蘭 嵐，唐佳璇，石秋梅，薛凱陽(yáng)，崔 瑾

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，貴州 貴陽(yáng) 550002）

燒傷燙傷是由物理、化學(xué)、輻射等熱力因素引起的組織損傷［1］。吳氏侗藥燒傷油有解熱鎮(zhèn)痛、散毒消腫、去腐生肌之功效，適用于淺Ⅰ度～深Ⅱ度燒燙傷等的治療。依據(jù)原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品評(píng)審中心《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（［Z］GPT2-1）、《中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的指導(dǎo)原則》（［Z］GPT4-1）及《中藥、天然藥物免疫毒性（過(guò)敏性、光變態(tài)反應(yīng)）研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》（［Z］GPT5-1），現(xiàn)對(duì)吳氏侗藥燒傷油進(jìn)行皮膚急性毒性、皮膚刺激性、皮膚過(guò)敏性研究，評(píng)價(jià)其安全性與有效性，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：EL104型電子天平（梅特勒-托利多儀器<上海>有限公司）；BCD - 642WEGX5S 型冰箱（康佳集團(tuán)股份有限公司）；HH - 2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）；X5 - S 型電子秤（凱豐電子秤有限公司）；X1型剃毛剪（邁牙堂公司）。

試藥：吳氏侗藥燒傷油（吳氏侗醫(yī)家族傳承自制）；2，4 - 二硝基氯苯（西亞化學(xué)科技<山東>有限公司，批號(hào)20210420）；乙醇（重慶川東化工集團(tuán)有限公司，批號(hào)20200001）；生理鹽水（貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)D21040704）；水為娃哈哈純凈水。

動(dòng)物：健康SPF級(jí)SD大鼠50只，體質(zhì)量200～300g，雌雄各半；健康普通級(jí)Hartely 白色豚鼠30 只，體質(zhì)量250～350g，雌雄各半，均購(gòu)自長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)分別為SCXK（湘）2019-0014，SCXK（湘）2019-0015。實(shí)驗(yàn)期間雌雄分籠飼養(yǎng)、每籠5只，環(huán)境溫度（23 ± 2）℃，相對(duì)濕度50%～65%，人工晝夜交替（12 h/12 h），所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均自由飲水、攝食，保持良好通風(fēng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)學(xué)校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》要求。

1.2 方法

1.2.1 皮膚急性毒性實(shí)驗(yàn)

分組與給藥：取30 只SD 大鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組（A組，等量生理鹽水）、皮膚完整組（B組，吳氏侗藥燒傷油2 mL）、皮膚破損組（C 組，吳氏侗藥燒傷油2 mL），各10 只。于給藥前24 h 用剃毛剪剃去大鼠脊柱背部?jī)蓚?cè)毛發(fā)，再用脫毛膏脫毛（面積約5 cm×6 cm），檢查皮膚有無(wú)紅斑、水腫及破損情況（下同）。將已脫毛區(qū)域皮膚用消毒針頭作“#”形劃破，長(zhǎng)寬各約2 cm，間隔0.5 cm，深度為1～2 mm，以皮膚出現(xiàn)輕度滲血為度。各組大鼠分別涂抹相應(yīng)藥物或生理鹽水，每天3 次，連續(xù)7 d，涂藥后用無(wú)刺激性紗布和膠帶分層固定。

觀察指標(biāo)：給藥期間每日觀察大鼠給藥區(qū)域及全身皮膚狀態(tài)、飲食、糞便、毛發(fā)光澤、眼和黏膜、呼吸、活動(dòng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；分別于給藥24 h、48 h、7 d 記錄大鼠的體質(zhì)量。末次給藥后，解剖并觀察大鼠的主要臟器（心、肝、脾、肺、腎），實(shí)驗(yàn)期間若發(fā)現(xiàn)動(dòng)物死亡，需對(duì)其進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.2.2 皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)

分組及給藥：取20 只SD 大鼠，隨機(jī)分為皮膚完整組（D 組）及皮膚破損組（E 組）大鼠，各10 只。兩組采取同體左右側(cè)自身對(duì)比法，取紗布3 cm ×3 cm（4 層），浸吳氏侗藥燒傷油2 mL，貼于左側(cè)已脫毛區(qū)域皮膚上，用塑料薄膜覆蓋，再用無(wú)刺激性膠布和繃帶固定；右側(cè)皮膚同法貼敷紗布（2 mL 水浸潤(rùn)）作為對(duì)照。貼敷6 h 后，除去藥物及水后用溫水清潔給藥部位，破損皮膚采用無(wú)菌操作。相同部位給藥每天3 次，連續(xù)7 d，于每日首次貼敷去除藥物后24 h 進(jìn)行日間給藥，于每次去除藥物后1 h進(jìn)行日內(nèi)給藥。

觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：肉眼觀察并記錄貼敷部位是否有紅斑、水腫、色素沉著、出血點(diǎn)、皮膚粗糙或皮膚菲薄等情況，及其發(fā)生時(shí)間和消退時(shí)間。對(duì)紅斑及水腫刺激反應(yīng)癥狀進(jìn)行評(píng)分，無(wú)紅斑、輕度紅斑、中度紅斑、重度紅斑和水腫性紅斑分別計(jì)0，1，2，3，4 分；無(wú)水腫、輕度水腫、中度水腫、重度水腫、嚴(yán)重水腫分別計(jì)0，1，2，3，4 分。根據(jù)評(píng)分結(jié)果，計(jì)算觀察期間每日每只大鼠刺激積分。刺激評(píng)分<0.05分為無(wú)刺激性，0.05～2.99分為輕度刺激性，3.00～5.99 分為中度刺激性，6.00～8.00 分為強(qiáng)度刺激性。如存在持久性損傷（損傷持續(xù)72 h以上），則延長(zhǎng)觀察期，以評(píng)價(jià)上述癥狀的恢復(fù)情況和時(shí)間（不超過(guò)14 d）。對(duì)于出現(xiàn)中度及其以上皮膚刺激性的大鼠，在觀察期結(jié)束時(shí)對(duì)給藥局部進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.2.3 皮膚過(guò)敏性實(shí)驗(yàn)

分組及給藥：將30只豚鼠隨機(jī)分為吳氏侗藥燒傷油組（F 組，吳氏侗藥燒傷油0.2 mL）、陰性對(duì)照組（G 組，等量生理鹽水）、陽(yáng)性對(duì)照組（H 組，2，4 - 二硝基氯苯0.2 mL，致敏濃度1%，激發(fā)濃度0.1%），各10 只，雌雄各半。于致敏及激發(fā)前24 h 分別于豚鼠左右側(cè)背部脫毛（面積約3 cm × 3 cm）。致敏給藥分別于第0，7，14 天在豚鼠背部左側(cè)脫毛區(qū)域皮膚涂抹相應(yīng)藥物，涂藥后依次經(jīng)濾紙、紗布、牛皮紙、無(wú)刺激膠布覆蓋，再用繃帶固定身體，給藥6 h 后去除覆蓋物，用溫水洗去藥物；第14～28 天僅保證其飲食用水自由，墊料清潔即可；于第28天于豚鼠右側(cè)背部脫毛區(qū)域皮膚進(jìn)行激發(fā)給藥。

觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：末次給藥后，分別于6，24，48，72 h后觀察豚鼠皮膚紅斑、水腫癥狀并評(píng)分，刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)同1.2.2項(xiàng)下相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算各組豚鼠的致敏率，并判斷豚鼠的致敏強(qiáng)度。皮膚過(guò)敏反應(yīng)平均值=（紅斑積分+水腫積分）/動(dòng)物只數(shù)。致敏率=該組發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)的豚鼠數(shù)/ 該組豚鼠總數(shù)× 100%，藥物致敏強(qiáng)度分為弱致敏（0～8%）、輕度致敏（9%～28%）、中度致敏（29%～64%）、強(qiáng)致敏（65%～80%）、極強(qiáng)致敏（81%～100%）；每日籠邊觀察豚鼠是否有不安、抓鼻、噴嚏、呼吸困難、站立不穩(wěn)、大小便失禁、痙攣性跳躍、休克等嚴(yán)重全身性過(guò)敏反應(yīng)出現(xiàn)，如難以判定，1 周后再次進(jìn)行激發(fā)給藥。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以±s表示，行單因素方差分析。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠皮膚急性毒性實(shí)驗(yàn)

觀察期間，A 組、B 組和C 組大鼠皮膚、毛發(fā)、飲食、分泌物、排泄物、呼吸、眼和黏膜、精神狀態(tài)、四肢活動(dòng)均正常，無(wú)中毒及死亡現(xiàn)象，其中C 組大鼠涂藥后第5 日均已完全脫痂愈合。給藥24 h、48 h、7 d 時(shí)，與A 組比較，B組和C組大鼠體質(zhì)量均顯著改變（P>0.05）。詳見(jiàn)圖1及表1。

表1 3組大鼠體質(zhì)量比較結(jié)果（±s，n=10）Tab.1 Comparison of rats′ body mass in the three groups（X±s，n=10）

表1 3組大鼠體質(zhì)量比較結(jié)果（±s，n=10）Tab.1 Comparison of rats′ body mass in the three groups（X±s，n=10）

組別A組B組C組F值P給藥前347.10±13.54 247.90±15.32 254.50±11.51 0.899>0.05給藥后24 h 249.90±11.53 250.80±15.65 257.60±11.38 1.047>0.05給藥后48 h 251.30±12.62 254.10±16.69 260.50±11.11 1.189>0.05給藥后7 d 320.90±27.00 317.40±18.98 308.00±17.42 0.959>0.05

圖1 3組大鼠給藥前后皮膚外觀變化Fig.1 Changes of rats′ skin appearance in the three groups before and after administration

2.2 大鼠皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)

觀察各組大鼠皮膚及外觀，均未見(jiàn)涂抹部位或全身出現(xiàn)紅斑、水腫、色素沉著、出血點(diǎn)、皮膚粗糙或皮膚菲薄等癥狀。即D組、E組大鼠左側(cè)背部刺激評(píng)分均為0分。詳見(jiàn)圖2。

