余志杰，陳 興，左建麗，何 瑤，鄭姣妮，鄭曉媛

（重慶市第四人民醫(yī)院·重慶市急救醫(yī)療中心藥劑科，重慶 400014）

肺動(dòng)脈高壓（PAH）是由于肺血管狹窄或阻力增加引起的肺動(dòng)脈壓力異常增高的慢性疾病，具有肺血管重構(gòu)和肺血管阻力增加的顯著病理特征，后期可發(fā)展為右心衰竭甚至死亡［1］。PAH 的發(fā)病機(jī)制涉及多種因素，主要包括遺傳變異、血管細(xì)胞的異常增殖、代謝障礙、炎性及免疫反應(yīng)［2-4］。與預(yù)后不良程度相關(guān)的因素包括性別、年齡、PAH 分級(jí)、右心室功能障礙相關(guān)指標(biāo)、結(jié)締組織病等。約50%患者死于右心衰竭引起的循環(huán)衰竭。PAH 特異性治療藥物包括前列環(huán)素通路激動(dòng)劑、內(nèi)皮素受體拮抗劑、一氧化氮- 環(huán)磷酸鳥苷增強(qiáng)劑及鈣通道阻滯劑（少用）［5-6］，但這些藥物的運(yùn)用均缺乏大型、多中心臨床試驗(yàn)支持?；⒄葹檗た浦参锘⒄萈olygo?num cuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根和莖，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰功效，主要用于濕熱黃疸、風(fēng)濕痹痛、肺熱咳嗽等的治療［7］?；⒄人幉木哂袕V泛的生物活性，包括抗炎、抗病毒、調(diào)血脂、抗腫瘤、抗氧化、擴(kuò)血管等［8］。研究證實(shí)虎杖的活性成分白藜蘆醇和虎杖苷對(duì)PAH 模型大鼠均具有保護(hù)作用。白藜蘆醇主要通過MAPK/ERK1 及PI3K/AKT 信號(hào)通路發(fā)揮抗炎抗血管異常增生作用，而虎杖苷對(duì)PAH 的作用機(jī)制研究較缺乏［9-10］。前期研究發(fā)現(xiàn)，虎杖提取物及其活性成分虎杖苷可改善高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化及抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖［11］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于中藥多成分- 多靶點(diǎn)- 多途徑思維，研究中藥或復(fù)方治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)及潛在作用靶點(diǎn)和機(jī)制，對(duì)闡明中醫(yī)藥理論“整體觀”的思想提供了重要借鑒［12-13］。本研究中基于該方法探討了虎杖藥材治療PAH 的潛在活性成分及作用機(jī)制，利用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證虎杖藥材中活性成分與作用靶點(diǎn)的結(jié)合性能，從而為開展虎杖藥材治療PAH 具體作用機(jī)制的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 潛在治療靶點(diǎn)獲得

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（TCMSP），以“虎杖”為關(guān)鍵詞搜索其活性成分，將口服生物利用度（OB）及類藥性（DL）作為篩選參數(shù)，設(shè)OB > 30%，DL>0.18，篩選并構(gòu)建活性成分庫，并檢索PubMed數(shù)據(jù)庫收集已證實(shí)的虎杖相關(guān)活性成分，共同納入該庫。再利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取虎杖活性成分的潛在靶點(diǎn)，并通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫將靶點(diǎn)蛋白名稱標(biāo)準(zhǔn)化，選擇物種“Homo sapiens”（下同），轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的基因名稱，即得虎杖活性成分化合物庫的潛在作用靶點(diǎn)基因。

利用人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards）、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）以Relevance score ≥5.0為篩選條件。篩選PAH 相關(guān)致病靶點(diǎn)，搜索英文關(guān)鍵詞“Pulmonary hypertension”“Pulmonary arterial hypertension”，得到與PAH相關(guān)的靶點(diǎn)。

