李 蓉，龍小妹，陳 平，范 源，3△，朱培芳

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500； 2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院轉(zhuǎn)化藥理與臨床應(yīng)用研究所，四川 成都 610041； 3.云南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650216）

余甘子Phyllanthus emblicaL.為大戟科葉下珠屬植物，常以干燥成熟果實(shí)入藥。以“菴摩勒”為藥用之名，始載于《南方草木狀》；以“余甘子”為藥用之名，始載于《新修本草》［1］。余甘子藥材主要分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，是印度、中國(guó)、馬來(lái)西亞等國(guó)常用中藥材，已有700 余年的藥用歷史［2］，具有抗氧化、調(diào)血脂和降血糖活性［3］，且是許多保肝配方的重要成分，還可用作抗微生物劑、抗腫瘤劑或抗炎劑［4］，并可改善金屬誘導(dǎo)的致癌作用［5］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，中藥鮮品可保存藥材的大部分活性成分，故臨床應(yīng)用價(jià)值高，但其在貯藏過(guò)程中可發(fā)生褐變，導(dǎo)致中藥活性成分含量或結(jié)構(gòu)改變而影響藥效［6］。余甘子果實(shí)褐變會(huì)引起其感官變差及多酚和維生素C 等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量減少。多酚氧化酶（PPO）能將物質(zhì)氧化成醌類，從而引發(fā)褐變［7］。目前對(duì)余甘子果實(shí)貯藏保鮮技術(shù)的探討有限，僅對(duì)低溫貯藏、涂膜、高壓電場(chǎng)貯藏及添加酶抑制劑等措施有所研究［8］。新鮮余甘子果實(shí)中酚類化合物含量較高，沒(méi)食子酸為新鮮余甘子果實(shí)褐變的底物，可作為其發(fā)生早期褐變的指標(biāo)之一［9］。某些黃酮類化合物可與某些酚、醌、氨基酸或蛋白質(zhì)直接聚合成褐色物質(zhì)導(dǎo)致褐變［10］。目前對(duì)新鮮中藥褐變機(jī)制的報(bào)道較少。為此，本研究中將新鮮余甘子果實(shí)置5 ℃恒溫冰箱中冷藏，測(cè)定其貯藏20 d 內(nèi)酚類成分含量、PPO 活性、pH、褐變指數(shù)等各項(xiàng)指標(biāo)的變化情況，為新鮮果實(shí)類中藥的貯藏和養(yǎng)護(hù)提供一定參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；YL-040S 型語(yǔ)路超聲波清洗機(jī)（深圳市即潔超聲科技有限公司）；D2KW-D 型電熱恒溫水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；S013 - 2100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海量壹科學(xué)儀器有限公司）；T-1000型電子天平（上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司）；PHS-25 型pH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；Neofuge 15R 型離心機(jī)（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；SPARK 10M 型酶標(biāo)儀（澳大利亞Tecan公司）。

1.2 試藥

1-沒(méi)食子?；咸烟牵?-GG）對(duì)照品（上海葉源生物科技有限公司，批號(hào)為K28J12B136898）；沒(méi)食子酸（GA）對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)為wkq16081904）；1，3，6-O-三沒(méi)食子?；咸烟牵═GG）對(duì)照品（武漢天植生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為CFS201802）；鞣花酸（EA）對(duì)照品（大連美侖生物科技有限公司，批號(hào)為M0104AS）；蘆丁對(duì)照品（上海葉源生物科技有限公司，批號(hào)為Y24F11Y17051），含量均不小于98%；PPO 活性檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)為20210407）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。余甘子果實(shí)（云南省臨滄市云縣新鮮采摘）。

2 方法與結(jié)果

2.1 水解單寧類成分含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min 時(shí)5%B，5～6 min 時(shí)5%B→15%B，6～15 min 時(shí)15%B，15～25 min 時(shí)15%B→30%B；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 溶液制備

分別取1 - GG，GA，TGG，EA 對(duì)照品2.31，2.07，0.68，2.00 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得混合對(duì)照品溶液。取樣品（去核）5 g，精密稱定，加適量石英砂研磨，盡量搗碎，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱至70 ℃回流1.5 h，稱定質(zhì)量，加50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量；45 ℃超聲（功率240 W，頻率40 kHz，下同）1 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，加50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀70 ℃下蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。以甲醇（分析純）為陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果理論板數(shù)按1-GG 峰計(jì)應(yīng)不低于3 000；分離度均大于1.5，基線分離良好。見圖1。

