逯陣毫，楊陽(yáng)，李冰，王玉堂

（鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南 鄭州 450000）

納米技術(shù)是目前最重要的現(xiàn)代科學(xué)研究之一［1］，納米粒子以其獨(dú)特的尺寸和理化性質(zhì)優(yōu)勢(shì)，使其在生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、環(huán)境工程等多個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［2］，各種納米粒子的合成和應(yīng)用收到廣泛關(guān)注。磁性納米顆粒是納米材料的一種，隨著納米生物技術(shù)的最新發(fā)展和需求，磁性納米顆粒在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力日益增大。磁性納米粒子通常分為純金屬、金屬氧化物和磁性納米復(fù)合材料，生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常用的磁性納米粒子有鈷（Co）、鐵（Fe）、鎳（Ni）、鈦（Ti）及其氧化物，其中氧化鐵磁性納米粒子（通常為Fe2O3或Fe3O4）因毒性較低而使用最多［3］，這些磁性納米微粒可以被磁場(chǎng)檢測(cè)和操縱，從而實(shí)現(xiàn)磁成像、磁分離、藥物和基因傳遞等功能。

在體外診斷領(lǐng)域，磁性納米微粒作為固相載體可以實(shí)現(xiàn)待測(cè)物質(zhì)的快速分離，其分散性對(duì)其性能有直接的影響。例如，在儲(chǔ)存過(guò)程中如果發(fā)生凝集，磁微粒重新懸浮時(shí)無(wú)法重新分散均勻，測(cè)試結(jié)果就會(huì)表現(xiàn)出重復(fù)性較差，甚至出現(xiàn)跳孔、漏檢等異?，F(xiàn)象；導(dǎo)致磁微粒凝集的因素很多，表面Zeta 電位的改變，偶聯(lián)蛋白的性質(zhì)，保存條件發(fā)生改變等等。在磁微粒試劑盒的開(kāi)發(fā)中，磁微粒的分散性是試劑盒性能的一項(xiàng)重要指標(biāo)［4］，試劑盒保存過(guò)程中，因?yàn)橹亓Φ淖饔么盼⒘３两翟谌萜鞯撞浚S時(shí)間的延長(zhǎng)，磁微粒發(fā)生凝集的概率明顯增加，因此磁微粒的分散性加速考核就顯得極其重要。目前，研究磁微粒分散性加速考核多采取磁加速手段，具體操作為在磁微粒容器底部外加一定強(qiáng)度的磁場(chǎng)，根據(jù)阿倫尼烏斯經(jīng)驗(yàn)方程，采取增加溫度的方式加速考核［5］。

本文重點(diǎn)研究不同溫度下的外加磁場(chǎng)對(duì)磁微粒分散性的影響，同時(shí)對(duì)磁微粒的粒徑、磁響應(yīng)、Zeta 電位進(jìn)行表征，試圖找到保存溫度與磁微粒分散性之間的關(guān)系，為磁微粒長(zhǎng)期的保存提供借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

表面羧基磁性納米微粒購(gòu)自德國(guó)Merk 公司；系列小鼠單克隆抗體mAb1-mAb5 購(gòu)自鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自Sigma 公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（純度分析純）購(gòu)自Sigma 公司；2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）購(gòu)自Sigma 公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）購(gòu)自Sigma 公司；N-羥基琥珀酰亞（NHS）購(gòu)自Sigma 公司。

1.2 設(shè)備

磁吸加速裝置，自制；垂直混勻器（寧波新芝生物科技有限公司，型號(hào)：HS-3）；光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯，型號(hào)：BX-43），顯微數(shù)字相機(jī)（廣州市明美光電技術(shù)有限公司，型號(hào)：MSX11）；激光粒度儀（馬爾文帕納科，型號(hào)：MX3000）；Zeta 電位儀（馬爾文帕納科，型號(hào)：ZEN3600）。隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：HH-B11·360-BS-II）；星星陳列柜（星星制冷設(shè)備有限公司，型號(hào)：LSC-518Y）；Sepmag A200 磁分離器。

1.3 磁微粒-蛋白偶聯(lián)