取GeneCards，OMIM 及虎杖活性化合物靶點(diǎn)的交集，獲得虎杖活性化合物治療PAH的潛在靶點(diǎn)。

1.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將1.1 項(xiàng)結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建藥物（虎杖）- 活性成分- 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖；節(jié)點(diǎn)（Node）代表中藥、潛在活性成分及靶點(diǎn)，邊（Edge）代表節(jié)點(diǎn)間的相互聯(lián)系，節(jié)點(diǎn)度（Degree）值越大，節(jié)點(diǎn)越重要；通過String 數(shù)據(jù)庫獲取靶點(diǎn)的蛋白-蛋白相互作用（PPI）關(guān)系，再通過Cytoscape 3.7.1 軟件的Network analysis功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，并通過靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)度值構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.3 目標(biāo)基因富集分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫分析挖掘虎杖活性成分潛在作用靶點(diǎn)的生物注釋功能信息，進(jìn)行基因本體論（GO）富集分析，包括生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）3個(gè)部分。將虎杖活性成分對(duì)PAH的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Functional annotation中，在結(jié)果中選擇并導(dǎo)出GO富集分析中的BP，CC，MF，設(shè)定錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.05且P<0.01，篩選虎杖活性成分作用靶點(diǎn)顯著富集的主要功能注釋及體內(nèi)通路，將排名靠前的富集結(jié)果可視化繪制為條形圖；利用Metascape 數(shù)據(jù)庫中的基因富集分析工具，將虎杖活性成分作用靶點(diǎn)的Uniprot ID導(dǎo)入其中，進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，獲取虎杖治療PAH的作用通路，以FDR<0.05且P<0.01為篩選條件，并可視化排名前20的信號(hào)通路。

1.4 分子對(duì)接

利用PubChem 數(shù)據(jù)庫下載節(jié)點(diǎn)度值排名靠前的活性成分槲皮素、白藜蘆醇、囊毒堿、木犀草素、大黃素、芹黃素、虎杖苷的3D 結(jié)構(gòu)，利用RCSB PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫下 載 核心靶點(diǎn)AKT1，VEGFA，TNF，MAPK3，TP53，EGFR（蛋白質(zhì)ID 分別為6HHG，1BJ1，1A8M，2ZOQ，4KVP，4KRM）的3D 結(jié)構(gòu)。利用AutoDock Tools 1.5.6 軟件進(jìn)行分子對(duì)接獲取最佳結(jié)合能，結(jié)果用PyMOL 軟件進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 潛在治療靶點(diǎn)

共得虎杖活性成分39 種，詳見表1。并據(jù)此得到對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)，去重后通過標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，得虎杖有效成分的靶基因共323個(gè)。

表1 虎杖活性成分Tab.1 The active components of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

經(jīng)GeneCards 數(shù)據(jù)庫篩選得2 874 個(gè)靶基因，經(jīng)OMIM數(shù)據(jù)庫篩選得5 343個(gè)靶基因。

將上述靶基因與虎杖活性化合物靶點(diǎn)取交集，得虎杖活性化合物治療PAH 的潛在靶點(diǎn)138 個(gè)。詳見圖1。

圖1 潛在靶點(diǎn)Fig.1 Potential targets

2.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.2.1 藥物-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

共得178 個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中1 個(gè)中藥節(jié)點(diǎn)，39 個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)，138 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，共2 356 條邊。靶基因中節(jié)點(diǎn)度值排名靠前的為AKT1，PTGS2，TNF，VEGFA，TP53，MAPK8，EGF，CASP3，MAPK3，EGFR 等，而活性成分槲皮素、白藜蘆醇與靶基因的連接數(shù)均超過68，可能為虎杖改善PAH 的主要核心成分。此外，虎杖的不同活性成分可作用于同一靶點(diǎn)，而同一活性成分又可作用于不同靶點(diǎn)，體現(xiàn)出虎杖治療PAH 多成分- 多靶點(diǎn)的協(xié)同作用特點(diǎn)。詳見圖2。

圖2 藥物-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig.2 PPI network of traditional Chinese medicines-active components-disease targets

2.2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)

138 個(gè)靶蛋白間的PPI 網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點(diǎn)顏色越紅表示節(jié)點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)度值越高，靶點(diǎn)重要性越大，見圖3。節(jié)點(diǎn)度值> 60 且 排 名 前23 的 靶 點(diǎn) 為AKT1，VEGFA，TNF，MAPK3，TP53，EGFR，MAPK8，CASP3，PTGS2，MAPK1，STAT3，MYC，MMP9，EGF，IL-1β，CCL2，IL-10，MMP2，ESR1，F(xiàn)GF2，PPARG，PTEN，ERBB2。詳見表2。

