陳湘粵，高群玉，李倩，廖森泰，鄒宇曉

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）

（2.廣東省農業(yè)科學院蠶業(yè)與農產品加工研究所，農業(yè)農村部功能食品重點實驗室，廣東廣州 510610）

桑椹，別名烏椹、桑椹子、桑棗等，為桑樹的成熟果實。桑椹在食用方面可以為人體提供多種營養(yǎng)，同時因含有蘆丁、花青素等活性物質可作為藥材使用。桑椹是第一批由國家衛(wèi)生部認定為“藥食同源”的植物[1]，其中富含的花青素約是藍莓的兩倍，因此對桑椹進行深加工是開發(fā)利用資源的重要渠道之一[2]。植物來源的花色苷是具有優(yōu)良應用前景的天然著色劑[3]，具有抗氧化[4]、抗炎[5]、清除自由基[6]、保護視力[7]、降血糖[8,9]、降血脂[10]和抗動脈硬化[11]等生理活性功能。但天然的花色苷在食品加工和貯藏過程中容易受到pH值、溫度、光照、金屬離子、氧氣微生物等外界因素的影響而發(fā)生降解，生成無色的查爾酮或其同分異構體α-二酮[12]，目前提高花色苷穩(wěn)定性的途徑主要有：分子輔色作用、化學結構修飾、生物工程技術等[13]。而花色苷分子輔色作用方式主要包括分子內輔色、分子間輔色、金屬絡合和自聚合作用4種，常用的輔色劑有酚類化合物、生物堿、金屬離子以及有機酸等[14]。

已有研究表明有機酸對花色苷有明顯的增色效應與紅移效應，然而以桑椹花色苷為對象，考察有機酸對其輔色作用的研究還較少，且桑椹汁等加工制品在加工過程中容易因花色苷的不穩(wěn)定而失去美觀色澤。常用的有機酸包括咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸等，但由于其在水溶液中的低溶解性不適用于食品體系，因此選用對羥基苯甲酸、原兒茶酸、沒食子酸、綠原酸、蘋果酸5種可溶于水的有機酸作為輔色劑，從有機酸自身結構特點出發(fā)，探究有機酸苯環(huán)結構上所連羥基數(shù)不同以及酚酸與脂肪酸對花色苷輔色效果的差異。此外，這幾種酸都具有功能性，其中，沒食子酸、綠原酸是桑屬植物重要的酚類物質，常見于水果、蔬菜、谷物中，具有抗菌、降壓、增高白血球、抗氧化等多種功效，是具有開發(fā)價值的潛在天然抗氧化劑[15]。此研究將對開發(fā)天然植物輔色劑具有重大的實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑椹花色苷購于天津市尖峰天然產物研究開發(fā)有限公司（花色苷含量250 mg/g）。對羥基苯甲酸、原兒茶酸、沒食子酸、綠原酸、蘋果酸（分析純）均購于上海瑞永生物有限公司；磷酸、無水乙酸鈉、氫氧化鈉均為分析純。

1.2 儀器與設備

數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；UV-9100紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；FA2004N賽多利斯精密電子天平，上海精密儀器科學有限公司；Ekspert超高效液相色譜-Triple TOF 5600高分辨率精確質量四極桿飛行時間質譜聯(lián)用儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜-質譜條件

參考Khalifa等[16]的方法并做修改，液相條件：色譜柱C18（2.1×100 mm2，1.7 μm，Waters，USA）；流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為純甲醇，洗脫程序0～10 min：5%～20% B，保留5 min；15～30 min：20%～25% B，保留5 min；35～40 min：25%～33% B；40～42 min：33%～5% B，保留5 min；42～47 min：5% B；流速為0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量2 μL；進樣前平衡5 min。

質譜條件：ESI源；正離子模式；氮氣作為氣簾氣（CUR），35 psi；離子源氣體（GS1和GS2），50 psi；離子化溫度，500 ℃；噴霧電壓，5500 V（+）；碰撞能量（CE），45（+）；掃描范圍，50～1000m/z。