1.1-GG 2.GA 3.TGG 4.EAA.混合對(duì)照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對(duì)照品溶液圖1 高效液相色譜圖1.1-GG 2.GA 3.TGG 4.EAA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得1-GG，GA，TGG，EA的回歸方程分別為Y1= 2 282.2X1+ 3 791.1（R2=0.999 1），Y2= 1 636.1X2+ 17.098（R2= 0.999 2），Y3=3 459.6X3+ 52.813（R2= 0.999 3），Y4= 1 951.3X4+16.8（R2=1.000 0）。結(jié)果表明，1-GG，GA，TGG，EA進(jìn)樣量分別在0.46～2.77 μg、0.41～2.48 μg、0.14～0.82 μg、0.40～2.40 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié) 果1 - GG，GA，TGG，EA 峰 面 積 的RSD分 別 為0.64%，0.22%，0.20%，0.25%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，10 h 時(shí)按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果1 - GG，GA，TGG，EA峰面積的RSD分別為3.02%，3.17%，3.60%，1.81%（n= 6），表明供試品溶液在室溫放置10 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一批樣品適量，共6份，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果1 - GG，GA，TGG，EA 含 量 的RSD分 別 為0.36%，0.53%，2.49%，0.67%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.4 樣品中水解單寧類成分含量變化

1 - GG，GA，TGG，EA 分別在樣品貯藏第15 天、第15 天、第19 天、第20 天時(shí)含量最高，在貯藏第4 天、第19 天、第18 天、第18 天時(shí)含量最低。結(jié)果顯示，1 - GG及EA 在第2 天時(shí)含量增加，到第4 天含量減少，后呈曲線大幅波動(dòng)；GA及TGG在前4天內(nèi)含量減少，后呈曲線小幅波動(dòng)。詳見圖2。即5 ℃條件下，樣品中水解單寧類成分隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，含量總體僅小幅變化。

2.2 黃酮類成分含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～2 min 時(shí)，22%B，2～20 min 時(shí)22%B→60%B）；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取蘆丁對(duì)照品0.80 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得蘆丁對(duì)照品溶液。取樣品（去核）5 g，精密稱定，加適量石英砂研磨，盡量搗碎，置具塞錐形瓶中。精密加入75%甲醇50 mL，45 ℃超聲1 h，放冷，稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，濃縮，加甲醇定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

A.1 - GG B.GA C.TGG D.EA圖2 水解單寧類成分的含量變化A.1-GG B.GA C.TGG D.EAFig.2 Content change of hydrolyzed tannins

5.蘆丁A.對(duì)照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對(duì)照品溶液圖3 蘆丁的高效液相色譜圖5.RutinA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms

2.2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及2.1.2 項(xiàng)下陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，理論板數(shù)按蘆丁峰計(jì)應(yīng)不低于3 000；分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖3。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2.2 項(xiàng)下蘆丁對(duì)照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以蘆丁進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得蘆丁的回歸方程為Y= 1 448X- 0.72（R2= 0.999 6）。結(jié)果表明，蘆丁進(jìn)樣量在0.16～0.94 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2.2 項(xiàng)下蘆丁對(duì)照品溶液適量，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果蘆丁峰面積的RSD為0.28%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，10 h 時(shí)按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果蘆丁峰面積的RSD為3.92 %（n= 6），表明供試品溶液在室溫放置10 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取同一批樣品適量，精密稱定，共6 份，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果蘆丁含量的RSD為0.24%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4 樣品中蘆丁含量變化

樣品中蘆丁含量在第10 天達(dá)到最高，第4 天含量最低，前4天內(nèi)蘆丁含量逐漸下降，后呈曲線波動(dòng)，整體波動(dòng)幅度較小。結(jié)果表明，黃酮類成分（蘆?。┰? ℃條件下貯藏，含量變化在一定范圍內(nèi)。詳見圖4。