偶聯(lián)過(guò)程采用EDC+NHS 活化磁微粒表面的羧基基團(tuán)，具體步驟如下：抽取30 μL 磁微粒原液，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）洗滌2 次，加入20 mg/mL EDC MES 緩沖液和20 mg/mL NHS MES緩沖液各50 μL，震蕩反應(yīng)1 h，去上清后加入300 μL MES 緩沖液洗滌2 次，加入10 μL IgG 溶液，震蕩反應(yīng)2 h，去上清后加入300 μL 1%BSA磷酸鹽緩沖液封閉30 min，最后用1%BSA 磷酸鹽緩沖液定容至3 mL，2～8 ℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)制備沒(méi)有包被任何蛋白的磁微粒作為對(duì)照，共制備6 種不同包被蛋白的磁微?；鞈乙?，用于磁加速考核。

1.4 磁吸加速

將所有磁微?；鞈乙悍殖扇M，放入磁吸加速裝置上，分別放置于4℃、25℃、37℃，放置天數(shù)3 d、7 d、10 d，磁吸加速完成后，將每瓶磁微粒混懸液置于垂直混勻器上混勻30 min，目測(cè)磁微粒分散狀態(tài)，進(jìn)行磁微粒表征。

1.5 磁性納米微粒表征

1.5.1 分散性 抽取5 μL 磁微?；鞈乙褐破糜诠鈱W(xué)顯微鏡下觀測(cè)，拍照比較分散性，以磁微粒原液為對(duì)照。

1.5.2 粒徑 抽取2 mL 磁微粒混懸液作為樣本，利用激光粒度儀測(cè)定粒徑，每個(gè)樣本重復(fù)三次，求平均粒徑。

1.5.3 磁響應(yīng) 抽取2 mL 磁微粒混懸液加入玻璃管中，放入Sepmag A200 測(cè)定磁響應(yīng)時(shí)間。

1.5.4 Zeta 電位 抽取1 mL 磁微?；鞈乙?，用1 mL 洗滌3 次，最后定容到原來(lái)體積1 mL，利用Zeta 電位儀測(cè)定Zeta 電位。

2 結(jié)果

2.1 分散性

由圖1 可見(jiàn)，不同包被抗體的磁微?；鞈乙涸诓煌瑴囟葪l件下磁吸加速，重懸后磁微粒的分散性有明顯差異，37℃下磁吸加速，磁珠分散性最差，25℃次之，4℃分散性最好，同一批磁微粒原液，與是否包被抗體、抗體的種類無(wú)顯著關(guān)系。包被其他單抗的磁微粒顯示出相同的趨勢(shì)。

圖1 包被不同蛋白的磁微?；鞈乙捍盼铀俸蠓稚⑿裕ㄒ詍Ab1 為例）

由圖2 可見(jiàn)，包被同樣蛋白不同批次原液在不同溫度條件下磁吸加速，重懸后磁微粒的分散性有明顯差異，37℃下磁吸加速，磁珠分散性最差，25℃次之，4℃分散性最好，同一批磁微粒原液，與是否包被抗體、抗體的種類無(wú)顯著關(guān)系。其他批次磁微粒表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。

圖2 不同批次磁微?；鞈乙捍盼铀俸蠓稚⑿裕ㄒ訫8932 為例）

2.2 粒徑

數(shù)據(jù)表明，磁微粒包被抗體后，磁加速同樣的時(shí)間，溫度越高，磁微粒粒徑越大，表明磁微粒分散性越差，與光學(xué)顯微鏡觀察到的結(jié)果一致。包被不同的單抗粒徑變化趨勢(shì)一致，未包被任何單抗的裸磁珠也表現(xiàn)出同樣的趨勢(shì)，說(shuō)明磁微粒磁加速后分散程度與包被抗體的性質(zhì)無(wú)明顯關(guān)系。見(jiàn)表1。

表1 包被不同單抗的磁微粒在不同溫度下磁加速3 d、7 d、10 d 后的粒徑變化（以mAb1 為例）

數(shù)據(jù)表明，不同批次磁微粒包被抗體后，磁加速同樣的時(shí)間，溫度越高，磁微粒粒徑越大，表明磁微粒分散性越差，與光學(xué)顯微鏡觀察到的結(jié)果一致，不同批次的磁微粒粒徑變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明磁加速后的分散程度與磁微粒批次無(wú)明顯關(guān)系。見(jiàn)表2。