圖2 2組大鼠給藥前后皮膚外觀變化Fig.2 Changes of rats′ skin appearance in the two groups before and after administration

2.3 豚鼠皮膚過(guò)敏性實(shí)驗(yàn)

F 組及G 組豚鼠給藥處皮膚均未見(jiàn)紅斑和水腫形成，皮膚過(guò)敏反應(yīng)平均值均為0分，致敏強(qiáng)度為弱致敏；H組在去除藥物72 h內(nèi)出現(xiàn)不同程度的紅斑和水腫，激發(fā)6，24 h后過(guò)敏反應(yīng)評(píng)分表明10只豚鼠出現(xiàn)不同程度的過(guò)敏反應(yīng)，48，72 h 后皮膚過(guò)敏反應(yīng)評(píng)分表明個(gè)別豚鼠過(guò)敏反應(yīng)減弱，其6，24，48 h 過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)度為極強(qiáng)致敏、72 h 后過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)度為中度致敏。3 組豚鼠各時(shí)間段均未見(jiàn)全身過(guò)敏反應(yīng)。激發(fā)后6，24，48，72 h G 組與F 組比較，致敏率均無(wú)顯著差異（P> 0.05）。詳見(jiàn)表2及圖3。

表2 3組豚鼠激發(fā)給藥后皮膚過(guò)敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of the incidence of allergic reaction of guinea pigs′ skin in the three groups after irritation administration（X±s，n=10）

表2 3組豚鼠激發(fā)給藥后皮膚過(guò)敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of the incidence of allergic reaction of guinea pigs′ skin in the three groups after irritation administration（X±s，n=10）

組別H組F組G組激發(fā)后反應(yīng)平均值（分）6 h 4.20±1.13 0 0 24 h 2.10±1.10 0 0 48 h 0.90±0.74 0 0 72 h 0.5±0.53極強(qiáng)、中度0 0致敏強(qiáng)度弱 弱

a.致敏給藥后0 d b.致敏給藥后7 d c.致敏給藥后14 d d.致敏后 e.激發(fā)給藥圖3 3組豚鼠給藥前后皮膚變化a.0 d after sensitization administration b.7 d after sensitization administration c.14 d after sensitization administration d.After sensitizatione.Irritation administrationFig.3 Changes of guinea pigs′ skin in the three groups before and after administration

3 討論

吳氏侗藥燒傷油是由貴州省黎平縣侗族吳氏第5代傳承人傳承而來(lái)，用于治療燒燙傷的外用制劑，屬暴露干燥療法。吳氏侗藥燒傷油主要由茶樹(shù)籽、地榆、虎杖、紫草4味藥材組成，該制劑以茶籽的茶樹(shù)籽油為溶劑調(diào)配而成，其中地榆、虎杖、紫草藥材均為臨床治療燒燙傷常用中藥，對(duì)燒燙傷具有獨(dú)特療效。

吳氏侗藥燒傷油組方中，茶樹(shù)籽中的茶樹(shù)籽油具有較好的親和性［2］，可將藥物長(zhǎng)時(shí)間固定于皮膚受傷部位。茶樹(shù)籽油中的維生素E具有抗氧化作用［3］，茶堿、茶多酚等活性成分能抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能、消除自由基、促進(jìn)新陳代謝，茶皂素具有鎮(zhèn)痛和抗炎等功效且能抑制白色念珠菌、大腸桿菌的滋生等，角鯊烯可提高免疫力、抗菌、抗紫外線［4］；地榆鞣質(zhì)可在體外發(fā)揮抗菌［5］、抗炎、抗氧化作用［6］，作為鞣質(zhì)保護(hù)黏膜劑止血效果明顯［7］，還具有增強(qiáng)免疫［8］、抗腫瘤［9］等藥理作用，同時(shí)地榆中含有豐富的鉀和鈣，能涼血止血、解毒斂瘡［10］；虎杖中含有蒽醌類、二苯乙烯類、黃酮類、香豆素類及脂肪酸類化合物，具有抗病毒、抗菌、調(diào)節(jié)免疫［11］、抗炎、促進(jìn)創(chuàng)面愈合［12］等作用；紫草中的紫草素、乙酰紫草素具有抗病毒、促進(jìn)傷口愈合、增強(qiáng)免疫、抗炎［13］、抑菌［14］、抗腫瘤［15］等作用。

吳氏侗藥燒傷油具有使用操作簡(jiǎn)單、適用范圍廣、對(duì)醫(yī)療環(huán)境無(wú)特殊要求等優(yōu)勢(shì)。但目前多在民間使用，推廣前必須對(duì)其進(jìn)行安全性及有效性評(píng)價(jià)。本研究中通過(guò)建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行安全性初步探討，皮膚急性毒性、皮膚刺激性及皮膚過(guò)敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吳氏侗藥燒傷油外用于皮膚完整組大鼠和皮膚破損組大鼠均未見(jiàn)明顯的皮膚急性毒性和刺激性反應(yīng)，對(duì)豚鼠完整皮膚無(wú)致敏反應(yīng)，表明其對(duì)皮膚無(wú)毒性、刺激性、致敏性。