提取工藝條件的優(yōu)化，如表3為試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果。

表3 Box-Benhnken設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果 Table 3 Box-Benhnken design scheme and test results

結(jié)論：經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理，可知赤芝總?cè)频寐实幕貧w方程：Y(%)=1.09+0.02A+0.01B+0.01C+0.02D- 2.50×10-3AB-3.75×10-3AC-5.00×10-3AD-5.00×10-3BC -1.25×10-3BD+0.00CD-0.15A2-0.13B2-0.15C2-0.17D2

方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，該回歸方程p＜0.05，表明該數(shù)學(xué)模型顯著，失擬項(xiàng)p＞0.05，表明失擬差異很小，這說(shuō)明該數(shù)學(xué)模型與赤靈芝總?cè)频膶?shí)際得率情況擬合良好。對(duì)各因素進(jìn)行綜合分析表明，一次項(xiàng)B、C不顯著，A、D極顯著，說(shuō)明料液比和提取次數(shù)兩個(gè)因素的影響較小，對(duì)總?cè)频寐视绊懽铒@著的因素是提取時(shí)間，次顯著為乙醇體積分?jǐn)?shù)；各因素之間交互項(xiàng)不顯著，表明這4個(gè)因素之間的交叉變化作用不大。

表4 總?cè)频寐驶貧w方程方差分析 Table 4 Variance analysis of regression equation for extraction rate of total triterpenes

根據(jù)圖6的曲面圖可知，各響應(yīng)曲面圖的開(kāi)口全部向下，而且等高線圖的最小橢圓形中點(diǎn)處于已取試驗(yàn)因素條件區(qū)間內(nèi)，說(shuō)明赤靈芝總?cè)频寐试诟饕蛩卦O(shè)置的范圍內(nèi)具有最大值。等高線越集中則標(biāo)志著該因素對(duì)總?cè)频寐实淖饔迷酱?。由此可分析得出，根?jù)圖6a、6e、6f可以得出，提取次數(shù)對(duì)得率的作用較為突出，伴隨提取次數(shù)逐次遞增，赤靈芝總?cè)频寐食蕭佄锞€型關(guān)系，并存在極大值，此時(shí)極大值為3次；圖6a、6b、6c顯示總?cè)频牡寐适芤掖俭w積分?jǐn)?shù)的影響顯著，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷增大，呈現(xiàn)出提取得率先升后降的情況；由圖6c、6d、6f顯示提取時(shí)間對(duì)得率存在一定影響，當(dāng)時(shí)間為1.5 h左右時(shí)得率最大；由圖6b、6d、6e結(jié)果顯示總?cè)频寐适芰弦罕鹊挠绊戄^小，但總體趨勢(shì)呈現(xiàn)先上升而后下降，當(dāng)料液比達(dá)到1:30時(shí)，總?cè)铺崛〉寐蔬_(dá)到了最大。三維曲面圖反映的效果與上述回歸系數(shù)的顯著性分析結(jié)論相吻合。

續(xù)表4

2.2.2 最佳提取工藝的預(yù)測(cè)和試驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)Design-Expert 11.0建立的數(shù)學(xué)模型確定了優(yōu)化后的赤靈芝總?cè)铺崛」に嚄l件為料液比1:30、提取時(shí)間1.5 h、乙醇濃度75%、提取次數(shù)3次。在此條件下，模型推測(cè)得率為1.05%。進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)后結(jié)果顯示，赤靈芝總?cè)频寐蕿?.04%，符合預(yù)期結(jié)果。

2.3 赤靈芝提取物中的化學(xué)成分與脂肪氧化酶生物親和作用

取30 μL赤靈芝提取物（100 mg/mL）分別與90 μL脂肪氧化酶及相同量失活的脂肪氧化酶作用后的HPLC圖如圖7所示，當(dāng)赤靈芝提取物中化學(xué)成分與脂肪氧化酶發(fā)生特異性結(jié)合后，脂肪氧化酶捕獲的配體所對(duì)應(yīng)的峰面積均大于其空白對(duì)照。圖7表明，赤靈芝提取物中有5個(gè)化合物可與脂肪氧化酶結(jié)合。圖7表明，赤靈芝提取物中有5種化合物可以與0.5、1.0和10 U/mL脂肪氧化酶結(jié)合。分別比對(duì)圖7中各液相色譜峰面積，考察化合物與脂肪氧化酶的結(jié)合能力，空白組峰面積值：1061、1194、322、551、359 mV·s；與0.5 U/mL脂肪氧化酶結(jié)合組峰面積值：1483、1807、353、716、402 mV·s；與1.0 U/mL脂肪氧化酶結(jié)合組峰面積值：1488、1823、357、723、405 mV·s；與10 U/mL脂肪氧化酶結(jié)合組峰面積值：1466、1802、351、713 s、400 mV·s。化合物1、2、3、4、5與不同濃度脂肪氧化酶的結(jié)合強(qiáng)度數(shù)值如表5所示。

表5 赤靈芝提取物與脂肪氧化酶結(jié)合強(qiáng)度表 Table 5 Ganoderma lucidum extract and lipoxygenase binding strength table