表2 不同批次磁微粒在不同溫度下磁加速3 d、7 d、10 d后的粒徑變化（以M8932 為例）

以上數(shù)據(jù)均表明，磁加速分散程度與包被抗體、磁微粒批次無(wú)明顯關(guān)系，與外加磁場(chǎng)時(shí)的溫度有明顯關(guān)系，溫度越高，磁加速后的分散性越差。

2.3 磁響應(yīng)

數(shù)據(jù)表明，磁微粒包被抗體后，磁加速同樣的時(shí)間，溫度越高，磁響應(yīng)越小，粒徑數(shù)據(jù)表明，溫度越高粒徑有增大趨勢(shì)，經(jīng)驗(yàn)表明，粒徑增大磁響應(yīng)會(huì)變小。包被不同的單抗磁響應(yīng)變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明磁微粒磁加速后磁響應(yīng)變化與包被抗體的性質(zhì)無(wú)明顯關(guān)系。見(jiàn)表3。

表3 包被不同單抗的磁微粒在不同溫度下磁加速3 d、7 d、10 d 后的磁響應(yīng)變化（以mAb1 為例）

數(shù)據(jù)表明，不同批次磁微粒包被抗體后，磁加速同樣的時(shí)間，溫度越高，磁響應(yīng)越小，粒徑數(shù)據(jù)表明，溫度越高粒徑有增大趨勢(shì)。不同批次磁微粒磁響應(yīng)變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明磁微粒磁加速后磁響應(yīng)變化與磁微粒的性質(zhì)無(wú)明顯關(guān)系。見(jiàn)表4。

表4 不同批次磁微粒在不同溫度下磁加速3 d、7 d、10 d后的磁響應(yīng)變化（以M8932 為例）

2.4 Zeta 電位

數(shù)據(jù)表明，磁微粒包被不同的抗體，磁加速同樣的時(shí)間，Zeta 電位變化并不明顯。包被不同單抗的磁微粒Zeta 電位變化同樣不明顯。不同批次的磁微粒Zeta 電位同樣無(wú)明顯變化，說(shuō)明磁微粒磁加速后Zeta 電位無(wú)明顯變化，與包被的抗體和磁微粒本身的性質(zhì)無(wú)明顯關(guān)系。見(jiàn)表5、表6。

表5 包被不同單抗的磁微粒在不同溫度下磁加速3 d、7 d、10 d 后的Zeta 電位變化（以mAb1 為例）

表6 不同批次磁微粒在不同溫度下磁加速3 d、7 d、10 d后的Zeta 電位變化（以M8932 為例）

3 討論

磁微粒長(zhǎng)期保存過(guò)程中會(huì)受重力的影響而在底部沉積，不同的保存溫度對(duì)磁微粒的分散性有顯著影響。從實(shí)驗(yàn)中可以得到，在37℃保存時(shí)，對(duì)磁微粒的分散性有負(fù)面影響，在4℃保存時(shí)影響小于25℃和37℃，粒徑數(shù)據(jù)證實(shí)37℃時(shí)的粒徑大于25℃和4℃，證實(shí)37℃時(shí)磁微粒凝集程度大于25℃和4℃；磁響應(yīng)方面，37℃時(shí)由于磁微粒凝集程度最大，磁響應(yīng)也是最快的，但是Zeta 電位卻沒(méi)有明顯變化趨勢(shì)。

同時(shí)，不同批次磁微粒，包被不同蛋白的磁微粒，都有同樣的趨勢(shì)，分散性與外界溫度有明顯關(guān)系。這種變化的發(fā)生，可能與溫度改變了蛋白表面的水化層有直接關(guān)系［6］。蛋白質(zhì)溶液中溫度稍高時(shí)，蛋白質(zhì)間分子間作用力增加，加速蛋白質(zhì)的凝集［7］，同時(shí)，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生輕微改變，導(dǎo)致水化層的厚度減小，不利于蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定性［8］。

綜上所述，本研究可為磁微粒試劑盒保存環(huán)境的選擇以及磁微粒凝集方面提供一定參考。