白東虎，賈宇榮，白春梅，武麗梅，楊芊鈺

(榆林市藥品檢驗所，陜西 榆林 719000)

質(zhì)量控制一直是中藥應用時需要考慮的核心問題。近年來，中藥質(zhì)量控制已從化學成分定性定量分析發(fā)展到整體評價階段。不同產(chǎn)地、不同來源等差異和變化都會導致不同批次的藥材在藥用成分上存在顯著的差異，單一檢測手段建立的指紋圖譜也越發(fā)不能滿足中藥質(zhì)量評價的要求。因此，建立合理、準確、信息豐富的中藥指紋圖譜用以中藥質(zhì)量控制就顯得尤為重要。近年來，基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-Q-TOF-MS)技術(shù)建立的中藥指紋圖譜以靈敏度高、穩(wěn)定性好的特質(zhì)成為研究人員的又一青睞對象。本文結(jié)合文獻，從多方面歸納分析，以期為UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)在中藥指紋圖譜研究中的應用提供參考。

1 中藥指紋圖譜概述

1.1 中藥指紋圖譜與質(zhì)量評價的關(guān)系

中藥，作為多組分的有機整體，化學成分復雜，若僅以一種或少數(shù)幾種指標成分對其質(zhì)量進行評價，不足以全面體現(xiàn)質(zhì)量的優(yōu)劣。中藥指紋圖譜法是指，通過對中藥進行提取，采用合適的分析技術(shù)或方法對特征化學成分進行表征，進而得到體現(xiàn)中藥整體特征的色譜或光譜圖的分析方法[1]，是一種綜合的、可量化的化學鑒定手段。指紋圖譜所反映的化學成分信息(具體表現(xiàn)為相對保留時間和相對峰面積)具有高度特異性和選擇性，可較充分地反映出中藥復雜混合體系中各種化學成分含量分布的整體狀況。尤其是在現(xiàn)階段有效成分大多數(shù)沒有明確的情況下，它能夠結(jié)合各種色譜、光譜手段，特征性地鑒定中藥的真?zhèn)闻c優(yōu)劣，成為中藥自身的“化學條碼”[2]。經(jīng)過近些年的長足發(fā)展，中藥指紋圖譜研究也已由在方法和技術(shù)方面的基礎(chǔ)研究，進入到中藥質(zhì)量控制和評價的實際應用中[3]。中藥指紋圖譜技術(shù)，作為中藥材質(zhì)量控制的方法，已成為一種國際共識，在中藥檢驗、研究和中藥現(xiàn)代化發(fā)展過程中發(fā)揮著越來越重要的作用。從2010年版開始，歷版《中華人民共和國藥典》的變化也可看出，指紋圖譜的評價指標在不斷完善，它在中藥質(zhì)量評價中的作用也逐漸增加[4]。

1.2 中藥指紋圖譜分類

中藥指紋圖譜按所用技術(shù)可分為化學、生物、代謝指紋圖譜三大類。其中，化學指紋圖譜是依據(jù)中藥所含化學成分種類及含量，應用不同的儀器、方法檢測得到的指紋圖譜，它又可分為光譜和色譜指紋圖譜。常用的光譜指紋圖譜有紫外、紅外、熒光、核磁共振、X射線衍射光譜等，由于這些方法能夠給出藥效物質(zhì)基礎(chǔ)或部分特定化學結(jié)構(gòu)信息，所以它們可以作為輔助手段配合中藥色譜指紋圖譜的研究。得益于現(xiàn)代色譜技術(shù)的發(fā)展，色譜指紋圖譜也成為發(fā)展最快速、應用最廣泛的中藥指紋圖譜。常用的色譜指紋圖譜技術(shù)有薄層色譜、氣相色譜、液相色譜、高效毛細管電泳指紋圖譜等[5]。高效液相色譜(HPLC)是指紋圖譜研究中應用最廣泛的方法之一，但是傳統(tǒng)HPLC指紋圖譜操作周期長、工作量大，不能完整地表征藥材內(nèi)在的化學質(zhì)量，且多采用UV檢測器，無法體現(xiàn)無紫外吸收的其它類成分。因此，傳統(tǒng)HPLC指紋圖譜技術(shù)用于藥材質(zhì)量的評價，具有一定的片面性。近年來新發(fā)展起來的UPLC-Q-TOF-MS分析技術(shù)，集UPLC高效分離能力和Q-TOF-MS/MS高分辨質(zhì)譜解析能力于一體，能夠快速建立指紋圖譜，并能直觀、綜合地應用于中藥質(zhì)量評價分析，已逐漸成為中藥活性成分和中藥指紋圖譜研究的最有效的分析手段之一。