1.3.2 pH值對桑椹花色苷溶液的影響

配置磷酸緩沖溶液（0.02 mol/L乙酸鈉溶液、0.06 mol/L磷酸溶液），用1 mol/L的NaOH溶液調節(jié)緩沖溶液pH值（2.28～10.29），用不同pH值的緩沖溶液配置成濃度為2.5×10-4mol/L的桑椹花色苷溶液。在400～700 nm范圍內，掃描反應溶液的紫外可見光譜。

1.3.3 pH值對輔色反應的影響

分別用pH值2.5、3.5、4.5、5.5的磷酸緩沖溶液配成桑椹花色苷溶液以及五種輔色劑溶液，最終輔色反應體系中桑椹花色苷溶液濃度為2.5×10-4mol/L，輔色劑質量濃度為960 mg/L。將混合溶液置于室溫下黑暗中反應30 min，在400～700 nm范圍內，掃描反應溶液的紫外可見光譜。

1.3.4 溫度對輔色反應的影響

用pH值為3.5的磷酸緩沖溶液配置桑椹花色苷與輔色劑的混合溶液，花色苷濃度為2.5×10-4mol/L，輔色劑質量濃度為960 mg/L?；旌暇鶆蚝?，分別置于20、30、40、50 ℃水浴中避光反應30 min。在400～700 nm范圍內，掃描反應溶液的紫外可見光譜。

1.3.5 輔色劑濃度對輔色反應的影響

輔色實驗參考Molaeafard等[17]的方法，配置磷酸緩沖溶液（0.02 mol/L乙酸鈉溶液、0.06 mol/L磷酸溶液），用1 mol/L NaOH將溶液pH調至3.5。用磷酸緩沖溶液配成濃度約為2.5×10-4mol/L的花色苷溶液，分別加入對羥基苯甲酸、原兒茶酸、沒食子酸、綠原酸、蘋果酸五種輔色劑，每種有機酸質量濃度分別為120、240、480、960 mg/L。將混合均勻后的輔色反應體系置于室溫下黑暗中反應30 min。在400～700 nm范圍內，掃描反應溶液的紫外可見光譜。

1.3.6 熱力學參數(shù)計算

根據(jù)式（1）進行直線擬合求出平衡常數(shù)（K）、化學計量比（n）。

式中：

A——添加不同濃度的輔色劑的花色苷溶液在室溫下暗反應30 min后515 nm處的吸光值；

A0——未添加輔色劑的花色苷溶液在室溫下暗反應30 min后515 nm處的吸光值；

n——輔色劑與花色苷的化學計量比；

[CP]0——輔色劑的濃度。

根據(jù)式（2）計算吉布斯自由能ΔG°

式中：

R——氣體摩爾常數(shù)，8.314 J/(mol·K)；

T——開爾文溫度，K；

K——平衡常數(shù)。

1.3.7 輔色劑對桑椹花色苷熱降解過程的影響

將樣品在恒溫水浴鍋中加熱250 min，每隔50 min取一次樣，測定溶液最大吸收波長處的吸光值Aλmax，計算降解速率常數(shù)k和半衰期T1/2。

式中：

At——t時刻后溶液中花色苷的Aλmax；

A0——加熱前溶液的Aλmax；

t——加熱時間。

1.3.8 可見吸收光譜的測定

可見吸收光譜采用紫外-可見分光光度計進行測定。取樣品3 mL，在400～700 nm范圍內掃描，掃描間隔為1 nm，以蒸餾水調零，比色皿長度為1 cm。

1.3.9 統(tǒng)計分析

每個樣品設置3個平行，采用Excel和SPSS軟件進行比較分析。測定結果以平均值±標準差表示。實驗數(shù)據(jù)采用ANOVA進行turkey差異分析，以p＜0.05為差異顯著。