表2 節(jié)點(diǎn)度值排名前23的核心靶點(diǎn)Tab.2 The top 23 key targets with degree value

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network

2.3 GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析

共富集到16 條BP，15 項(xiàng)CC，15 項(xiàng)MF，見圖4。其中BP 主要富集在基因表達(dá)的正調(diào)控、RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對(duì)脂多糖的反應(yīng)等；CC主要富集在細(xì)胞間隙、質(zhì)膜、胞外區(qū)、線粒體等；MF 主要富集在細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、生長(zhǎng)因子活性等。

P值排名前20 的信號(hào)通路見圖5，靶點(diǎn)主要富集在PI3K/AKT 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、HIF - 1 信號(hào)通路、FOXO 信號(hào)通路及凋亡相關(guān)信號(hào)通路，上述通路分別涉及細(xì)胞的增殖生存調(diào)控、炎性反應(yīng)、細(xì)胞周期、凋亡及自噬等在低氧刺激下HIF-1信號(hào)通路的激活與PAH 的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。KEGG 信號(hào)通路見圖6。

圖5 KEGG通路富集分析結(jié)果Fig.5 The results of KEGG pathway enrichment analysis

圖6 KEGG信號(hào)通路圖Fig.6 KEGG signaling pathway

2.4 分子對(duì)接

虎杖活性成分（槲皮素、白藜蘆醇、囊毒堿、木犀草素、大黃素、芹黃素、虎杖苷）與核心靶點(diǎn)（AKT1，VEGFA，TNF，MAPK3，TP53，EGFR）的對(duì)接結(jié)果見表3。7個(gè)活性成分結(jié)合AKT1 所需的能量總體較低，因此推測(cè)虎杖的活性成分可能主要作用于AKT1。此外，大黃素、芹黃素與TNF 的結(jié)合能，白藜蘆醇、木犀草素與AKT1 的結(jié)合能均較低，表現(xiàn)出良好的親和力。其具體的分子對(duì)接模式見圖7（綠色：配體；黃色：氨基酸殘基；虛線：氫鍵）。

表3 活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果Tab.3 Results of molecular docking between active components and key targets

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，通過構(gòu)建藥物、基因、疾病相互間作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，從節(jié)點(diǎn)和靶點(diǎn)間的相互作用強(qiáng)度探究藥物潛在作用機(jī)制和藥物設(shè)計(jì)的一門新興學(xué)科［14］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)不僅揭示了中藥治療疾病的潛在活性成分和具體的作用靶點(diǎn)，而且可為闡明中醫(yī)藥治療疾病的多成分-多靶點(diǎn)-多途徑的作用特點(diǎn)提供重要的研究方法［15］。本研究結(jié)果表明，虎杖的關(guān)鍵活性成分（大黃素、芹黃素、白藜蘆醇、木犀草素）主要靶向AKT1、TNF 等靶點(diǎn)，調(diào)控PI3K/ AKT、TNF、MAPK 等信號(hào)通路，通過影響細(xì)胞增殖、凋亡、炎性反應(yīng)等生物過程，從而改善PAH。

