靜亮， 彭希， 張友平， 李大勇， 石迎花， 祝偉

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 1.急診-重癥醫(yī)學(xué)科，2.神經(jīng)內(nèi)科，湖北省武漢市 430000)

膿毒癥是病原體感染導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征，患者入院病情往往比較緊急，病程進(jìn)展迅速且病死率高[1]，其臨床特征是原發(fā)感染部位與病原體類型多樣化，重癥患者更容易出現(xiàn)繼發(fā)感染、多器官功能障礙或者衰竭，多重耐藥菌感染風(fēng)險(xiǎn)大，臨床早期診治難度較大。

宏基因組學(xué)下一代測序(metagenomics next generation sequencing，mNGS)檢測病原體快速，敏感性高[2]，本研究就mNGS在膿毒癥患者病原體檢測和抗生素應(yīng)用中的臨床經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行報(bào)道。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

采用臨床前瞻性橫斷面觀察，選擇2020年7月—2021年9月本院光谷院區(qū)重癥監(jiān)護(hù)室首次確診膿毒癥患者52例為研究對象，其中男32例，女20例，年齡35～78歲，平均(55.6±12.3)歲，入院急性生理與慢性健康評分13～33分，平均(20.3±6.4)分，序貫性器官功能衰竭評分2～5分，平均(2.9±0.5)分；原發(fā)感染灶位于肺部27例，胃腸道9例，泌尿系統(tǒng)10例，血液3例，其他3例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡大于18歲；②符合膿毒癥第三次國際共識(Sepsis-3.0)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院前已經(jīng)接受抗生素治療；②合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病、抗生素過敏；③采集標(biāo)本不合格，影響檢測結(jié)果。本研究有醫(yī)學(xué)倫理編號和患者知情同意書。

1.2 傳統(tǒng)技術(shù)和mNGS檢測病原體

所有患者入院24 h內(nèi)完成血液、尿液、痰液或者肺泡灌洗液等樣本收集，分別采用傳統(tǒng)技術(shù)(細(xì)菌培養(yǎng)和免疫學(xué)方法)和mNGS進(jìn)行病原體檢測，根據(jù)檢測技術(shù)的要求對標(biāo)本進(jìn)行處理，mNGS由本院實(shí)驗(yàn)室專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行操作。mNGS主要流程包括樣本采集、樣本處理與文庫構(gòu)建、基因測序、生信分析和報(bào)告解讀5個(gè)步驟，均按照操作規(guī)范進(jìn)行[4]。根據(jù)病原體檢測結(jié)果結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)綜合評估選擇恰當(dāng)?shù)目股刂委煟渲袕V譜抗生素首選亞胺培南和利奈唑胺，治療3～7天效果不理想者應(yīng)根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和藥敏結(jié)果選擇更高效的抗生素。針對性更強(qiáng)的高效抗生素首選Ⅲ代頭孢菌素、β內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類，根據(jù)病原菌種類和藥敏實(shí)驗(yàn)進(jìn)行選擇。

1.3 觀察指標(biāo)

比較不同檢測方法診斷病原體的時(shí)間、識別率、準(zhǔn)確率、病原體類型和抗生素選擇類型。以多次復(fù)檢細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果為診斷病原體的標(biāo)準(zhǔn)判斷傳統(tǒng)技術(shù)與mNGS病原體的識別率和準(zhǔn)確率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 診斷病原體時(shí)間的比較

mNGS法診斷病原體的時(shí)間為(50.5±5.6) h，傳統(tǒng)法診斷病原體的時(shí)間為(88.9±10.2) h，mNGS組比傳統(tǒng)組明顯縮短(P<0.05)。

2.2 病原體識別率和準(zhǔn)確率的比較

病原體識別率和準(zhǔn)確率mNGS法高于傳統(tǒng)法(P<0.05；表1)。

表1 兩種病原體檢測方法識別率和準(zhǔn)確率的比較 單位：例(%)

2.3 病原體類型的比較

兩種方法檢測病原體類型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；表2)。

2.4 抗生素應(yīng)用的比較

根據(jù)傳統(tǒng)法建議首次采用廣譜抗生素，臨床應(yīng)用以亞胺培南和利奈唑胺居多；而根據(jù)mNGS法則推薦使用針對性更強(qiáng)的高效抗生素，臨床應(yīng)用以Ⅲ代頭孢菌素、β內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類居多。mNGS法與傳統(tǒng)法抗生素應(yīng)用差異有顯著性(P<0.05；表3)。

表2 兩種方法檢測病原體類型的比較 單位：例(%)

表3 兩種檢測方法對抗生素應(yīng)用的比較 單位：例(%)

3 討 論

膿毒癥早期快速、準(zhǔn)確識別確定病原體類型，并選擇高效、針對性的抗生素進(jìn)行治療是目前臨床面對的主要難題。針對膿毒癥患者，本研究比較了mNGS與傳統(tǒng)技術(shù)在病原體檢測和抗生素應(yīng)用的區(qū)別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mNGS法診斷病原體的時(shí)間比傳統(tǒng)法明顯縮短，識別率提高，準(zhǔn)確率提高。mNGS的優(yōu)點(diǎn)是無需培養(yǎng)，無需預(yù)設(shè)，無偏好性，靶標(biāo)范圍廣泛，直接提取臨床樣本中的DNA或者RNA進(jìn)行高通量測序，經(jīng)過專用病原數(shù)據(jù)庫比對與生信分析，一次性完成細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等病原體的檢測；陽性率高，受抗生素影響相對低，檢測周期適中(平均48 h)；可用于新發(fā)或罕見病原體檢測與藥物敏感性預(yù)測[5-7]。同樣也有一定不足，如需要專業(yè)人士參與；難辨別死菌與活菌，難區(qū)分定植與感染，報(bào)告解讀具有挑戰(zhàn)性[8-9]。因此，mNGS在臨床中普及還需要一定時(shí)間。

mNGS聯(lián)合傳統(tǒng)檢測能夠提高血流感染的病原體檢出率[10]。mNGS可提高細(xì)菌/真菌/病毒的整體陽性率，mNGS與血培養(yǎng)和其他方法聯(lián)合可以顯著提高病原體檢出率，超過85%在收樣第二天得到結(jié)果[11]。mNGS可輔助感染早期診斷，提高28天與90天的生存率[12]。目前，多部指南和共識均推薦，mNGS作為多系統(tǒng)感染、急危重癥、以及疑難病的病原學(xué)診斷優(yōu)選方法[13-14]。主要適用范圍包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、血液感染、局灶性感染和呼吸道感染。對細(xì)菌、真菌等不明病原體感染進(jìn)行診斷時(shí)，mNGS可進(jìn)行DNA二代測序和RNA檢測。

本研究mNGS對指導(dǎo)選擇更高效的抗生素，降低耐藥菌的產(chǎn)生具有重要意義。mNGS報(bào)告結(jié)果解讀原則[15]：剔除假陽性病原體信息，將樣本中含有病原體核酸信息真實(shí)呈現(xiàn)給臨床；報(bào)告病原體信息準(zhǔn)確到種信息，同時(shí)應(yīng)包含相應(yīng)的屬信息；將高度致病可能性、呼吸道、皮膚、腸道等常見及低致病性病原體單獨(dú)呈現(xiàn)；對出現(xiàn)的所有病原體引用權(quán)威文獻(xiàn)注釋。

綜上所述，膿毒癥患者采用mNGS法能夠進(jìn)一步縮短病原體檢測時(shí)間，提高病原體識別率和準(zhǔn)確率，對選擇更恰當(dāng)?shù)目股刂委熅哂惺种匾呐R床意義。