2 結果與討論

2.1 桑椹花色苷UPLC-MS/MS分析

由圖1和表1可見，樣品中鑒定出4種花色苷單體，a中碎片離子為m/z465.10和303.05，母離子m/z627.16脫去一分子葡萄糖（162）得到碎片離子m/z465.10，脫去第二個葡萄糖分子（162）得到碎片離子m/z303.05，因此推斷a為飛燕草素-3,5-葡萄糖苷[16]；b中碎片離子為m/z 303.15，母離子m/z465.10脫去一分子葡萄糖（162）得到碎片離子m/z303.15，因此推斷b為飛燕草素-3-葡萄糖苷[17]；c中碎片離子為m/z287.06，母離子m/z449.11脫去一分子葡萄糖（162）得到碎片離子m/z287.06，因此推斷c為矢車菊素-3-葡萄糖苷[18]；d中碎片離子為m/z287.06，母離子m/z595.17脫去一分子葡萄糖（162）得到碎片離子m/z287.06，因此推斷d為矢車菊素-3-蕓香糖苷[19]。

表1 桑椹花色苷的二級質譜結果分析 Table 1 UPLC-MS/MS on mulberry anthocyanins

2.2 pH值對桑椹花色苷吸收光譜的影響

桑椹花色苷溶液在不同pH值下的顏色變化規(guī)律見圖3。pH=2.28時，花色苷溶液的顏色為亮紅色。pH從2.28變化到10.29過程中，溶液顏色由亮紅變?yōu)榉奂t，再變?yōu)樽霞t色，最后變?yōu)樯钭仙蚴侨芤簆H值的變化引起花色苷分子結構變化從而引發(fā)溶液的顏色變化[20]。不同pH值桑椹花色苷溶液在400～700 nm范圍內的紫外可見光掃描圖見圖2。pH=2.28時，溶液在514 nm處呈現(xiàn)一個很強的吸收峰，最大吸收波長處吸光值達到1.89，對應圖3中亮紅色。pH值從2.28變化到3.26時，吸收光譜強度明顯下降，最大吸收波長未發(fā)生明顯偏移。當pH上升到6.28時，最大吸收波長處吸光值下降到0.35，且吸收峰明顯變寬，最大吸收波長紅移至547 nm。當pH=7.25時，溶液最大吸收波長紅移至563 nm，pH=8.25時，溶液最大吸收波長紅移至575 nm。當pH從8.25上升到10.29過程中，吸收峰逐漸變窄且吸收強度逐漸增強，最大吸收波長未發(fā)生明顯偏移。

2.3 pH值對輔色反應的影響

不同pH值（2.5、3.5、4.5、5.5）下對羥基苯甲酸、原兒茶酸、沒食子酸、綠原酸、蘋果酸與桑椹花色苷發(fā)生輔色反應的紫外可見光吸收譜圖見圖5。當pH=2.5時，花色苷主要以黃烊鹽陽離子形式存在，且與空白組相比僅有輕微的增色效應和紅移效應。隨著pH值的升高，體系最大吸光值都明顯下降，說明pH值是影響輔色反應的重要因素。其原因是pH值的變化改變了溶液中花色苷的存在形式，使平衡向形成無色物質移動，且五種輔色劑的添加減緩了平衡向生成無色物質移動。5種有機酸均在pH值為3.5～4.5之間時有較好的輔色效果。當pH=3.5時，對羥基苯甲酸、原兒茶酸、沒食子酸、蘋果酸、綠原酸Aλmax分別比空白組高15.89%、20.07%、23.15%、49.26%、41.50%。前期研究表明，輔色反應在弱酸條件下，pH值約為3.6時有更好的輔色效果[21]。在酸性環(huán)境下，溶液平衡向形成無色物質移動，而輔色劑的添加使得平衡向生成有色基團轉變，從而阻止了桑椹花色苷的降解[22]。

在pH=3.5時，其有機酸“護色”效果依次為蘋果酸＞綠原酸＞沒食子酸＞原兒茶酸＞對羥基苯甲酸。有機酸與花色苷輔色反應后生成?；?，其空間位阻阻礙了消色差假堿基和查爾酮結構的形成[23]，且不同有機酸參與的輔色反應均有其最適反應pH，如綠原酸反應的最佳pH范圍為3.2～3.7[22]。因此最終“護色”效果受到有機酸結構及最適pH條件兩方面影響。

