逯陣毫，楊陽，李冰，王玉堂

（鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南 鄭州 450000）

納米技術(shù)是目前最重要的現(xiàn)代科學(xué)研究之一［1］，納米粒子以其獨(dú)特的尺寸和理化性質(zhì)優(yōu)勢，使其在生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、環(huán)境工程等多個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［2］，各種納米粒子的合成和應(yīng)用收到廣泛關(guān)注。磁性納米顆粒是納米材料的一種，隨著納米生物技術(shù)的最新發(fā)展和需求，磁性納米顆粒在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力日益增大。磁性納米粒子通常分為純金屬、金屬氧化物和磁性納米復(fù)合材料，生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常用的磁性納米粒子有鈷（Co）、鐵（Fe）、鎳（Ni）、鈦（Ti）及其氧化物，其中氧化鐵磁性納米粒子（通常為Fe2O3或Fe3O4）因毒性較低而使用最多［3］，這些磁性納米微?？梢员淮艌鰴z測和操縱，從而實(shí)現(xiàn)磁成像、磁分離、藥物和基因傳遞等功能。

在體外診斷領(lǐng)域，磁性納米微粒作為固相載體可以實(shí)現(xiàn)待測物質(zhì)的快速分離，其分散性對其性能有直接的影響。例如，在儲(chǔ)存過程中如果發(fā)生凝集，磁微粒重新懸浮時(shí)無法重新分散均勻，測試結(jié)果就會(huì)表現(xiàn)出重復(fù)性較差，甚至出現(xiàn)跳孔、漏檢等異?，F(xiàn)象；導(dǎo)致磁微粒凝集的因素很多，表面Zeta 電位的改變，偶聯(lián)蛋白的性質(zhì)，保存條件發(fā)生改變等等。在磁微粒試劑盒的開發(fā)中，磁微粒的分散性是試劑盒性能的一項(xiàng)重要指標(biāo)［4］，試劑盒保存過程中，因?yàn)橹亓Φ淖饔么盼⒘３两翟谌萜鞯撞浚S時(shí)間的延長，磁微粒發(fā)生凝集的概率明顯增加，因此磁微粒的分散性加速考核就顯得極其重要。目前，研究磁微粒分散性加速考核多采取磁加速手段，具體操作為在磁微粒容器底部外加一定強(qiáng)度的磁場，根據(jù)阿倫尼烏斯經(jīng)驗(yàn)方程，采取增加溫度的方式加速考核［5］。

本文重點(diǎn)研究不同溫度下的外加磁場對磁微粒分散性的影響，同時(shí)對磁微粒的粒徑、磁響應(yīng)、Zeta 電位進(jìn)行表征，試圖找到保存溫度與磁微粒分散性之間的關(guān)系，為磁微粒長期的保存提供借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

表面羧基磁性納米微粒購自德國Merk 公司；系列小鼠單克隆抗體mAb1-mAb5 購自鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma 公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（純度分析純）購自Sigma 公司；2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）購自Sigma 公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）購自Sigma 公司；N-羥基琥珀酰亞（NHS）購自Sigma 公司。

1.2 設(shè)備

磁吸加速裝置，自制；垂直混勻器（寧波新芝生物科技有限公司，型號：HS-3）；光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯，型號：BX-43），顯微數(shù)字相機(jī)（廣州市明美光電技術(shù)有限公司，型號：MSX11）；激光粒度儀（馬爾文帕納科，型號：MX3000）；Zeta 電位儀（馬爾文帕納科，型號：ZEN3600）。隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，型號：HH-B11·360-BS-II）；星星陳列柜（星星制冷設(shè)備有限公司，型號：LSC-518Y）；Sepmag A200 磁分離器。

1.3 磁微粒-蛋白偶聯(lián)