通過“藥物- 活性成分- 靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖可知，AKT1，PTGS2，TNF，VEGFA，TP53，MAPK8，EGF，CASP3，MAPK3，EGFR 靶點(diǎn)與活性成分連接數(shù)較高，同時(shí)PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖也證實(shí)了AKT1，TNF，MAPK3，VEGFA，TP53，EGFR 為核心靶點(diǎn)，表明虎杖的活性成分可能主要靶向上述靶點(diǎn)發(fā)揮抗PAH 的作用。GO 功能富集分析結(jié)果顯示，其BP主要富集在基因表達(dá)的正調(diào)控、炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)血管生成、缺氧反應(yīng)、細(xì)胞增殖及凋亡過程。有研究已證實(shí)，AKT1 經(jīng)PI3K 的磷酸化而激活，主要參與PI3K/ AKT 信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與生存［16］。同時(shí)TNF，MAPK3 引起的炎性反應(yīng)在PAH 的發(fā)生機(jī)制中也被證實(shí)［17-18］。在血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)VEGFA 和EGFR 的異常表達(dá)與PAH 密切相關(guān)［19-20］。FENG 等［21］的研究結(jié)果顯示，TP53 可調(diào)控人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HPASMC）的細(xì)胞周期及凋亡從而抑制PAH。此外，KEGG 通路富集分析結(jié)果也顯示，虎杖主要通過PI3K/AKT 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、HIF - 1 信號(hào)通路、FOXO 信號(hào)通路及凋亡相關(guān)信號(hào)通路影響PAH，上述多條信號(hào)通路相互影響，如TNF 可激活下游的NF - κB、MAPK 信號(hào)通路，促進(jìn)炎性因子表達(dá)，從而導(dǎo)致炎性反應(yīng)。ZHU 等［22］的研究結(jié)果表明，在野百合堿誘導(dǎo)的PAH 模型大鼠中MAPK/NF-κB信號(hào)通路被明顯激活。同時(shí)，PI3K/AKT 信號(hào)通路不僅能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖導(dǎo)致肺血管重構(gòu)，而且也能調(diào)控下游NF - κB 信號(hào)通路介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。此外，TGF 作用于EGFR受體可誘導(dǎo)下游細(xì)胞增殖基因FOS，MYC，JUN的表達(dá)，從而上調(diào)VEGF 及MMPs 的表達(dá)引發(fā)血管的增生和重構(gòu)。研究證實(shí)，低氧可誘導(dǎo)HPASMC上調(diào)HIF-1α表達(dá)，激活HIF - 1 信號(hào)通路，導(dǎo)致EGF/VEGF 的異常表達(dá)［23］。同時(shí)，VEGF 也可作用于VEGFR2受體激活PI3K/ AKT 信號(hào)通路，抑制CASP9 和Bcl - 2 的表達(dá)從而誘導(dǎo)凋亡，并且EGF與其受體結(jié)合可激活FOXO信號(hào)通路從而影響細(xì)胞周期。

A.BP B.CC C.MF圖4 GO功能富集分析結(jié)果A.Biological process（BP） B.Cellular composition（CC） C.Molecular function（MF）Fig.4 The results of GO function enrichment analysis

A.大黃素+ TNF B.芹黃素+ TNF C.白藜蘆醇+ AKT1 D.木犀草素+ AKT1圖7 分子對(duì)接中結(jié)合能較低的結(jié)果A.Emodin+TNF B.Apigenin+TNF C.Resveratrol+AKT1 D.Luteolin+AKT1Fig.7 The results with lower binding energy in molecular docking

為進(jìn)一步證明虎杖活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合的親和力，通過分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證槲皮素、白藜蘆醇、囊毒堿、木犀草素、大黃素、芹黃素、虎杖苷與核心靶點(diǎn)AKT1，VEGFA，TNF，MAPK3，TP53，EGFR 的結(jié)合性能，結(jié)果表明，7 個(gè)活性成分均與6 個(gè)核心靶點(diǎn)表現(xiàn)出良好的結(jié)合能，結(jié)合能較低的為芹黃素與TNF（-6.96 kcal/mol），而且這些活性成分與AKT1 的親和力優(yōu)于其他靶點(diǎn)，證明虎杖的活性成分可能主要靶向AKT1，從而通過影響血管細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖引起血管重構(gòu)。本研究中選擇的虎杖活性成分的不同點(diǎn)在于，還從PubMed 數(shù)據(jù)庫中檢索已證實(shí)的虎杖活性成分（如虎杖苷），共同納入虎杖活性成分庫，從而避免遺漏。此外，有研究已證實(shí)在低氧誘導(dǎo)的PAH 模型大鼠中，虎杖苷可通過調(diào)節(jié)一氧化氮、內(nèi)皮素的含量改善PAH，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究［10］。因此，本課題組后期的體外實(shí)驗(yàn)會(huì)重點(diǎn)研究虎杖苷、槲皮素、白藜蘆醇、囊毒堿、木犀草素、大黃素、芹黃素對(duì)低氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的影響，及其對(duì)AKT1 和VEGFA 靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)作用，從而證實(shí)虎杖藥材治療PAH的具體活性物質(zhì)和作用機(jī)制。

綜上所述，本研究中通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)虎杖藥材防治PAH的潛在活性成分和核心靶點(diǎn)，為虎杖藥材的臨床應(yīng)用提供了一定參考。