2.4 溫度對輔色反應的影響

在pH值為3.5，輔色劑質量濃度為960 mg/L的條件下，研究了在20、30、40、50 ℃下輔色反應。由圖7可見，溫度對輔色反應有影響。隨著溫度的升高，輔色效果逐步下降。如溫度從20 ℃升高到30 ℃，空白組與對羥基苯甲酸、原兒茶酸、沒食子酸、蘋果酸、綠原酸組Aλmax分別下降了8.80%、9.50%、10.04%、10.17%、7.79%、9.36%；溫度升高至40 ℃，六種體系Aλmax分別下降了15.30%、16.57%、16.22%、15.73%、10.51%、14.35%；體系溫度升高至50 ℃，六種體系Aλmax分別下降了19.39%、25.32%、24.78%、24.00%、16.00%、17.89%。由以上結果可以推斷桑椹花色苷與五種輔色劑的反應屬于放熱反應，高溫會減弱輔色效果。在此研究中，五種輔色劑均在20 ℃時對桑椹花色苷有較好的輔色效果。

2.5 輔色劑質量濃度對輔色反應的影響

輔色劑濃度對輔色效果的影響見圖8，對羥基苯甲酸、原兒茶酸、沒食子酸、綠原酸、蘋果酸這5種有機酸均對桑椹花色苷有增色作用，且隨著輔色劑質量濃度從120 mg/L升高到960 mg/L，體系的Aλmax逐漸增大，輔色作用增強。當輔色劑質量濃度為120 mg/L時，與空白組相比，添加對羥基苯甲酸、原兒茶酸、沒食子酸、綠原酸、蘋果酸的體系Aλmax分別增加了2.17%、2.84%、2.72%、6.61%、8.11%。質量濃度為960 mg/L時，體系Aλmax分別增加了17.86%、20.79%、24.84%、37.10%、45.04%。增色效應伴隨紅移效應，溶液λmax發(fā)生1～4 nm的偏移，且隨著濃度的升高，偏移越多。這與Zhu等[24]的文章描述一致。

在花色苷混合體系中存在以上三種平衡，其中AH+為黃烊鹽離子，CP為輔色劑。無色的輔色劑溶液與花色苷的黃烊鹽離子結合導致平衡朝著生成黃烊鹽離子方向移動。隨著輔色劑濃度升高，生成的增色復合物越多，體系的Aλmax越大。因更高濃度的輔色劑中有更多羧基與花色苷母核發(fā)生?；磻瑥亩剑?）中平衡朝生成增色復合物的方向移動，產生增色效應。

由表2可見，當質量濃度為120 mg/L時，對羥基苯甲酸、原兒茶酸、沒食子酸組與空白組相比，Aλmax沒有差異（p≥0.05），綠原酸與蘋果酸組與空白組的Aλmax有差異（p＜0.05），說明綠原酸與蘋果酸輔色作用優(yōu)于三種酚酸。當輔色劑質量濃度為960 mg/L時，5個輔色組與空白組的Aλmax都有差異（p＜0.05），說明在此質量濃度下5種輔色劑對桑椹花色苷均有輔色效果，且5個輔色組間也有差異（p＜0.05）。輔色劑的化學結構對輔色反應有很大影響[25]，對于4種酚酸，苯環(huán)上的π-π共軛是酚酸與花色苷分子間發(fā)生輔色反應的內在驅動力，此外苯環(huán)上的羥基可與花色苷分子相互作用形成氫鍵或發(fā)生電荷轉移[17]，因此羥基最多的綠原酸輔色效果最好，對羥基苯甲酸輔色效果最弱。蘋果酸是短鏈脂肪酸，在5種酸中輔色效果最佳，據(jù)文獻報道[13]有機酸與花色苷分子形成的結合物由于疏水作用使花色苷母核和酰基平面殘基形成了上下垂直的多層重疊結構，形成類似“三明治”的“夾心”結構，折疊的酰基緊緊纏繞在2-苯基苯并吡喃骨架的表面，通過空間位阻效應保護了夾在兩個有機酸分子間的花色苷母核，而蘋果酸較好的輔色效果可能與此結構有關。

表2 不同質量濃度的輔色劑與桑椹花色苷輔色后的Aλmax Table 2 The Aλmax of the co-pigmentation of mulberry anthocyanin with different concentration and co-pigments at 20 ℃ and pH 3.5