偶聯(lián)過程采用EDC+NHS 活化磁微粒表面的羧基基團(tuán)，具體步驟如下：抽取30 μL 磁微粒原液，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）洗滌2 次，加入20 mg/mL EDC MES 緩沖液和20 mg/mL NHS MES緩沖液各50 μL，震蕩反應(yīng)1 h，去上清后加入300 μL MES 緩沖液洗滌2 次，加入10 μL IgG 溶液，震蕩反應(yīng)2 h，去上清后加入300 μL 1%BSA磷酸鹽緩沖液封閉30 min，最后用1%BSA 磷酸鹽緩沖液定容至3 mL，2～8 ℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)制備沒有包被任何蛋白的磁微粒作為對照，共制備6 種不同包被蛋白的磁微粒混懸液，用于磁加速考核。

1.4 磁吸加速

將所有磁微?；鞈乙悍殖扇M，放入磁吸加速裝置上，分別放置于4℃、25℃、37℃，放置天數(shù)3 d、7 d、10 d，磁吸加速完成后，將每瓶磁微粒混懸液置于垂直混勻器上混勻30 min，目測磁微粒分散狀態(tài)，進(jìn)行磁微粒表征。

1.5 磁性納米微粒表征

1.5.1 分散性 抽取5 μL 磁微粒混懸液制片，置于光學(xué)顯微鏡下觀測，拍照比較分散性，以磁微粒原液為對照。

1.5.2 粒徑 抽取2 mL 磁微?；鞈乙鹤鳛闃颖?，利用激光粒度儀測定粒徑，每個(gè)樣本重復(fù)三次，求平均粒徑。

1.5.3 磁響應(yīng) 抽取2 mL 磁微粒混懸液加入玻璃管中，放入Sepmag A200 測定磁響應(yīng)時(shí)間。

1.5.4 Zeta 電位 抽取1 mL 磁微粒混懸液，用1 mL 洗滌3 次，最后定容到原來體積1 mL，利用Zeta 電位儀測定Zeta 電位。

2 結(jié)果

2.1 分散性

由圖1 可見，不同包被抗體的磁微?；鞈乙涸诓煌瑴囟葪l件下磁吸加速，重懸后磁微粒的分散性有明顯差異，37℃下磁吸加速，磁珠分散性最差，25℃次之，4℃分散性最好，同一批磁微粒原液，與是否包被抗體、抗體的種類無顯著關(guān)系。包被其他單抗的磁微粒顯示出相同的趨勢。

圖1 包被不同蛋白的磁微?；鞈乙捍盼铀俸蠓稚⑿裕ㄒ詍Ab1 為例）

由圖2 可見，包被同樣蛋白不同批次原液在不同溫度條件下磁吸加速，重懸后磁微粒的分散性有明顯差異，37℃下磁吸加速，磁珠分散性最差，25℃次之，4℃分散性最好，同一批磁微粒原液，與是否包被抗體、抗體的種類無顯著關(guān)系。其他批次磁微粒表現(xiàn)出相同的趨勢。

圖2 不同批次磁微?；鞈乙捍盼铀俸蠓稚⑿裕ㄒ訫8932 為例）

2.2 粒徑

數(shù)據(jù)表明，磁微粒包被抗體后，磁加速同樣的時(shí)間，溫度越高，磁微粒粒徑越大，表明磁微粒分散性越差，與光學(xué)顯微鏡觀察到的結(jié)果一致。包被不同的單抗粒徑變化趨勢一致，未包被任何單抗的裸磁珠也表現(xiàn)出同樣的趨勢，說明磁微粒磁加速后分散程度與包被抗體的性質(zhì)無明顯關(guān)系。見表1。

表1 包被不同單抗的磁微粒在不同溫度下磁加速3 d、7 d、10 d 后的粒徑變化（以mAb1 為例）

數(shù)據(jù)表明，不同批次磁微粒包被抗體后，磁加速同樣的時(shí)間，溫度越高，磁微粒粒徑越大，表明磁微粒分散性越差，與光學(xué)顯微鏡觀察到的結(jié)果一致，不同批次的磁微粒粒徑變化趨勢一致，說明磁加速后的分散程度與磁微粒批次無明顯關(guān)系。見表2。