2 UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)特征

2.1 UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)工作流程

UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)是將超高效液相色譜(UPLC)作為色譜分離系統(tǒng)，將四級桿(Q)和飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS)作為質(zhì)量分析器，串聯(lián)而成的一種質(zhì)譜技術(shù)。它的工作流程如圖1所示。

圖1 UPLC-Q-TOF-MS工作流程

樣品經(jīng)超高效液相色譜系統(tǒng)進樣，色譜柱分離。分離流出的組分依次通過接口進入離子源(常用電噴霧電離ESI和大氣壓化學電離APCI兩種離子源)，經(jīng)由離子化形成離子，經(jīng)過四級桿離子光學系統(tǒng)的調(diào)節(jié)形成可控離子束進入飛行時間質(zhì)量分析器。離子束被垂直引入加速區(qū)加速，進入漂移區(qū)，經(jīng)過二級反射鏡后再返回。在第二級質(zhì)量分析器進行質(zhì)譜分離后，分別在檢測器上產(chǎn)生信號，然后經(jīng)過信號轉(zhuǎn)換輸出色譜-質(zhì)譜二維譜圖[6]。最后經(jīng)過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析所采集的數(shù)據(jù)信息，根據(jù)產(chǎn)生并收集到的離子特征對化合物進行定性和定量分析。

2.2 UPLC技術(shù)特點

UPLC是質(zhì)譜檢測器的最佳液相色譜入口之一。UPLC系統(tǒng)達到最佳線速度時(一般在0.25～0.50 mL/min)，與質(zhì)譜能承受的流速(API接口 0.20 mL/min)更加匹配，使得離子化效率提高。此外，UPLC是應小粒徑填料(粒徑<2 μm)和超高壓(壓力> 105kPa)要求而專門設計的[7]，保持了傳統(tǒng)HPLC的基本原理(理論依據(jù)仍源于范迪姆特(VanDeemter)經(jīng)驗方程)，但其分離效能和分離速度得到極大提高,可以顯著改善色譜峰的分離度、檢測靈敏度，并縮短分析周期，同時減少了流動相用量從而降低分析成本。

2.3 Q-TOF-MS技術(shù)特點

四級桿質(zhì)量分析器(Q)，由直流和射頻交流電壓疊加的四極電場構(gòu)成，通過設定參數(shù)可使特定質(zhì)荷比(m/z)的離子穩(wěn)定通過，其它離子則以不穩(wěn)定的運動碰到四級桿上被吸濾掉。四級桿具有優(yōu)良的離子過濾能力，因此又叫四級桿濾質(zhì)器[8]。

飛行時間質(zhì)量分析器(TOF-MS)主要由一個離子漂移管構(gòu)成，工作原理是基于動能相同而質(zhì)荷比(m/z)不同的離子在恒定電場中經(jīng)過恒定距離所需時間不同，進行質(zhì)譜分離。進行二級質(zhì)譜分析時，第一重四級桿選擇母離子。加速至一定能量后進入只有射頻的四級碰撞室與惰性氣體碰撞而碎裂成子離子。這些子離子再經(jīng)過加速和聚焦進入飛行時間質(zhì)量分析器，按照質(zhì)核比大小進行分離[9]。飛行時間質(zhì)譜的優(yōu)勢在于掃描范圍寬(50～40000 m/z)，能得到物質(zhì)準確相對分子質(zhì)量，并通過精確質(zhì)量數(shù)和同位素峰形進行數(shù)據(jù)庫檢索比對，可快速地對目標化合物和未知化合物實現(xiàn)精確定性[10]。

總之，UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)極大的發(fā)揮了兩種高性能分析儀器的優(yōu)點。UPLC的特點是分離效果好、分析速度快，而Q-TOF-MS選擇性強、靈敏度高，且有正負離子兩種模式，可以將無法色譜分離的組分實現(xiàn)質(zhì)譜分離，還可以精確檢測相對分子質(zhì)量，其產(chǎn)生的二級質(zhì)譜能提示特征離子碎片信息[11]，這些信息結(jié)合已知結(jié)構(gòu)化合物的裂解等規(guī)律，能對未知成分進行定性、定量分析，這恰好能滿足中藥指紋圖譜研究的需要。