2.6 輔色反應的熱力學參數(shù)

根據(jù)方程（1）（2），擬合ln[(A-A0)/A0]與ln[CP]0的方程（R2＞0.90），lnk為擬合方程的截距。計算得到輔色反應的化學計量比n、平衡常數(shù)K、吉布斯自由能ΔG°如表3所示。化學計量比n代表桑椹花色苷黃酮陽離子連接每個色素的分子數(shù)[26]，平衡常數(shù)K表示輔色劑與花色苷之間發(fā)生輔色反應的強度[27]，ΔG°表示發(fā)生輔色反應所需的能量[17]。表中所有的ΔG°都小于0，說明五種輔色劑與花色苷的反應都是自發(fā)反應。輔色劑的分子結構和帶電性質的不同可能導致反應的平衡常數(shù)K與ΔG°產生差異[25]，平衡常數(shù)K值和ΔG°與輔色劑輔色效果表現(xiàn)出一致性，即輔色效果越好的酸其反應平衡常數(shù)越大，ΔG°值越小，說明其與花色苷反應強度越大，輔色反應所需的能量越小。反應的n值在0.78～1.06之間，與前期研究結果相一致[21,28]。

表3 各輔色劑參與輔色反應的熱力學常數(shù) Table 3 Thermodynamic properties for the co-pigmentation reactions of mulberry anthocyanin with different co-pigments

2.7 輔色劑對桑椹花色苷熱降解過程的影響

分別將空白組與添加輔色劑的樣品置于60、70、80 ℃水浴中加熱250 min，每隔50 min取樣，比較空白組與加入輔色劑組的熱降解特性。在加熱過程中，空白組與添加輔色劑組的最大吸收光值隨著加熱時間增加而降低，原因是高溫易導致花色苷發(fā)生降解，使花色苷含量降低，這與前面2.3中結果一致。其熱降解動力學參數(shù)符合一級動力學方程。

根據(jù)式（3）（4）可以計算得出表4數(shù)據(jù)，分析可知，溫度對花色苷的降解有重要影響，隨著溫度升高，對照組與實驗組的降解常數(shù)（k）值都升高，而半衰期（T1/2）都隨之降低。這表明溫度升高，熱降解速率增加，最終導致花色苷的半衰期減小。這一結果得到Qian等[29]的研究驗證。除此之外，實驗組的降解速率都小于對照組，半衰期都大于對照組。由此可以推斷以有機酸作為輔色劑，可以一定程度上改善花色苷的熱穩(wěn)定性。Kanha等[26]選用阿魏酸、多巴胺、兒茶素作為輔色劑，研究了其對C-3-g熱穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)輔色劑可以明顯改善C-3-g的熱穩(wěn)定性。

表4 輔色劑（960 mg/L，20 ℃，pH=3.5）與桑椹花色苷輔色后在60、70、80 ℃下的熱降解動力學 Table 4 First-order kinetic parameters for thermal degradation of the co-pigmentation reaction of mulberry anthocyanin with different co-pigments

3 結論

桑椹花色苷中主要含有四種花色苷單體，分別是飛燕草素-3,5-葡萄糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷。五種有機酸均可以通過輔色作用提高桑椹花色苷溶液的顏色強度，溶液pH、溫度、輔色劑濃度及其結構均是輔色反應的重要影響因素。其中蘋果酸在pH=3.5、20 ℃、960 mg/L濃度下增色效果最佳，比空白組Aλmax增加45.04%，且有機酸苯環(huán)結構上所連羥基越多輔色效果越強。此外，有機酸可以降低花色苷溶液降解常數(shù)（k），延長半衰期（T1/2），從而提高桑椹花色苷的熱穩(wěn)定性。因此在桑椹花色苷溶液中添加適量有機酸是緩解花色苷因pH值、高溫等外界因素發(fā)生降解的有效方法，是一種安全有效的改善桑椹飲品顏色品質的方法，對改善果酒及果汁飲品生產廠家利用天然色素調節(jié)產品色澤具有重要的理論和實際意義。