表2 不同批次磁微粒在不同溫度下磁加速3 d、7 d、10 d后的粒徑變化（以M8932 為例）

以上數(shù)據(jù)均表明，磁加速分散程度與包被抗體、磁微粒批次無明顯關(guān)系，與外加磁場時(shí)的溫度有明顯關(guān)系，溫度越高，磁加速后的分散性越差。

2.3 磁響應(yīng)

數(shù)據(jù)表明，磁微粒包被抗體后，磁加速同樣的時(shí)間，溫度越高，磁響應(yīng)越小，粒徑數(shù)據(jù)表明，溫度越高粒徑有增大趨勢，經(jīng)驗(yàn)表明，粒徑增大磁響應(yīng)會(huì)變小。包被不同的單抗磁響應(yīng)變化趨勢一致，說明磁微粒磁加速后磁響應(yīng)變化與包被抗體的性質(zhì)無明顯關(guān)系。見表3。

表3 包被不同單抗的磁微粒在不同溫度下磁加速3 d、7 d、10 d 后的磁響應(yīng)變化（以mAb1 為例）

數(shù)據(jù)表明，不同批次磁微粒包被抗體后，磁加速同樣的時(shí)間，溫度越高，磁響應(yīng)越小，粒徑數(shù)據(jù)表明，溫度越高粒徑有增大趨勢。不同批次磁微粒磁響應(yīng)變化趨勢一致，說明磁微粒磁加速后磁響應(yīng)變化與磁微粒的性質(zhì)無明顯關(guān)系。見表4。

表4 不同批次磁微粒在不同溫度下磁加速3 d、7 d、10 d后的磁響應(yīng)變化（以M8932 為例）

2.4 Zeta 電位

數(shù)據(jù)表明，磁微粒包被不同的抗體，磁加速同樣的時(shí)間，Zeta 電位變化并不明顯。包被不同單抗的磁微粒Zeta 電位變化同樣不明顯。不同批次的磁微粒Zeta 電位同樣無明顯變化，說明磁微粒磁加速后Zeta 電位無明顯變化，與包被的抗體和磁微粒本身的性質(zhì)無明顯關(guān)系。見表5、表6。

表5 包被不同單抗的磁微粒在不同溫度下磁加速3 d、7 d、10 d 后的Zeta 電位變化（以mAb1 為例）

表6 不同批次磁微粒在不同溫度下磁加速3 d、7 d、10 d后的Zeta 電位變化（以M8932 為例）

3 討論

磁微粒長期保存過程中會(huì)受重力的影響而在底部沉積，不同的保存溫度對磁微粒的分散性有顯著影響。從實(shí)驗(yàn)中可以得到，在37℃保存時(shí)，對磁微粒的分散性有負(fù)面影響，在4℃保存時(shí)影響小于25℃和37℃，粒徑數(shù)據(jù)證實(shí)37℃時(shí)的粒徑大于25℃和4℃，證實(shí)37℃時(shí)磁微粒凝集程度大于25℃和4℃；磁響應(yīng)方面，37℃時(shí)由于磁微粒凝集程度最大，磁響應(yīng)也是最快的，但是Zeta 電位卻沒有明顯變化趨勢。

同時(shí)，不同批次磁微粒，包被不同蛋白的磁微粒，都有同樣的趨勢，分散性與外界溫度有明顯關(guān)系。這種變化的發(fā)生，可能與溫度改變了蛋白表面的水化層有直接關(guān)系［6］。蛋白質(zhì)溶液中溫度稍高時(shí)，蛋白質(zhì)間分子間作用力增加，加速蛋白質(zhì)的凝集［7］，同時(shí)，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生輕微改變，導(dǎo)致水化層的厚度減小，不利于蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定性［8］。

綜上所述，本研究可為磁微粒試劑盒保存環(huán)境的選擇以及磁微粒凝集方面提供一定參考。