圖4 黃酮類成分（蘆?。┖孔兓疐ig.4 Content change of flavones（rutin）

2.3 PPO 活性測(cè)定

取樣品（去核）0.1 g，精密稱定，置2 mL EP管中，加1 mL 提取液，冰浴搗碎，4 ℃下、8 000g離心10 min，取上清液250 μL，于常溫水浴10 min，后迅速放入沸水水浴10 min，放冷，4 ℃下、5 000g離心10 min。加入試劑一600 μL，試劑二150 μL，提取液150 μL?；靹?，設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL，磷酸鹽緩沖液（PBS）封邊，置96 孔板。于410 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（A），并計(jì)算PPO的活性，以反應(yīng)液作對(duì)照，1 d測(cè)定1次。PPO活性計(jì)算公式，PPO=（A測(cè)定-A對(duì)照）×60/0.1。結(jié)果顯示，PPO活性在第14 天時(shí)最高，第1 天時(shí)最低，整體呈曲線波動(dòng)。詳見圖5 A。

2.4 褐變指數(shù)測(cè)定

將樣品果心的中心部位橫切，按橫切面上果肉組織相應(yīng)的褐變程度和面積來(lái)劃分等級(jí)［11］。無(wú)褐變?yōu)?級(jí)，果肉褐變面積≤25%為1 級(jí)，> 25%～50%為3 級(jí)，> 50%～< 75%為3 級(jí)，≥75%為4 級(jí)，每次統(tǒng)計(jì)10 個(gè)果實(shí)。每次統(tǒng)計(jì)10 個(gè)樣品。余甘子褐變指數(shù)計(jì)算公式，褐變指數(shù)= ∑（褐變級(jí)別× 級(jí)別果實(shí)數(shù)）/ 最高級(jí)別數(shù)×統(tǒng)計(jì)果實(shí)數(shù)（注：褐變指數(shù)為1時(shí)，可表示為完全褐變）。余甘子的褐變指數(shù)在第9 天和第10 天時(shí)達(dá)到最高，在第1天時(shí)最低，其變化呈曲線波動(dòng)。但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，褐變指數(shù)呈升高趨勢(shì)，表明5 ℃貯藏條件下，樣品出現(xiàn)了輕微褐變。詳見圖5 B。

A.PPO活性 B.褐變指數(shù) C.pH圖5 PPO活性、褐變指數(shù)及pH變化A.PPO activity B.Browning index C.pHFig.5 Changes of PPO activity，browning indexes and pH

2.5 pH 測(cè)定

取樣品（去核）10 g，精密稱定，加適量石英砂研勻，置三角瓶中，加20 mL 水，80 ℃下水浴30 min，冷卻濾過(guò)，取續(xù)濾液，用pH計(jì)測(cè)定pH。pH在第10天時(shí)達(dá)最大，總體呈先上升后下降的波動(dòng)趨勢(shì)。詳見圖5 C。

3 討論

通常認(rèn)為，影響中藥鮮品褐變的外界因素包括溫度、濕度、貯藏時(shí)間等，中藥自身的物質(zhì)也會(huì)影響褐變的發(fā)生。余甘子果實(shí)所含化學(xué)成分較豐富，藥理活性較多，故對(duì)其褐變進(jìn)行有效抑制尤為重要。有研究表明，新鮮余甘子果實(shí)褐變多與酚類物質(zhì)有關(guān)，水解單寧能在酸性、堿性條件下水解產(chǎn)生沒(méi)食子酸、PGG 等中間產(chǎn)物［12-13］。沒(méi)食子酸作為褐變的底物，可與PPO 反應(yīng)氧化為醌和水，醌再經(jīng)酶促或非酶促氧化聚合，形成褐色物質(zhì)，而產(chǎn)生褐變［14］。新鮮余甘子果實(shí)中含有的黃酮類化合物綠原酸、蘆丁在酶的催化下形成醌類物質(zhì)，最終也形成不溶性的褐色多酚—— 黑色素，使其發(fā)生褐變［15］。新鮮余甘子果實(shí)的貯藏及運(yùn)輸，極易影響其藥效及質(zhì)量，但誘發(fā)其褐變的因素及機(jī)制尚未明確。

此外，新鮮余甘子果實(shí)在5 ℃下貯藏20 d 過(guò)程中，樣品存在一定的個(gè)體差異，所測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)的貯藏過(guò)程中與褐變相關(guān)的各指標(biāo)的變化趨勢(shì)較平穩(wěn)。

本研究結(jié)果表明，新鮮余甘子果實(shí)在5 ℃下貯藏20 d 的過(guò)程中，酚類化合物的含量、PPO 活性和褐變指數(shù)呈曲線波動(dòng)，其有效成分含量未出現(xiàn)明顯變化，pH呈先升后降的波動(dòng)趨勢(shì)，表明5 ℃可作為新鮮余甘子果實(shí)的最佳貯藏條件。