結(jié)果表明，加脂肪氧化酶的樣品組與空白對(duì)照組相比，化合物1、2、3、4和5的液相色譜峰面積明顯高于空白對(duì)照樣品，證明這5種化合物與脂肪氧化酶存在親和關(guān)系，推測(cè)化合物1、2、3、4、5具有潛在的脂肪氧化酶抑制作用。為實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物1、2、3、4、5的活性驗(yàn)證，以及對(duì)此五種化合物對(duì)脂肪氧化酶抑制作用的數(shù)據(jù)分析，利用紫外-可見(jiàn)分光光度法進(jìn)行了檢測(cè)和分析。靈芝酸C2、靈芝酸B、靈芝酸A、靈芝酸D2和靈芝酸F的抑制率均超過(guò)80%。通過(guò)上述方法檢測(cè)赤靈芝提取物對(duì)LOX活性的抑制率，證明赤靈芝提取物具有脂肪氧化酶的抑制作用。

綜上，赤靈芝提取物中1、2、3、4、5化合物與脂肪氧化酶具有生物親和能力，對(duì)脂肪氧化酶有一定抑制作用，具備潛在抗炎活性。各化合物1、2、3、4、5對(duì)LOX抑制效果強(qiáng)弱順序?yàn)椋海?）靈芝酸B＞（1）靈芝酸C2＞（4）靈芝酸D2＞（5）靈芝酸F＞（3）靈芝酸A。

2.4 應(yīng)用UPLC-Q-Extractive分析赤靈芝中脂肪氧化酶抑制劑

采用“1.3.5”項(xiàng)高效液相色譜分離條件，赤靈芝提取物中的三萜化合物得到較好的分離，如圖8，為赤靈芝提取物的高效液相色譜圖。采取液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)的方法，對(duì)HPLC中主要化合物色譜峰相對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析測(cè)定，結(jié)果如表6所示。

表6 赤靈芝中脂肪氧化酶抑制劑的UPLC-Q-Extractive分析 Table 6 UPLC-Q-Extractive analysis of lipoxygenase inhibitors in Ganoderma lucidum

化合物1保留時(shí)間為21.49 min，一級(jí)質(zhì)譜母離子[M-H]-m/z517.32，通過(guò)多級(jí)譜圖觀察到該準(zhǔn)分子離子脫1分子H2O，進(jìn)而脫掉1分子CO2生成離子碎片m/z[M-H-H2O-CO2]-=455.32；同時(shí)，觀察到Ganoderic acid C2電離之后通過(guò)電子轉(zhuǎn)移和分子重排得到的碎片信息m/z[M-H-C11H20O4]-=301.19、m/z[M-H-C12H22O4]-=287.17、m/z[M-H-C15H20O3]-= 269.18和m/z[M-H-C15H20O3-CH4-H2O]-=235.14。這些碎片信息與文獻(xiàn)中報(bào)道的Ganoderic acid C2質(zhì)譜碎片信息一致，此外，化合物1的保留時(shí)間與靈芝酸C2標(biāo)品一致，因此推測(cè)該化合物為Ganoderic acid C2[24]。利用上述相同的方法，推測(cè)化合物2、3、4和5分別為Ganoderic acid B、Ganoderic acid A、Ganoderic acid D2和Ganoderic acid F[25-28]。

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)廣泛應(yīng)用于各類(lèi)藥用真菌中，如張勇利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)藥用真菌桑黃和樺褐孔菌中的有效成分進(jìn)行分析鑒定，以黃嘌呤氧化酶為作用靶點(diǎn)，快速?gòu)乃幱谜婢痔嵛镏泻Y選潛在酶抑制劑。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展為藥用真菌特色資源的研發(fā)提供了一定的理論依據(jù)[29]。

3 結(jié)論

3.1 以單因素試驗(yàn)為前提，利用響應(yīng)面分析法對(duì)赤靈芝總?cè)铺崛」に噧?yōu)化進(jìn)行一系列試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)立了可準(zhǔn)確評(píng)估赤靈芝總?cè)铺崛〉寐实臄?shù)學(xué)模型；各變量因素的影響強(qiáng)度順序從大到小依次為：提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)和料液比。赤靈芝總?cè)频淖罴烟崛」に嚍椋毫弦罕?:30、提取時(shí)間1.5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、提取次數(shù)3次，總?cè)频寐士蛇_(dá)到1.04%。

3.2 利用超濾質(zhì)譜技術(shù)探究赤靈芝提取物對(duì)脂肪氧化酶活性的抑制作用，證實(shí)了該技術(shù)是一種便捷靈敏高效的分析方法。赤靈芝中5種三萜類(lèi)化合物與脂肪氧化酶均具有生物親和能力，可以抑制脂肪氧化酶生物活性。結(jié)果表明，以脂肪氧化酶作為靶點(diǎn)，利用超濾質(zhì)譜結(jié)合高效液相色譜對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行活性物質(zhì)篩選具有簡(jiǎn)單快速、操作性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，為開(kāi)發(fā)抗炎癥藥物提供有效實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究為赤靈芝資源的開(kāi)發(fā)提供新的思路，并可從中尋找天然抗脂肪氧化酶活性的成分。