3 UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)在中藥材指紋圖譜研究和質(zhì)量評價中的應用

結(jié)合近期文獻發(fā)現(xiàn)，UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)在中藥材指紋圖譜研究和質(zhì)量評價中的作用主要體現(xiàn)在指紋圖譜中共有峰的指認及鑒定上，包括鑒別已知和未知化學成分。文獻多應用UPLC或HPLC建立中藥材指紋圖譜，并利用相似度評價技術(shù)或主成分分析技術(shù)(PCA)快速辨別主成分峰和差異峰；然后利用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜采集總離子流色譜圖；接著對色譜圖中的各個色譜峰進行精確質(zhì)量數(shù)識別，并結(jié)合保留時間表征中藥材中的化學成分；然后通過對照品比對指認、文獻比對，以及高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析等方法，根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)及同位素推算出分子式，進而結(jié)合二級質(zhì)譜及文獻資料分析鑒定中藥材化學成分；最后給出分析結(jié)論以指導中藥材質(zhì)量控制。

3.1 建立中藥材指紋圖譜并分析化學成分

張玉等[12]建立了合歡花藥材的UPLC特征指紋圖譜，并基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)快速鑒別了合歡花中的主要化學成分，共標示出5個共有峰，各共有峰相對保留時間，RSD均<2%，經(jīng)過質(zhì)譜指認、定性分析共鑒定出多個化合物。劉宏等[13]基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)建立了23批不同產(chǎn)地胡桃楸根藥材指紋圖譜，通過相似度評價和主成分分析，并根據(jù)化合物的精確分子量和碎片信息，結(jié)合文獻數(shù)據(jù)鑒定了其中的化學成分，為胡桃楸根的質(zhì)量評價奠定了基礎(chǔ)。吳惠勤等[14]采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，構(gòu)建了沉香數(shù)字化色譜-質(zhì)譜指紋圖譜，共鑒定出沉香中30個化學成分。趙倩等[15]建立了掌葉大黃UPLC指紋圖譜采集方法，并基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)通過對照品指認、文獻比對及高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析對掌葉大黃的化學成分進行全面定性分析。曹瑞等[16]利用類似技術(shù)方法建立了35批大黃飲片指紋圖譜，并生成對照指紋圖譜，標定共有峰45個，結(jié)合相似度評價技術(shù)建立了大黃飲片質(zhì)量評價方法。

3.2 評價不同來源不同產(chǎn)地中藥材質(zhì)量

葉耀輝等[17]采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)在 35 min內(nèi)建立了不同產(chǎn)地北柴胡藥材的指紋圖譜，并通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理軟件、代謝組學分析軟件對其進行主成分分析，該法能快速全面地區(qū)分不同產(chǎn)地北柴胡藥材中化學成分的差異，評價北柴胡藥材質(zhì)量的優(yōu)劣。李丹丹等[18]采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件建立了30批大黃藥材(掌葉大黃20批、唐古特大黃和藥用大黃各5批)的HPLC指紋圖譜并進行相似度評價，采用偏最小二乘判別法結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)定性鑒別3種來源大黃的差異性成分，該法可有效區(qū)分3種不同來源大黃藥材，為多來源藥材的鑒別和質(zhì)量評價提供了參考。張藏蔓等[19]建立了野生、組織培養(yǎng)和種植等14批不同來源金線蓮藥材超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜指紋圖譜，并基于UPLC-Q-TOF-MS含量測定方法，從中指認出36個化學成分，結(jié)合指紋圖譜相似度考察、聚類分析及含量測定表明對藥材中化學成分種類及含量產(chǎn)生顯著影響的因素為產(chǎn)地和栽培時間。

此外，何席呈等[20]運用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，建立了土茯苓基于內(nèi)標校正的質(zhì)譜指紋圖譜共有模式，反映了貴州產(chǎn)地域性藥材土茯苓的內(nèi)在質(zhì)量。馮光維等[21]采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，建立了不同產(chǎn)地12批地錦草的UPLC指紋圖譜，通過對照品比對指認了16個共有峰中的6個共有峰，表明地錦草在同一地域中的品質(zhì)差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定。陳菲、芮雯等分別運用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)建立指紋圖譜，完成了對不同批次樟芝菌粉和7個產(chǎn)地黃芪藥材的質(zhì)量評價[22-23]。

3.3 評價炮制機制對中藥材化學成分的影響

崔美娜等[24]應用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，對半夏多物料多流程不同階段炮制品進行了研究分析，通過對總離子流指紋圖譜進行分析，根據(jù)色譜保留時間、一級精確質(zhì)荷比、二級的碎片數(shù)據(jù)，同時結(jié)合相關(guān)文獻、數(shù)據(jù)庫以及質(zhì)譜裂解規(guī)律，對主要色譜峰的來源進行了歸屬，發(fā)現(xiàn)半夏炮制前后化學成分存在明顯差異，為探究半夏多物料多流程炮制機制提供一種新的策略。蔡萍等[25]采用指紋圖譜結(jié)合化學計量學對23批不同來源蜜炙百合與生百合質(zhì)量進行評價，基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)和隨機森林算法對差異峰進行鑒別，發(fā)現(xiàn)王百合苷D和B對準確分辨炮制過的蜜炙百合和生百合具有重要貢獻。

3.4 中藥材真?zhèn)舞b別方面的應用

鐘惠嫻等[26]應用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)快速、準確地鑒別了防風和水防風的差異化合物，改法可用于防風指紋圖譜數(shù)據(jù)的快速分析，在防風和水防風性狀極易混淆的情況下，該技術(shù)結(jié)合薄層色譜鑒別法能判別防風藥材的真?zhèn)巍?/p>

4 UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)在中藥復方制劑指紋圖譜研究和質(zhì)量評價中的應用

復方制劑質(zhì)量評價一般遵循整體的概念。基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，對中藥復方制劑的化學成分進行分析鑒別，原理上類似于對中藥材化學成分的分析，區(qū)別是分析鑒別完成后對主要化學成分進行藥材歸屬，從而闡明不同藥材對復方化學成分的貢獻。近年來，應用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)建立并分析中藥復方制劑指紋圖譜，結(jié)合天然產(chǎn)物化合物-高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，并運用大數(shù)據(jù)對比分析，可以快速指認出中藥復方制劑化學成分及其藥材的歸屬，成為一種重要的中成藥制劑質(zhì)量評價方法。

黃廣偉等[27]采用UPLC-Q-TOF-MS在正、負兩種離子模式掃描下，建立指紋圖譜，通過天然產(chǎn)物高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫結(jié)合對照品比對，從芩蘇膠囊中共檢測到68個化學成分，鑒定出22個化學成分，并分析出芩蘇膠囊中6個黃酮類成分來源于黃芩，3個酚酸和3個二萜醌類成分來源于丹參，3個黃酮和5個生物堿類成分來源于苦參，1個酚酸類成分來源于紫蘇子；發(fā)現(xiàn)黃酮、酚酸、二萜醌及生物堿4類成分構(gòu)成了芩蘇膠囊的物質(zhì)基礎(chǔ)。崔璐等[28]基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)研究了不同廠家前列癃閉通片指紋圖譜，并對各樣品的指紋圖譜進行相似度評價，結(jié)合聚類分析評價了9個廠家58批樣品的質(zhì)量，指認了指紋圖譜中主要共有峰的化學成分并確定了其藥材歸屬。吳琦等[29]基于該技術(shù)鑒定抱龍丸中的化學成分并建立指紋圖譜，最終通過軟件預測及文獻數(shù)據(jù),從抱龍丸中鑒定出46個成分，為抱龍丸的質(zhì)量標志物篩選、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制研究提供了參考。馬瑩等[30]運用該技術(shù)建立指紋圖譜并分析發(fā)現(xiàn)桂枝茯苓膠囊中三萜酸類成分主要來自于茯苓藥材。李睿等[31]采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)分析了復方湯劑麻黃湯水提取部分的化學成分。羅藝等[32]運用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對治咳川貝枇杷滴丸的醇提物分析表征并建立指紋圖譜，通過相似度分析，表明不同批次滴丸的質(zhì)量差異較小。

5 UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)在譜效關(guān)系研究中的應用

將中藥指紋圖譜與藥效學試驗有機結(jié)合，研究譜效關(guān)系，能揭示出中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)以及建立中藥質(zhì)量評價標準。譜效關(guān)系是指紋圖譜研究的高級階段，中藥譜效關(guān)系研究常采用化學計量學的方法，建立中藥指紋圖譜與藥效作用之間的相關(guān)性，通過相關(guān)性分析可以更加全面地對中藥質(zhì)量進行控制與評價。整體思路是采用一定的分析方法建立中藥指紋圖譜，并研究其中的化學成分，建立適宜的藥效評估模型，并獲得相應藥理數(shù)據(jù)，通過適宜的數(shù)據(jù)處理技術(shù)對相應的指紋圖譜數(shù)據(jù)及藥理結(jié)果進行相關(guān)性分析從而建立起譜效關(guān)系模型[33]。近年來，已有不少文獻報道借助UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)建立中藥指紋圖譜，然后選擇合適方法對指紋圖譜中各共有峰與藥效指標的相關(guān)性進行分析，進而揭示中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)以及建立中藥質(zhì)量評價標準。

程斌等[34]借助UPLC-Q-TOF-MS，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》建立了10批不同產(chǎn)地浙貝母的指紋圖譜，以小鼠耳腫脹度和血清中丙二醛、一氧化氮水平為藥效指標，采用雙變量相關(guān)分析法和灰色關(guān)聯(lián)度分析法對UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜中各共有峰與抗炎藥效指標的相關(guān)性進行分析，從而篩選出貝母素乙、貝母素甲、環(huán)巴胺等可能是浙貝母具有抗炎作用的質(zhì)量標志物。周姣姣等[35]利用UPLC-Q-TOF-MS，通過標準品比對和文獻檢索對美洲大蠊提取物CⅡ-3所含化合物進行分析鑒定，以CⅡ-3對人肝癌細胞HepG2的半抑制濃度為抗肝癌活性指標，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法和正交偏最小二乘法聯(lián)合建立指紋圖譜與抗肝癌活性之間的譜效關(guān)系，初步闡明了美洲大蠊提取物CⅡ-3體外抗肝癌的活性物質(zhì)，為該藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究和臨床應用提供了實驗依據(jù)。

6 UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)應用建議

UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)的出現(xiàn)使得中藥指紋圖譜的研究更加便捷、高效，也使得中藥的嚴格質(zhì)量把控逐漸成為可能，依靠現(xiàn)代數(shù)據(jù)處理軟件和工具，極大地方便了分離組分質(zhì)譜的解析，使推測物質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)特征變得相對容易。未來中藥分析技術(shù)必將是相互交叉、配合使用的，所以筆者認為，未來該技術(shù)應用著眼于以下幾方面會更加凸顯優(yōu)勢。

1)結(jié)合新興的前處理技術(shù)和其他分析技術(shù)

作為對待測組分提取、富集和純化的樣品前處理步驟，關(guān)系著整個分析方法的優(yōu)劣，還決定著分析結(jié)果的準確性和重現(xiàn)性[36]，未來UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)只有結(jié)合適當?shù)闹兴幥疤幚砑夹g(shù)使用，才能發(fā)揮出更大優(yōu)勢。近年來出現(xiàn)的許多高效、快速和微量化的前處理技術(shù)，如固相微萃取、超臨界流體萃取等，必將在與UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)的配合應用中起關(guān)鍵作用。此外，未來UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)結(jié)合核磁共振、X射線衍射、圓二色譜等輔助分析技術(shù)，更能發(fā)揮該技術(shù)在中藥分析中的定性定量優(yōu)勢。

2)結(jié)合質(zhì)譜大數(shù)據(jù)庫配合軟件分析

中藥的液質(zhì)數(shù)據(jù)庫信息量大，包含非常多的化學成分信息，并且質(zhì)譜解析需輔以一定的專業(yè)知識，這些導致了液質(zhì)的數(shù)據(jù)信息不能被很好地挖掘[37]。如果將UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)與數(shù)據(jù)庫技術(shù)結(jié)合，并配合先進分析軟件輔助中藥成分鑒定，便可以更充分地挖掘液質(zhì)數(shù)據(jù)信息，進一步提高定性鑒別效率，這將是該技術(shù)未來應用的一大趨勢。這點在近些年的中藥分析研究中也常有體現(xiàn)，借助UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)建立一級精確質(zhì)量數(shù)以及二級碎片離子質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫，實現(xiàn)一次進樣，便可以對多種已知和未知化合物進行全面篩查分析。

3)中藥指紋圖譜譜效關(guān)系有待進一步深入研究

目前，常用的相似度等評價方法所評價的化學成分并非完全是活性成分或與藥效相關(guān)的成分，僅能鑒定中藥材的真實性，而不能對中藥材的有效性進行評價[38]。將化學指紋圖譜所體現(xiàn)的化學成分與藥效信息建立相關(guān)性的譜效關(guān)系研究，是傳統(tǒng)化學指紋圖譜的有效補充，目前這方面研究略顯欠缺。未來期望有更多的研究者利用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)開展這方面的研究工作，以期更好的推動中藥譜效關(guān)系研究。

總之，相信隨著UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)應用的深入和現(xiàn)代分析技術(shù)的更新發(fā)展，未來必然會出現(xiàn)更多元、更多級的串聯(lián)質(zhì)譜法。該類技術(shù)也會朝著更高效、更準確、更智能化方向發(fā)展，該類技術(shù)在中藥指紋圖譜研究和中藥質(zhì)量評價中也將發(fā)揮越來越重要的作用。